inciones

Introducción
Dado el pequeño tamaño de los microorganismos, su observación en el laboratorio
se hace a través de microscopia. par el diagnóstico microbiológico se suele utilizar
varios tipos de microscopios.
para visualizar e identificar bacterias de una forma adecuada, se utiliza por lo
general el aumento de 1000x (objetivo de inmersión) con aceite de inmersión.
existen varias modalidades de tinción en función de los colorantes empleados y
las estructuras teñidas, pueden ser simples,diferenciales,específicas y
fluorescentes.
A. Tinciones simples incluyen a aquellas tinciones que utilizan en función un
solo colorante y normalmente se aplican a preparaciones en fresco (se
añadiría el colorante a la muestra justo antes de colocar el cubreobjetos).

Tinción china: En este caso la tinta oscurece el fondo y permite el contraste con la
célula no teñida.
B. Tinciones diferenciales son aquellas que se utilizan varios colorantes y
ponen de manifiesto estructuras o microorganismos que tiene características
diferentes.

Tinción de gram: utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Los principios de la
tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las
bacterias. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por
una capa fina de peptidoglucano y una membrana celular externa, mientras que
las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la
composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las
bacterias Gram negativas y Gram positivas explica y determina las características
tintoriales. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal
violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida
del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta yodo que satura
los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. se coloca safranina, la cual
funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las
bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias
Gram positivas se observan de color azul oscuro a morado, mientras que las Gram
negativas se observan de color rosa a rojo.

tincion Ziehl-Neelsen
Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son
capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son.La
tinción se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la preparación ligeramente
para solubilizar las ceras, lípidos y otros ácidos grasos de la pared celular para
que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una enorme afinidad por los
ácidos micólicos presentes en la pared. Al enfriar con agua, los componentes de la
pared vuelven a solidificar, resistiendo la acción abrasiva del alcohol-ácido, y el
azul de metileno se utiliza como contratinción. Una tinción positiva es aquélla en la
que se observan bacilos ácido-alcohol resistentes, los cuales son de color rojo
fucsia.

C. Tinciones específicas son aquellas que ponen de manifiesto estructuras

específicas de la célula como gránulos de reserva, flagelos, esporas, etc.

Tincion Shaeffer- Ffulton

Esta tinción emplea verde malaquita como colorante primario, el cual es eliminado
posteriormente del resto de la célula bacteriana, pero no de la endospora,
mediante un enjuague con agua. Como contratinción se emplea safranina, la cual
tiñe la célula vegetativa.

 Shaeffer-Fulton

Se identificaron como esporas bacterianas a los puntos color verde esmeralda en

la tinción, esto se debe a que el colorante verde malaquita tiñe todas la células
presentes en la muestra, sin embargo, sólo prevalece esta coloración en esporas
después del enjuague, esto debe a las características de su envoltura esporádica.
Posteriormente al agregar safranina el cual es un colorante básico con afinidad
hacia la membrana celular se observan bacilos teñidos de color rosa lo cual indica
que se encontraban en su forma vegetativa al momento de la tinción.
Adicionalmente se logra apreciar esporas de mayor tamaño las cuales dan la
impresión de haber ocasionado ruptura de la membrana celular, sin embargo, esto
no es correcto, ya que se trata de una espora deformante terminal. la cual debido
a su gran tamaño y a su coloración no permite la observación de la membrana
celular que la rodea, por lo que de primera instancia se podría llegar a esta
conclusión

 Ziehl-Neelsen
Pruebas primarias
Esta tinción permite diferenciar a las bacterias en dos grupos aquellos que son
capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que no lo son. Es
una tinción diferencial que permite la identificación de micobacterias, aunque no
permite la diferenciación de distintas especies. Se utilizó fucsina y se calentó la
preparación hasta producir vapores para solubilizar las ceras, lípidos y otros
ácidos grasos de la pared celular y así permitir el paso libre del colorante, el cual
tiene afinidad por los ácidos micólicos presentes en la pared de las bacterias. Al
enfriar con agua, los componentes de la pared se vuelven a solidificar, resistiendo
la acción del alcohol-ácido, y finalmente se tiñe con azul de metileno como
contratinción. Se observaron pocos bacilos teñidos de rosa, lo cual nos indica que
se trataba de microorganismos ácido-alcohol resistentes.

Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoría
de las bacterias. Son pruebas sencillas que ponen de manifiesto una característica
bioquímica, como la presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática,
grupo de enzimas o vía metabólica, crecimiento a una temperatura dada, crecimiento en
presencia de inhibidores, etc.
Las pruebas bioquímicas primarias son las siguientes:

 Tinción de GRAM.
Fue creada en 1884 por el médico danés Hans Christian Gram, Esta tinción nos permite
separar a la mayoría de las bacterias en dos grupos las gram positivas que se tiñen de
color violeta y las gram negativas que se tiñe de color rosa. La diferencia en la tinción
radica en las estructuras de la pared celular de las bacterias.

 Prueba de catalasa.
El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos,
a esta vía metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo.
La acumulación del peróxido es muy tóxico por lo que la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Streptococcus sp. producen una
enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno obteniendo agua y
oxígeno gas.
El reactivo utilizado en la prueba es el peróxido de hidrógeno al 30%, Hay diferentes
técnicas para realizar la prueba, la más común es poner una gota de peróxido en el
portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de
una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay
producción de oxígeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa.

 Prueba de oxidasa.
Esta prueba está basada en la identificación de una enzima bacteriana llamada
citocromoC oxidasa y para reducir el nombre se le dice oxidasa.
Todas las bacterias aerobias obtienen su energía en forma de ATP a partir del proceso de
respiración también llamado cadena respiratoria, este se lleva a cabo en la membrana
celular bacteriana. En la respiración hay una secuencia de enzimas y transportadores que
pasan los electrones desde sus sustratos hasta llegar al citocromoC, la enzima llamada
citocromoC oxidasa le quita electrones al citocromoC, estos electrones son transferidos
por la enzima al oxígeno siendo este el último aceptor de electrones en la cadena
respiratoria, finalmente debido a que el oxígeno tiene un exceso de electrones puede
atraer átomos de Hidrógeno formando dos posibles productos: Agua o peróxido de
hidrógeno.
Se utilizan colorantes cromógenos que actúan como aceptores artificiales de electrones
que sustituyen de cierta manera al oxígeno usado por la bacteria, los más usados son:
-Tetrametil-p-fenilendiamina.
-Dimetil-p-fenilendiamina.
-Indofenol.
El reactivo basado en una disolución acuosa de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%, es el
más común y recibe el nombre de reactivo de Kovacs. Este reactivo se puede impregnar
en discos o fragmentos de papel filtro grueso.
El reactivo de Kovacs es incoloro pero al ponerlo en contacto con la enzima citocromoC
oxidasa cambia a un color morado debido a que el tetrametil-p-fenilendiamina es una
amina aromática y la oxidación de esta produce quinolonas de color morado-azulado.

 Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF.

Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía,
casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el más
utilizado por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxidativa, fermentativa o ambas.
La vía oxidativa utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo
no utiliza oxígeno, sinónimo metabolismo anaerobio
El metabolismo oxidativo de la glucosa produce ácidos débiles, por lo tanto en la prueba
bioquímica se utiliza de indicador el azul de bromotimol que tiene un vire de ph menor
respecto al rojo de fenol, ya que son ácidos débiles se agrega una mayor cantidad de
glucosa hasta el 1%, para que se produzca una mayor cantidad de ácidos y se alcance
más fácilmente el vire del indicador.
El metabolismo de las peptonas produce sustancias alcalinas que podrían disminuir el Ph
del medio evitando así evidenciar la presencia de los ácidos débiles producidos por la vía
oxidativa, para solucionar esto el medio tiene poca cantidad de peptonas hasta el 2%
respecto a la D-glucosa
En el tubo sin aceite: La producción de ácidos débiles reduciría el ph del medio esto será
evidenciado gracias al indicador produciéndose una coloración amarilla en todo el tubo,
aunque puede variar su intensidad.
En el tubo con aceite: La fermentación de la glucosa produce ácidos fuertes respecto a los
que produce la vía oxidativa, ejemplo de estos ácidos son el ácido láctico, ácido fórmico,
ácido acético, entre otros. El medio se acidifica y el vire del indicador da como resultado
una coloración amarilla intensa en la totalidad del tubo.

