AL-PT-08

ANALISIS DE LABORATORIO CODIGO

01
PROTOCOLO PARA LA DETECCION Y VERSION
LABORATORIO SAMUEL
RECUENTO DE Escherichia coli Y
BACTERIAS COLIFORMES . 19-11-2019
FECHA:

PROTOCOLO PARA LA DETECCION

Y RECUENTO DE Escherichia coli Y
BACTERIAS COLIFORMES EN AGUA
EMBOTELLADAS

Basado en los requisitos de la NTC-ISO/IEC 17025:2017.

FECHA DE ELABORACION FECHA DE REVISION FECHA DE APROBACION

2019-10-20 2019-11-05 2019-11-19
NOMBRE: NOMBRE: NOMBRE:
Lina Marcela Meza Acosta Loraine Rojas Maestre Tania David Venegas

CARGO: CARGO: CARGO:

Analista de laboratorio Líder de laboratorio Dirección general

Cra 28 N° 4ª 43 - Tel: 5702323

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1. OBJETIVO

Describir el protocolo de la detección y recuento de Escherichia coli y

bacterias coliformes, mediante el método filtración por membrana
establecido por la NTC 4772:2008,en el análisis microbiológico de agua
embotelladas en el LABORATORIO SAMUEL sede Valledupar .

2. ALCANCE

El procedimiento de detección y recuento de Escherichia coli y bacterias

coliformes, aplica para todas las aguas embotelladas para el análisis
microbiológico, bajo el método filtración por membrana establecido por la
NTC 4772: que son recepcionadas y analizadas en el LABORATORIO
SAMUEL.

3. REFERENCIAS NORMATIVA

NTC-ISO/IEC 17025:2017 Requisitos Generales para la Competencia en la

Realización de Ensayos y/o de Calibraciones.

NTC 4772:2008 Calidad del agua. Detección y recuento de Escherichia coli

y bacterias coliformes. Parte 1: Método de filtración por membrana.

VIM JCGM 200:2012 Vocabulario internacional de metrología y conceptos

fundamentales y generales, términos y asociados (VIM).

4. RESPONSABLES

El analista autorizado es el responsable de realizar el ensayo de

laboratorio, registra las condiciones ambientales, y verifica los equipos
antes de su uso.
El líder de laboratorio es el encargado de hacer la verificación, generar
cumplimiento de este protocolo, y de las verificaciones intermedias de los
equipos.

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La dirección general es la encargada de aprobar este protocolo, autoriza el

uso de este documento y revisa que sea la última versión.

5. TERMINOS Y DEFINICIONES

Escherichia coli : Es una  bacteria anaerobia facultativa comensal más

abundante de la microbiota del tracto gastrointestinal, Es un bacilo
gramnegativo, no exigente, oxidasa negativo, catalasa positivo, anaerobio
facultativo, cuya temperatura de crecimiento preferentemente es 37 °C
(mesotermo), fimbriado y comúnmente es móvil por flagelos perítricos.

Bacterias coliformes: Es un grupo de especies bacterianas que tienen

ciertas características bioquímicas en común e importancia relevante
como indicadores  de contaminación del agua y los alimentos.

Detección : Método para conocer si hay presencia o ausencia de un

microorganismo.

Ítem de ensayo : parte o porción de la población a estudiar, la cual sirve

para representarla y conocer la calidad de la misma. Dentro del laboratorio
se denomina muestra al material entregado por el cliente para la ejecución
de un análisis.

Agua : Es una sustancia cuyas moléculas están compuestas por un átomo

de oxígeno y dos átomos de hidrógeno.

6. DESCRIPCION
6.1 Generalidades
Es una bacteria  miembro de la familia de las enterobacterias  y forma
parte de la microbiota del tracto gastrointestinal de
animales homeotermos, como por ejemplo el ser humano. Es
un bacilo gramnegativo, no exigente, oxidasa negativo, catalasa
positivo, anaerobio facultativo, cuya temperatura de crecimiento
preferentemente es 37 °C (mesotermo), fimbriado y comúnmente es
móvil por flagelos  perítricos.
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6.1.1 Fundamento
Este método está basado en la filtración por membrana y comprende
dos partes , el ensayo estándar de referencia y el ensayo rápido
opcional, que pueden llevarse a cabo. El ensayo estándar consiste en
la incubación de la membrana en un medio selectivo seguida de una
caracterización bioquímica de las colonias, lo que conduce a la
detección y recuento de las bacterias coliformes y E.coli en un periodo
de 2 a 3 días. El ensayo rápido estándar consiste en dos etapas de
incubación que permiten la detección y recuento de E.coli en (21 +3 )h.

