FQB 145 – Bioquímica Carrera Biología

Lab 2: Propiedades de los aminoácidos

PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS: IONIZACIÓN Y CURVAS DE TITULACIÓN

1. INTRODUCCIÓN
Los aminoácidos funcionan como ácidos débiles y pueden amortiguar los cambios bruscos de pH en una solución acuosa.
Esto se debe al carácter ácido (donadores de protones) y básico (aceptores de protones) que poseen. La capacidad
amortiguadora (buffer) de los aminoácidos puede ser analizada empleando curvas de titulación.

Las curvas de titulación se obtienen al variar el pH añadiendo un ácido o una base a la solución. Generalmente, el resultado
de esta curva de titulación se expresa gráficamente como la variación de pH en función al volumen de titulante añadido (Ej.
HCl o NaOH) o de forma más adecuada, en función del número de equivalentes añadidos por mol de muestra.

En el caso de la titulación de aminoácidos, la curva de titulación entrega la

siguiente información: 1) número de grupos susceptibles a ionización; 2)
el pKa de los grupos ionizados; 3) Punto isoeléctrico (pI) 4) las regiones
de amortiguación (buffer).

Para aprender cómo se realiza la titulación y cómo se analizan los datos,

veremos como ejemplo la titulación del aminoácido Glicina. El
experimento se realiza en dos pasos: primero titulando 10mL de una
solución de glicina 0.2 mol/L con una solución 0.1 mol/L de NaOH y
posteriormente, titulando otros 10 mL de una solución de glicina 0.2
mol/L con una solución 0.1 mol/L de HCl. La combinación de los
resultados de ambos procedimientos se muestra a la derecha. Por debajo
del gráfico se encuentra una tabla con una comparación de las
concentraciones de las especies ionizadas de la Glicina a lo largo de la
curva..

Al comenzar las mediciones (0 mL de NaOH/HCl), la Glicina se

encuentra en la solución a un pH 6 y con la estructura +NH3CH2COO−,
que corresponde al zwitterion (dipolar). Aquí, cualquier incremento de
OH- o H+ resultará en un brusco incremento en el pH de la solución.

Al agregar NaOH, la ecuación de la reacción se mueve a la derecha, removiendo H + del -NH3+ y formando agua:
+
NH3CH2COO− + NaOH→NH2CH2COO- Na++ H2O (Ec. 1)
Cuando se ha agregado 1 equivalente de NaOH, todo el zwiterion +NH3CH2COO− ha sido convertido al anión
NH2CH2COO-. Aquí, la palabra equivalente significa la cantidad de NaOH requerida para neutralizar completamente el
+
NH3CH2COO− hacia una sal y agua (Ec. 1). En el ejemplo, 20mL de NaOH 0.1 mol/L corresponden a 1 equivalente de
10mL de Glicina 0.2 mol/L. En tanto que, 10mL de NaOH 0.1mol/L corresponden a ½ equivalente. Recuerde que cuando la
cantidad de un ácido (aquí +NH3CH2COO− ) y de una base (aquí NH2CH2COO-) son iguales, según la
ecuación de Henderson-Hasselbalch (ver ecuación izquierda), el pH=pKa, ya que el término
logarítmico será igual a cero. Es decir a determinado pH es posible estimar directamente el valor de
pKa. En el ejemplo de la Glicina, el valor de pKa para el -NH 3+, puede ser estimado de la gráfica observando el valor de pH
que corresponde al agregar 10mL (0.5 equivalentes) de NaOH. En algunos libros, se asume que el pKa se encuentra en el
punto de inflexión de la curva. Sin embargo, experimentalmente es difícil determinar con exactitud el punto de inflexión de
una curva, y podría o no corresponder al punto de equivalencia media (0.5 equivalentes en el ejemplo). Por lo tanto, para
determinar el pKa, el análisis minucioso del gráfico debe acompañarse de una aproximación matemática, es decir buscar los
puntos de media equivalencia y determinar el valor de pH.

El análisis descrito arriba es también aplicable a la titulación con HCl, aunque en el ejemplo de la glicina la reacción sería:
NH3+CH2COO- + HCl→ NH3(Cl)CH2COOH (Ec. 2)

La Glicina tiene sólo dos grupos ionizables (diprótico): el grupo amino NH 2 unido al carbono alfa, y el grupo carboxilo unido

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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a este mismo carbono. Otros aminoácidos contienen un tercer grupo capaz de ionizarse (tripróticos), el grupo R. La siguiente
tabla contiene una lista de los aminoácidos indicando el pKa de sus grupos ionizables y de la cadena lateral.

El punto isoelectrico (pH isoeléctrico, pI)

corresponde al pH donde el aminoácido
tiene carga cero. Para un aminoácido
diprótico el pI se encontrara justo en
medio de los dos valores de pKa. Para un
aminoácido triprótico, se ubicará en
medio de los dos valores de pKa que
rodean inmediatamente a la estructura
con carga neta cero, es decir, [(pKa1 +
pKa2)/2]

Si analizamos las propiedades de la

Glicina, según la ecuación de Henderson-
Hasselbach habrá un límite de
amortiguación para determinado pKa.
Esto ocurrirá cuando la proporción de
[A-]/[HA] sea de 10:1 o 1:10, lo que
generará un valor de ±1. Por lo tanto, el
rango de amortiguación de un
aminoácido como la Glicina se encuentra
±1 unidades de pH de un determinado
pKa

En este laboratorio, usted determinará los valores de pKa más aproximados para dos muestras problemas que se le entregará.
Para lograr esto, debe titular las muestras, generar los gráficos correspondientes y realizar los cálculos necesarios para
estimar los valores de pKa, pI, y la variación de las proporciones [A -]/[HA].