 Motilidad.
La motilidad se puede observar por un crecimiento turbio lejos de la picadura realizada en
la inoculación de los medios O/F o en un medio SIM, este método es de confianza
variable ya que la picadura se pudo haber hecho chueca o irregular lo que nos darían
falso positivo. Para evitar este factor se realiza la técnica de gota suspendida bacteriana

Tinción de gram
Esta tinción nos permitió reconocer a la bacteria de Pseudomonas putida
clasificandola en bacterias gram negativas. Fundamentando esta tinción por su
pared celular bacteriana, específicamente a una estructura la cual es
peptidoglicano, donde en las gram negativas la capa de peptidoglicano se
encuentra más delgada que en las gram positivas. Se dice que al llevar a cabo
una decoloración con alcohol- acetona, donde era soluble el complejo I 2-cristal
violeta, la bacteria gram negativa se decolora, debido a que la disolución de
alcohol- acetona es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la
pared donde la delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el complejo
y la célula llega a decolorarse, quedando incolora y colocando después un
colorante de contraste, safranina , para la observación de la bacteria gram
negativa.

Prueba de catalasa
Se realizó esta prueba con el objetivo de identificar s la bacteria posee la enzima
catalasa la cual se encarga de degradar el peróxido de hidrógeno producido por la
bacteria, a su vez este es un producto de desecho del metabolismo el cual es
tóxico para el microorganismo al acumularse. La reacción catalizada por la enzima
catalasa es la siguiente:
 H2o2H2 O + 12O2
Al realizar la prueba y agregar la muestra al portaobjetos con con unas gotas de
peróxido se logró apreciar un burbujeo en el portaobjetos dando la prueba como
positivo, este burbujeo se debe al oxígeno molecular liberado en la reacción ya
que al ser un gas y formarse en un medio acuoso es liberado por su baja densidad
generando el burbujeo, por lo que al ser un producto de la reacción mostrada
anteriormente se evidencia la presencia de esta enzima en el microorganismo el
cual se sometió a esta prueba.

Prueba de oxidasa
La citocromo C oxidasa mejor conocida como oxidasa es una enzima presente en
cadena respiratoria la cual tiene la función de transportar los electrones para
donarlos al último aceptor de electrones el cual en este caso es el oxígeno. En
esta prueba se utilizó un disco impregnado con tetrametil-p-fenilendiamina y se
agregó la muestra mediante el uso de un palillo de madera.
Esta prueba fue positiva ya que se observó una coloración violeta en un lapso de
tiempo menor a 30 segundos lo cual se atribuye a que al estar presente la
tetrametil-p-fenilendiamina desplaza al oxígeno y actúa como aceptor de
electrones, hasta este paso el reactivo se encuentra en su estado reducido, sin
embargo, posterior a la aceptación de electrones el oxígeno desplazado oxida a la
tetrametil-p-fenilendiamina dando como resultado la coloración violeta y
comprobando la presencia de oxidasa en esta prueba. Otra condición que se tomó
en cuenta en esta prueba fue el tiempo de lectura ya que la presencia de la
coloración en un lapso mayo de tiempo se atribuiría a una oxidación del reactivo
por parte del oxígeno presente en el ambiente y no por el oxígeno desplazado en
el caso de una prueba positiva

Prueba OF
Para detectar si las bacterias utilizan los carbohidratos por la vía oxidativa o
fermentativa se utiliza el agar OF, que contiene agar, peptona y azul de bromotimol
como indicador de pH. Inicialmente el medio es de color verde (pH 7,1) y vira a
amarillo cuando el medio se acidifica (pH de 6 a 7,6) producto de la fermentación u
oxidación del carbohidrato.
La fermentación es un proceso anaeróbico que requiere la fosforilación inicial de la
glucosa previo a su degradación, mientras que la oxidación, en ausencia de
compuestos inorgánicos (como nitrato y sulfato) es un proceso estrictamente
aeróbico que comprende la oxidación directa de una molécula de glucosa no
fosforilada inicialmente. La fermentación produce una acidez mayor que en la
oxidación. El medio OF contiene una elevada concentración de carbohidratos con
una baja concentración de peptona,produciendo así una condición alcalina que
neutraliza la más ligera acidez producida por un organismo oxidativo. La
concentración de agar permite también la determinación de la movilidad y ayuda a
la distribución por todo el tubo del ácido producido en la superficie del medio. Un
tubo se expusó al
aire, el otro se cubrió con aceite mineral estéril para
evitar el paso de oxígeno y formar un medio anaeróbico. Las bacterias oxidativas
producen ácidos solo en el tubo abierto expuesto al oxígeno atmosférico, como se
observó con pseudomonas putida. Después de incubar ambos tubos, el medio
abierto se mantuvo amarillo y el medio cerrado viró a verde, lo que nos comprueba
efectivamente que la bacteria utiliza la vía
oxidativa.