6.2. Medios de Cultivo y Reactivos

 Agar VRB ( Violeta cristal - Rojo neutro – Bilis lactosa ).

 Agar EMB ( Eosina- Azul de Metileno ).
 IMVIC ( Indol- Rojo de metilo- Voges Proskauer–Citrato ) .

6.2.1 Materiales Y Equipos

 Probeta de 250 mL estériles
 Filtros de membrana de 0,47 mm
 Pinzas estériles
 Tubos colectores estériles
 Equipo de filtración
6.3. CEPA DE REFERENCIA
 Escherichia coli ATTC 25922
 Bacterias coliformes
6.4. METODOLOGIA
6.4.1. Preparación de la muestra.

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Para la preparación de la muestra, la filtración y la siembra sobre los medios de

aislamiento deben seguirse las siguientes instrucciones. Es preferible iniciar el
proceso de la muestra inmediatamente después de su toma . Si las muestras
conservan su temperatura ambiente ( en la oscuridad, sin sobrepasar los 25 °C ).
Su análisis debe comenzar antes de que hayan transcurrido 6 h desde el momento

de la toma de muestras. Las muestra debe conservarse a una temperatura de 5 ±3

°C durante un periodo máximo de 24 h antes de su análisis.El volumen en caso de
aguas embotelladas es de 250 mL.

6.4.2. Filtración.
 Se miden 250 mL del agua embotellada en una probeta estéril de 250 ml
para obtener un volumen adecuado .

Fuente : Meza , L. Lab 7 2019.

 Luego se prepara el equipo de filtración colocando los tubos colectores
estériles en cada embudo correspondiente.

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Fuente : Meza , L. Lab 7 2019

Nota : Asegúrese que los tubos colectores queden bien fijados y sujetados para que al momento
de encender la bomba no tengan ningún inconveniente .

 Luego En el equipo de filtración se procede a colocar el filtro de membrana

de 0,47 mm en la cuadricula de la parte superior, asegurándose que quede
en todo el centro de la cuadricula.
 Luego de tener fijados los filtros de membrana se transfieren los 250 mL
de la muestra a estudiar a los tubos colectores .

 Luego de que estén fijados los filtros

Fuente : Rojas,de
M.membrana
Lab 7 2019 y los tubos colectores
con la muestra se procede a encender la bomba para que inicie el proceso
de filtración .

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Nota : Inmediatamente que se prenda la bomba abrir con mucho cuidado cada llave de los
embudos para que se filtre de manera correcta la muestra a estudiar.

 Luego de filtrar la muestra con la ayuda de una pinza estéril se colocan los
filtros de membrana de 0,47 mm en el agar VRB .

6.4.3 Incubación

 Después del proceso de filtración se lleva a incubar tres medio

cultivo VRB a 37 °C y dos a 42 °C durante 24 horas – 48 horas .

Fuente Meza , L. Lab 7 2019 .

Fuente Rojas, L. Lab 7 2019 .

 Luego de las 24 horas se procede a observar la presencia o
ausencia de Escherichia coli y Bacterias Coliformes en las cajas de
Agar .

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 En caso de tener presencia de Escherichia coli se hace una

confirmación con pruebas bioquímicas en los medio de cultivo de
IMViC ( Indol, Rojo de metilo, Voges Proskauer y Citrato ).