2. MATERIALES
pHímetro Solución de aminoácido_2 0.1M
Buretas de 25 o 50 mL Agua destilada
Vasos de precipitados de 50 mL (2) Los estudiantes deben traer:
Pipetas de 10 mL Papel desechable suave (Kleenex)
Solución HCl 0.5 M Esponja
Solución NaOH 0.5 M Detergente de vajilla
Solución de aminoácido_1 0.1 M Papel de cocina (1 x curso)

3. PROCEDIMIENTO:
CUALQUIER CONTAMINACIÓN EN LOS INSTRUMENTOS DE VIDRIO PUEDE MODIFICAR EL PH DE LA SOLUCIÓN DE AMINOÁCIDOS.
POR LO TANTO, ANTES DE COMENZAR, LAVE EXHAUSTIVAMENTE SU MATERIAL Y ENJUÁGUELO POR LOS MENOS 3 VECES CON AGUA
DESTILADA.
1. Calibrar el pHímetro. Recuerde lavar con abundante agua destilada el electrodo y secar el exceso con un papel suave.
2. Colocar 10 mL del aminoácido problema un vaso de precipitado. Agitar y resgistrar el pH inicial de la solución.
3. Llenar la bureta con la solución de hidróxido de sodio (NaOH) y colocarla encima del vaso de precipitado.
4. Agregar 0.5 mL de solución de hidróxido de sodio a la solución de aminoácido. Agitar suavemente el vaso de
precipitados y medir el nuevo valor de pH. Continuar agregando NaOH de 0.5 mL en 0.5 mL. Cuando note que el pH
no varía, agregue el NaOH en volúmenes de 1mL. Realice este análisis hasta alcanzar un pH 12.
5. Retirar el electrodo del vaso de precipitados y enjuagarlo con agua destilada. Descartar el contenido del vaso de
precipitados y lavarlo.
6. Colocar 10 mL del mismo aminoácido problema un vaso de precipitado. Agitar y resgistrar el pH inicial de la solución.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA

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7. Llenar la bureta con la solución de ácido clorhídrico (HCl) y colocarla encima del vaso de precipitado.
8. Agregar 0.5 mL de solución de HCl a la solución de aminoácido. Agitar suavemente el vaso de precipitados y medir el
nuevo valor de pH. Continuar agregando HCl de 0.5 mL en 0.5 mL. Cuando note que el pH no varía, agregue el HCl en
volúmenes de 1mL. Realice este análisis hasta alcanzar un pH 1.
9. Realizar el mismo procedimiento para el otro aminoácido (pasos 1 al 8)
10. Utilice un computador y realice los gráficos correspondientes a los datos obtenidos. En la gráfica incluir el volumen de
titulante utilizado así como los equivalentes correspondientes a ese volumen. A partir de la gráfica, determinar los
valores de pKa de los aminoácidos correspondientes y calcular el pI.
11. De acuerdo a los valores pKa haga una lista de los posibles aminoácidos que corresponden a sus muestras problema.
12. Para cada aminoácido problema, seleccione un aminoácido de la lista que generó e incluya las estructuras de ionización
a lo largo de la curva.
13. De acuerdo a la ecuación de Henderson-Hasselbalch calcule las proporciones [A-]/[HA] en diferentes puntos de la
curva.

4. CUESTIONARIO
1. Utilice la tabla de aminoácidos que se encuentra más arriba y seleccione un aminoácido que utilizaría para preparar un
buffer que amortigüe al rededor de un pH 7 cuando se vaya agregando NaOH.
2. Para el aminoácido Aspartato: a) Dibuje la estructura y asigne los valores pKa correspondientes a cada uno de sus grupos
ionizables. b) Realice un gráfico aproximado de la curva de titulación para este aminoácido c) Realice una tabla para y
determine las cargas de los grupos ionizables a pH 2, 5, 7, 10 y 13. d) Determine la carga neta del aminoácido a los mismos
valores de pH que el inciso anterior e) Calcule el pI del aminoácido.
3. Asumiendo que los valores pK para los grupos ionizables de un péptido son los mismos que para los aminoácidos libres a)
Dibuje la estructura del péptido Ala-Lys y asigne los valores de pKa correspondientes a cada uno de los grupos ionizables b)
Realice un gráfico aproximado de la curva de titulación para este péptido c) Realice una tabla para y determine las cargas de
los grupos ionizables a pH 2, 5, 7, 10 y 13. d) Determine la carga neta del aminoácido a los mismos valores de pH que el
inciso anterior e) Calcule el pI del aminoácido f) Realice el mismo análisis (incisos a→d) para el péptido Ser-Asp-Glu.
4. a) Calcule el porcentaje de cadena lateral protonada de la histidina a un pH 7.2. b) Calcule el porcentaje de cadena lateral
desprotonada para la cisteína a un pH 7.6.
5. Repase los cálculos necesarios para preparar soluciones y buffers.

Elaborado por: Dr. Sergio Gutiérrez Cortez IBMB - UMSA