Prueba de motilidad
Mediante la técnica de la gota suspendida se realizó la prueba motilidad la cual
consiste en colocar 1 bola de plastilina en cada esquina de un cubreobjeto y
colocar una o dos gotas de agua entre estas para posteriormente añadir la
muestra a la gota. A continuación se coloca el cubre objeto sobre un portaobjeto
de tal manera que la gota permanezca suspendida en el aire, posteriormente es
observada rápidamente al microscopio en el objetivo 100x. En el caso de nuestra
muestra se obtuvo una prueba positiva ya que se observaron varias bacterias con
forma de bacilo desplazarse en todo el campo mientras la gota de agua aún no se
evapora por lo que se concluyó el resultado mencionado anteriormente. Además
se puede teorizar la presencia de uno o más flagelos presentes en la bacteria
estudiada los cuales proporcionan motilidad a la bacteria sin embargo estos no
fueron observado por lo que no se puede afirmar su presencia o su número de
estas estructuras.

pruebas secundarias
Introducción

Una de la tareas fundamentales del laboratorio de microbiología es la aplicación

de una metodología precisa que permita la identificación de los microorganismos
implicados en procesos clÌnicos asociados a infecciones o de aquellos que tienen
relación con el hombre. Con el objetivo de identificar el agente etiológico
responsable del proceso infeccioso y para conocer las implicaciones
patogénicas/patológicas, la evolución clínica, y aplicar una terapia antimicrobiana
eficaz, un pilar fundamental en la práctica de la microbiología clínica lo constituye
la asignación de especie a un aislamiento microbiano.
Las pruebas bioquímicas permiten determinar las características metabólicas de
las bacterias objeto de identificación. Algunas de estas pruebas requieren para su
lectura el crecimiento del microorganismo con una incubación previa de 18 a 48h;
a este grupo pertenecen la mayorÌa de las pruebas que detectan componentes
metabólicos o aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a
una sustancia dada tras cultivo en medios de identificación que contienen el
sustrato a metabolizar. Las pruebas bioquímicas secundarias nos permiten
identificar la especie, mientras que para enterobacterias se puede determinar el
género y especie. Las que se utilizaron en el laboratorio son las siguientes:
- Citrato: Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de
utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como
única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del
medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como única fuente
de carbono.
-Malonato: Pone de manifiesto la capacidad que poseen determinadas bacterias
de utilizar el malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente
liberación del catión, que en presencia de iones agua produce alcalinidad.
Solamente los microorganismos que pueden usar simultáneamente malonato de
sodio como fuente de carbono y sulfato de amonio como fuente de nitrógeno son
capaces de ejercer una acción tampón produciendo hidróxido de sodio. El
aumento de la alcalinidad resultante hace que el azul de bromotimol cambie de
verde a azul. Los microorganismos malonato negativos que fermentan glucosa
hacen que el indicador cambie de verde a amarillo. Se utiliza en la diferenciación
de especies entre las Enterobacteriaceae. La mayorÌa de las especies de
Enterobacter y Klebsiella utilizan malonato de sodio.
-Ureasa: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando
dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad
enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo
para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo
retardado. La prueba también se utiliza para diferenciar Physobacter
phenylpyruvicus de Moraxella spp. Helicobacter pylori y Brucella spp. también
hidrolizan la urea. Esta prueba puede ayudar en la identificación de Cryptococcus
spp. que produce un resultado positivo después de una incubación prolongada.
-Reducción de nitratos: Sirve para determinar la capacidad de un organismo de
reducir el nitrato en nitritos. Se utiliza para asignar bacterias a la familia
Enterobacteriaceae, en la diferenciación de Moraxella catarrhalis del género
Neisseria y en la identificación de bacilos grampositivos aerobios.
-Rojo de metilo: El rojo de metilo es un indicador de pH. Actúa entre pH 4,2 y 6,3
variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Mediante esta prueba se
comprueba la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables
los productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa por la vÌa de la
fermentación ácido mixta. Se utiliza como parte de la identificación a nivel de
especie de los bacilos entéricos gram negativos.
-Voges-Proskauer: Permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por
la vía butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que
forma un complejo de color rojizo con el α-naftol. Se usa en la identificación a nivel
de especie de bacilos entéricos gram negativos, Aeromonas spp., y Vibrio spp.
-Fenilalanina-desaminasa. Esta prueba determina la capacidad de un
microorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina en ácido fenilpirúvico
por la actividad enzimática de de la fenilalanina desaminasa, con la consiguiente
acidez resultante. Esta actividad enzimática es característica de todas las
especies de los géneros Proteus, Providencia y Morganella por lo que se utiliza
para separar estos tres géneros de otros géneros de enterobacterias.
-Hidrólisis de la gelatina. Esta prueba muestra la capacidad de ciertos
microorganismos para hidrolizar la gelatina a péptidos y aminoácidos, mediante la
acción de enzimas específicas denominadas gelatinasas.
-Medio SIM: Las enzimas triptofanasas oxidan el triptófano para formar tres
metabolitos: indol, metil indol y ácido indolacético. Los reactivos de Erhlich o
Kovacs contienen DMABA que reacciona con el indol producido formado un
compuesto quinónico color violeta, que se observa por la aparición de un anillo en
la superficie del medio.
-Agar hierro de Kligler. Mediante esta prueba se puede determinar la capacidad de
un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono específico (en este caso
glucosa, lactosa o ambas) incorporado en un medio de crecimiento, además de la
producción o no de gases (CO2 e H2 como productos finales del metabolismo de
los hidratos de carbono) y la producción de ácido sulfhídrico (SH2). El medio de
Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa. Existe otro
medio, el triple sugar iron (TSI) que posee un tercer hidrato de carbono, la
sacarosa.
-El Medio de Motilidad – Indol – Ornitina (MIO): es un medio de cultivo
ampliamente utilizado para la diferenciación de bacilos Gram negativos entéricos,
sobre la base de la producción de Indol, la actividad de la enzima Ornitina
decarboxilasa y la capacidad de motilidad. Los cambios en el pH se verifican
gracias al contenido de púrpura de bromocresol. La actividad de la ornitina
decarboxilasa se observa como un viraje hacia el color púrpura, en tanto que la
ausencia de la enzima produce un viraje hacia el color amarillo. La motilidad se
observa como un desplazamiento del desarrollo microbiano desde el inóculo. La
producción de Indol se verifica mediante la adición de algunas gotas de Reactivo
de Kovacs en la superficie del medio de cultivo. La producción de un compuesto
color rojo fucsia es considerado como Indol positivo.
-Agar arginina: La descarboxilación del aminoácido L-arginina, es realizada por
microorganismos que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando
se rompe la unión del grupo carboxilo, liberando dióxido de carbono (gas) y
formando putrescina, esta última es una diamina que se caracteriza por presentar
reacción alcalina. Por otra parte el indicador, púrpura de bromocresol en medio
alcalino presenta una coloración púrpura y en medio ácido es amarillo. Por lo tanto
si se produce putrescina el medio intensifica el color púrpura por la alcalinidad
producida, en caso contrario el medio no cambia de color; finalmente también se
podrá observar la fermentación de la glucosa con su respectiva producción de
acidez, virando el medio a color amarillo verdoso.