6.4.4 Recuento .
Para determinar el recuento de colonias sobre los filtros de membrana, se
utiliza el equipo de contador de colonias o un dispositivo óptico con fuente
de luz blanca que proporcione una visión optima que no produzca reflejo .
 Las colonias típica de coliformes puede verse rosadas hasta un rojo oscuro
con brillo metálico .Se deben contar tanto las colonias típicas como la
atípicas .
 Las colonias coliformes atípicas puede presentar un color rojo oscuro,
mucoide o nucleada sin presentar brillo metálico .
6.4.5 Cálculos
 Se computa el recuento utilizando cultivos que presenten crecimiento entre
20 y 80 colonias coliformes y no más de 200 colonias de todo tipo por
membrana, mediante la siguiente ecuación :
Coliformes (Totales) 100 ml = colonias coliformes contadas x 250 / mL de muestra filtrada

 Si no se observan colonias coliformes , reporte las colonias coliformes

Negativas como :
“< 1 coliformes /250 mL ”.

6.4.6. Resultados .
En los medios de cultivo VRB el recuento fue negativo :

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“< 1 coliformes /250 mL ”.

Ausencia de Escherichia coli

y Bacterias coliformes .

 Lo que nos garantiza como laboratorio que el agua embotellada a la fue

examinada se encuentra en condiciones óptimas para el consumo.

7. REGISTROS

AL-F -01 Uso de equipos.

AL-F-02 Informe de resultados.

8. ANEXOS
Flujograma de metodología

N° FLUJOGRAMA REGISTRO

Numeración de cada uno

de los pasos de la INICIO
descripción

6.4
METODOLOGIA

6.4.1 PREPARACION DE LA AL-F-01

MUESTRA

FILTRACION AL-F-01

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6.4.2

6.4.3 INCUABCION AL-F-01

6.4.4 RECUENTO Y AL-F-02

6.4.5 CALCULOS

AL-F-02
6.4.6 RESULTADOS

FIN

9. CONTROL DE CAMBIOS

FECHA DE
VERSIÓN RESUMEN DE CAMBIOS
APROBACIÓN

0 05/11/2019 Versión de revisión

Corrección de código,
1 12/11/2019 control de página, registros y
resultados

2 19/11/2019 Revisión y aprobación del

documento

Revisó: Aprobó:

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DOCUMENTO ORIGINAL
LORAINE ROJAS MAESTRE TANIA DAVID VENEGAS
Líder de laboratorio Dirección General

- - - - - - - - - - - - FIN DEL DOCUMENTO - - - - - - - - - - - -

ANEXO A
( Informativo )

Las bacterias coliformes son bacterias Gran negativas, no formadoras de

esporas, oxidasa negativas y con forma de bastoncilo, que pueden crecer
en medio aerobio y anaerobio facultativo en presencia de sales biliares
( u otros agentes de superficies con propiedades inhibidoras del
crecimiento similares ) y que , normalmente , son capaces de fermentar
lactosa con producción de ácido y aldehído en 48 h cuando se incuban a
una temperatura de (36 +-/ 2 °C ) las bacterias coliformes poseen la
enzima B-Galactosidasa.
Las bacterias Escherichia coli son bacterias coliformes capaces de
producir indol a partir de triptófano, en ( 21 +-/ 3 ) h a ( 44,0 +-/ 0,5 ) °C
.También poseen la enzima B-Galactosidasa, reaccionan positivamente
en el ensayo del rojo de metilo y pueden descarboxilar el ácido L-
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Glutámico, pero no son capaces de producir acetil metil carbinol , de
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de carbono o de crecer en un caldo de cultivo
como cloruro de potasio (KCN). Página 11 de
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ANEXO B
(COMPOSICION DE MEDIOS DE CULTIVO)

 AGAR VRB

Extracto de levadura 3,0 g

Mezcla de sales biliares 1,5 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Cristal violeta 0.002 g
PH 7.4 +/ 0.2 a 25 °C
Peptona de gelatina 7.0 g
Lactosa 10.0 g
Rojo neutro 0.03 g
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Agar bacteriológico 15.0 g

 AGAR EMB

Digerido pancreático de gelatina 10.0 g

Lactosa 5,0 g
Sacarosa 5,0 g
Fosfato dipotasico 2,0 g
Agar 13,5 g
Eosina 0.4 g
Azul de metileno 0,065 g
Ph 7,2 +/- 0,2

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