Análisis de resultados

Como se ha visto, las pruebas bioquímicas secundarias nos permiten determinar

la especie de bacterias y para enterobacterias se puede determinar también el
género a partir de la actividad metabólica de una cepa pura.
Se trabajó con Enterobacter Aerogenes, el cual es un bacilo gram negativo
anaerobio facultativo, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae.
Los microorganismos del grupo Enterobacter producen acetoína como producto
metabólico final principal del metabolismo de glucosa y forman cantidades
pequeñas de ácidos mixtos (ácido láctico, fórmico y acético). Para el medio VP se
agregó KOH, el cual formó un anillo rojo lo cual nos indica la prueba como
positiva, debido a que la acetoína, en contacto con el KOH se convierte a diacetilo
y el α-naftol funciona como catalizador para formar el complejo color rojo.
Al añadir el indicador rojo de metilo, que actúa entre pH 4,2 y 6,3 variando desde
rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3), hubo cambio de coloración de amarillo a
naranja, lo cual nos indica la prueba como negativa, dado que sólo produjo
pequeñas cantidades de ácido del sustrato, y debido a que es un color intermedio
entre amarillo y rojo, esto no indica una prueba positiva. Este resultado es
característico de Enterobacterias.
 Prueba de nitratos
Esta prueba lo que busca es que el microorganismo redusca los nitratos a nitritos
para extraer el oxígeno que tienen los nitratos y lo pueda utilizar, siendo una
reacción oxido reducción. El medio de cultivo contiene extracto de carne,
peptonas, peptona de proteasa, nitrato de potasio este lo necesitara como fuente
de oxígeno; la reducción de nitratos a nitritos se reconoce colocando el alfa-
naftilamina y el ácido sulfanílico dando una coloración rojiza en este caso no se
observó el cambio de color permanecio el color amarillo así que sé paso a una
segunda fase colocando Zinc y a muestra siguió presentando una coloración
amarilla, dando una prueba positiva, es decir la bacteria tiene nitrato reductasa y la
nitrito reductasa.

 Prueba de malonato
El malonato de sodio es una sal orgánica la cual puedes ser utilizada como la
única fuente de carbono de un microorganismo, la fermentación de esta sal genera
productos de desecho básicos los cuales alcalinizan el medio, para hacer evidente
este cambio se emplea como indicador de pH el azul de bromotimol el cual
presente una coloración amarilla por debajo de pH de 6, una coloración verde en
un pH de 6 a 7.8 y una coloración azul en pH mayor a 7.6 . En el caso de nuestra
prueba se observó un cambio de coloración de verde a turquesa lo cual nos indica
una ligera alcalinización del medio por lo que se afirma que esto se debe a
productos básicos provenientes de la fermentacion de malonato de sodio.

 Prueba de ureasa
Esta prueba consiste en la evidenciación de la hidrólisis de la urea la cual es un
desecho del metabolismo de aminoácidos, la urea en este caso es el sustrato el
cual sera degradado por aquellas bacterias que presenten la enzima ureasa, al
hidrolizar la urea esta libera amoníaco el cual alcaliniza el medio por lo que se
utiliza como indicador de pH al rojo de fenol el cual en un medio ácido presenta
una coloración amarilla, en un medio cercano a la neutralidad un color rosa claro y
en medio alcalino un color magenta intenso.
Para el caso de nuestra prueba no se logró observar ningún cambio en la
coloración por lo que se afirma que nuestra bacteria no posee la enzima ureasa y
por lo tanto ni hidroliza a la urea alcalinizando el medio

 Medio citrato
La utilización del citrato por parte de las Enterobacterias se evidencia en el medio
por la producción de subproductos alcalinos. El medio contiene citrato de sodio,
que es un anión y funciona como única fuente de carbono, y el nitrato de amonio
como única fuente de nitrógeno, además el indicador que presenta es azul de
bromotimol,que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6. Se
observó un cambio de coloración de verde a azul rey, lo cual nos indica la prueba
como positiva, ya que Enterobacter Aerogenes fue capaz de utilizar el citrato, de
modo que también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción
de amoniaco NH+, lo cual produce la alcalinización del medio por conversión de
éste a hidróxido de amonio NH4OH.

 Medio Gelatina
La gelatina es una proteína la cual posee la capacidad de formar un gel
semisólido, sin embargo esta al ser hidrolizada a cadenas de péptidos u
aminoácidos pierde su propiedad de gelificar. Una enzima capaz de realizar la
hidrólisis o licuefacción de la gelatina es la gelatinasa la cual se encuentra en
algunas bacterias de la familia enterobacter y tiene como propósito proveer de una
fuente de aminoácidos a la bacteria. En los resultados de esta prueba no se
observó licuefacción de la gelatina ya que después de la incubación el medio
continuaba presentando su propiedad de un estado físico semisólido por lo que se
concluye que la bacteria inoculada no posee la enzima gelatinasa y por lo tanto no
hidroliza esta proteína.

 Medio MIO
Este medio es empleado para evidenciar la motilidad de una bacteria, formación
de indol y metabolismo de ornitina, sin embargo en esta práctica analizaremos
únicamente el metabolismo de la ornitina.
La ornitina es un aminoácido dibásico el cual puede ser descarboxilado por una
descarboxilasa la cual se puede presentar en algunos individuos de la familia de
las enterobacterias. El producto de la descarboxilación de la ornitina por acción de
la descarboxilasa es una amina la cual tiene la capacidad de alcalinizar el medio
en el que ocurre la reacción por lo que para evidenciar este proceso se utiliza
como indicador de pH al púrpura de bromocresol el cual presenta una coloración
amarilla a pH menores a 5.2, purpura-cafe claro a pH entre 5.2-6.8 y púrpura
intenso a pH mayor a 6.8.
En nuestro medio se observó un cambio de coloración de púrpura-café a púrpura
intenso por lo que se evidencia una alcalinización del medio correspondiente a la
producción de aminas proveniente de la descarboxilación de ornitina y por lo tanto
la presencia de esta enzima en la bacteria analizada.

 Prueba KIA y TSI

En el caso de estas pruebas la que se leyó fue la de KIA ya que resulta más fácil
por lo que tiene nadamas dos azúcares y de fácil interpretación. ambos medios
son de fondo grande pico chico para observar la fermentación de carbohidratos,
contienen glucosa en concentración muy baja (1%), en el Kligler tiene lactosa y en
el TSI tiene un azúcar de más, sacarosa;contiene peptonas , rojo de fenol y para la
observación de H2S contiene tiosulfato de sodio y citrato férrico a través de la
fermentación de los carbohidratos se puede detectar CO2.En esta prueba se
puede reportar la fermentación de carbohidratos, la presencia de H2S y de gas. el
tubo presenta mucho fondo poco pico presentando un fondo y pico de color
amarillo es decir un medio ácido indicando que fermento a la glucosa, después de
las 24 hrs siguió con coloración amarilla presentando mucha acidez es decir
lactosa positiva.

 Prueba arginina
en esta prueba se va a evaluar la enzima arginina dihidrolasa,contiene una
coenzima que es el piridoxal el cual va a ayudar a la enzima carboxilasa a llevar a
cabo su función, contiene glucosa,indicador de bromocresol. para para que se
lleve a cabo la descarboxilación la bacteria tiene que formar la enzima (inducible)
sólo se formará cuando esté el sustrato para esto se necesita un pH ácido y un
sistema anaerobio por lo que se le coloco aceite, el medio ácido se dará con la
fermentación de la glucosa en baja concentración, la prueba dio positivo
cambiando de un color café a un color púrpura.

 Prueba Fenilalanina
En el caso de esta prueba lo que se desea conocer es la presencia de la enzima
fenilalanina. La capacidad de la bacteria para desaminar el aminoácido
fenilalanina en acido fenilpiruvico por acción de la enzima fenilalanina desaminasa,
para la comprobación de esta acción se añadió cloruro férrico dando un color
verde, en esta muestra no sucedió, pues siguió en la misma coloración

 Medio SIM
Este medio se utiliza para determinar si un microorganismo es móvil o no, si es
capaz de liberar ácido sulfúrico por acción enzimática de los aminoácidos que
contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro, y además
permite observar si tiene la capacidad de desdoblar el indol de la molécula de
triptófano. La producción de ácido sulfúrico se da cuando la bacteria reacciona con
el tiosulfato de sodio por una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato.
El gas incoloro SH2 reacciona con citrato férrico de amonio para producir un
precipitado negro insoluble. En el caso de Enterobacter Aerogenes la prueba
resultó negativa, dado que no hubo el cambio a color negro.
La producción de Indol se da solamente en aquellos microorganismos capaces de
fermentar los hidratos de carbono, por la oxidación del triptófano y esto se
evidencia con. los reactivos de Erhlich o Kovacs por la producción de un anillo rojo
en la superficie del medio, por lo tanto, la prueba resultó negativa para
Enterobacter.
No se observó turbidez en el medio.

antibiograma
Para la realización del antibiograma es imprescindible partir de cultivos puros, si
se quieren obtener resultados fiables. Se proponen tres técnicas: una de
disolución en medio sólidos.con discos de carga constante (Kirby-Bauer), y dos de
disolución, en medio sólido y líquido, respectivamente, en las cuales se utiliza una
gama de concentraciones variables del antimicrobiano, con el fin de determinar la
concentración mínima inhibitoria (CMI) o menor concentración de antimicrobiano
capaz de inhibir el crecimiento bacteriano en unas determinadas condiciones.
Método Kirby Bauer
Este método es empleados para determinar la sensibilidad de un agente
microbiano frente a un antibiótico o quimioterápico.
sobre la superficie de una placa de agar de Müller-Hinton, se inocula una cantidad
estandarizada de bacterias, sembrandolas de forma uniforme para obtener
después de la inoculación un “césped” bacteriano a continuación se colocan
discos de papel de filtro impregnados con concentraciones conocidas de los
diferentes antibióticos. La elección de los antibióticos a probar dependen del
germen y del foco de infección.

Concentración Mínima Inhibidora (CMI)

La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) es la medida de la
sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de
antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en
unas condiciones normalizadas. Es el método habitual utilizado en los laboratorios
de Microbiología Clínica. Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control
(de referencia) con el fin de que los resultados sean reproducibles y comparables.
Este método nos ofrece información sobre la sensibilidad de las bacterias S
(sensible), I (intermedia) y R (resistente).

Los antibióticos son sustancias capaces de inhibir el crecimiento e incluso de

destruir determinadas especies microbianas de forma específica a baja
concentraciones y sin toxicidad, o muy baja, para el organismo humano.
Clasificación de los antibióticos
Dependiendo de su acción, los antibióticos se clasifican como:
 Antibióticos de bajo espectro, afecta a grupos pequeños de gérmenes.
 Antibióticos de amplio espectro, afecta a grandes grupos de gérmenes.
Otra clasificación se basa en su mecanismo de acción. Si actúan inhibiendo el
crecimiento de gérmenes nocivos, se denominan bacteriostáticos y, si los
destruyen, bactericidas.
Antibióticos bactericidas:
 Beta-lactámicos (penicilinas y cefalosporinas).
 Glicopéptidos (vancomicina, teicoplanina).
 Aminoglucósidos (grupo estreptomicina).
 Quinolonas (grupo norfloxacino).
 Polimixinas.
Antibióticos bacteriostáticos:
 Macrólidos (grupo eritromicina).
 Tetraciclinas.
 Cloramfenicol.
 Clindamicina, lincomicina.
 Sulfamidas.

MIC
Este método de concentración inhibitoria mínima es un método cuantitativo, el
antibiótico que se utilizó en la práctica es Lincomicina , en los resultados
mostrados no se pudo determinar la concentración que era efectiva a la bacteria
,ya que de forma aleatoria en los tubos se observa la turbidez que indica el
desarrollo bacteriano esto pudo deberse a un error cometido al momento de
preparar el método.
La lincomicina es un antibiótico bacteriostático a dosis normales y bactericida a
dosis elevadas, es activo frente a microorganismos gram positivos como
staphylococcus aureus.

Antibiograma

Se realizó un antibiograma mediante el método de Kirby-Bauer utilizando como

muestra bacteriana a Staphylococcus Aureus, para esto se probaron 7 discos con
diferentes antibióticos sobre un agar Muller-Hinton sembrado de forma masiva e
incubado posteriormente, al terminar el tiempo de incubación se lograron apreciar
distintos halos de inhibición alrededor de cada uno de los discos por lo que se
midió el diámetro de estos para compararlos con tablas en la literatura y catalogas
la sensibilidad de la muestra ante cada uno de estos antibióticos.

El primer antibiótico a analizar es la doxiciclina la cual presentó un halo de

inhibición de 26 mm, a comparación de la literatura está reportado a considerar
como sensible en un intervalo de diámetro mayor a 16 mm por lo que podemos
concluir que S.Aureus es sensible a la presencia de este antibiótico.
Para en caso de la Cefepima se midió un diámetro de 27mm en el halo de
inhibición, por lo que al comparar con las tablas las cuales reportan como sensible
una muestra que presenta un halo de inhibición mayor 18 mm por lo que podemos
afirmar que nuestra bacteria es sensible a este antibiótico
Continuando con el disco de ácido nalidíxico se obtuvo un diámetro del halo de 11
mm correspondiente en un intervalo de menor a 13 mm de lo reportado en tablas
para resistente
Continuando con el siguiente dico correspondiente a oxacilina se obtuvo un
diámetro de 11 mm en su halo de inhibición el cual corresponde a un intervalo de
11-12 mm reportado en las tablas como intermedio.
Posteriormente analizaremos el disco de cefotaxima el cual presenta un halo de
inhibición con diámetro de 24 mm el cual corresponde a un intervalo mayor de 23
mm el cual es reportado como sensible en las tablas.
Para el caso de el disco de cefotetan se observó un halo de inhibición con un
diámetro de 20 mm el cual corresponde a un intervalo de mayores a 16 mm los
cuales son reportados como muestras sensibles a este antibiótico

Por último para el caso del disco de dicloxacilina se obtuvo una halo de inhibición
de 14 mm, sin embargo, no se encontraron valores de intervalos reportados para
este antibiótico por lo cual no puede ser clasificado

Se puede concluir que en caso de requerir un tratamiento contra Staphylococcus

aureus se sugiere suministra los antibióticos doxiciclina, cefepima, cefotaxima y
cefotetan ya que la muestra bacteriana presentó sensibilidad a estos antibióticos,
se deberá considerar el uso de oxacilina ya que la muestra presentó una
sensibilidad intermedia y se deberá descartar el uso de ácido nalidíxico ya que la
muestra es resistente a la presencia de este antibiótico
en el laboratorio clinico, los

indicadores de calidad son la

presicion y la exactitud: