INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE

TANTOYUCA

Microbiología

Unidad 3 y 4. Factores ambientales que afectan el

crecimiento de microorganismos y características de
estructuras celulares.

Reporte de práctica:
PRACTICA 3.- OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DE
BACTERIAS – MÉTODOS DE TINCIÓN

Equipo: 2
Integrantes:
Carmen Amairani Flores Escobar
Blanca Estela del Ángel Vicente

Carrera: Ingeniería Ambiental

Semestre: 4° A

Docente: I.A. Sofía Elizabeth García Martínez.

Tantoyuca, Veracruz, México 21 de Mayo del 2019

INTRODUCCIÓN
Los microorganismos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio
óptico, práctica de importancia en estudios de morfología de hongos, algas y
protozoos.

En el caso de las bacterias, dado su pequeño tamaño y la falta de contraste con el

medio, esta técnica de observación es menos usada.

Sin embargo, es muy empleada para evidenciar la movilidad bacteriana, con cultivos
jóvenes en medio líquido, en el microscopio óptico, ya que los flagelos son difíciles
de observar aun con tinciones especiales. Se coloca una gota de cultivo entre porta
y cubre objeto o en portaobjetos especiales excavados, que se observan con baja
luminosidad ya que existe poco contraste entre las células y el agua, lo que dificulta
la observación.

La principal dificultad durante la observación microscópica es la falta de contraste

entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el
contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de

teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más
corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como
formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante,
no se producen ulteriores cambios estruturales en el protoplasma. La fijación se
realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos,
tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso
de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son
realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas
no pueden realizarse con mucha precisión.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas
cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de
colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan
con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósitos de grasa.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada
con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Si se desea
simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, son
suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que
no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales,
puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se

dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por
tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un
material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de
partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua).
La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células
en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de
cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaución, ya que pueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman
en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares
auténticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el
mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse
muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando
al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

Los microorganismos se pueden observar al microscopio luego de una tinción

simple, es decir un solo colorante. Los métodos de tinción diferencial permiten
diferenciar grupos bacterianos según sus propiedades de tinción. Ejemplo de estas
es la tinción de Gram, que separa a bacterias Gram positivas de las gram
negativas.

Después de la coloración de contraste las células gram negativas son rojas,

mientras que las gram positivas permanecen violetas. Esto de acuerdo a la
existencia de peptidoglucano, esta característica química está íntimamente ligada a
la estructura de la envoltura o pared celular, por lo que refleja un tipo natural de
organización bacteriana.
 OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DE BACTERIAS –
MÉTODOS DE TINCIÓN
Realizar observaciones
microscópicas de bacterias
aplicando tinciones simples
y diferenciales.
Tinción de Gram
1. La muestra fijada es
tratada con solución de
cristal violeta, 1 a 2 minutos.
2. Lavar ligeramente con
agua. Escurrir.
3. Cubrir el preparado con
lugol durante 1 a 2 minutos.
4. Decolorar con alcohol 95°
5. Lavar ligeramente con
agua. Escurrir.
6. Cubrir con solución de
fucsina (o safranina), durante
30 segundos.
7. Lavar.
8. Secar entre dos papeles de
filtro, con cuidado, sin frotar.
9. Agregar sobre el preparado
una pequeña gota de aceite de
cedro y examinar al
microscopio con el objetivo
de inmersión (100x).
Materiales:
1 Cristalizador grande.
1 Piseta con agua destilada.
1 Gradilla de metal.
1 ansa de níquel-cromo
2 Portaobjetos
Reactivos:
Suspensión mixta de
bacterias, Azul de metileno,
Cristal violeta, Lugol,
Safranina, Alcohol etílico
al 95°, Aceite de inmersión.
Tinción simple
1. La lámina fijada es
tratada con solución de azul
de metileno durante 1 a 2
minutos.
2. Lavar ligeramente con
agua. Escurrir.
3. Secar entre dos papeles
de filtro, con cuidado sin
frotar.
4. Agregar sobre el
preparado coloreado una
pequeña gota de aceite de
cedro y examinar al
microscopio con el objetivo
de inmersión (100x).
5. Comentar observaciones
Procedimiento:
Preparación del frotis
1. Flamear el ansa, colocar
una gota de la suspensión
bacterias sobre el
portaobjetos.
2. Dejar secar
3. Fijar el preparado sobre
el portaobjetos pasándolo
sobre la llama del mechero
con la parte del preparado
hacia arriba.
4. Para muestras solidas se
debe colocar una gota de
agua y después colocar con
el asa la muestra y repetir
los puntos 2 y 3.
NOTA: Con otros
colorantes como el cristal
violeta o la fucsina, el
procedimiento puede ser el
mismo, siendo necesario
alterar el tiempo de
tratamiento (2 a 60
segundos con cristal violeta
y 15 a 30 segundos con
fucsina).
MATERIALES Y EQUIPO
Materiales: Reactivos:

1 Cristalizador grande. Suspensión mixta de bacterias

1 Piseta con agua destilada. Azul de metileno
1 Gradilla de metal. Cristal violeta
1 ansa de níquel-cromo Lugol
2 portaobjetos Safranina
1 pinza de doble nuez Alcohol etílico 95°
Aceite de inmersión
Equipo:
1 microscopio óptico

PREPARACION DE SOLUCIONES
A nuestro equipo le correspondió realizar la preparación del reactivo azul de
metileno:
Materiales: Reactivos:
Frasco ámbar
Matraz de vol. de 100 ml. Azul de metileno
Vidrio de reloj Alcohol etílico
Espátula Hidróxido de potasio 0.01%
Probeta de 100 ml
Varilla de vidrio
Frasco con gotero

Procedimiento:
1.- Pesar 0.3 gramos de azul de metileno en la balanza analítica.
2.- Disolver el azul de metileno en 30 ml de alcohol etílico al 95%.

3.- Preparar una solución de Hidróxido de Potasio al 0.01%, pesando 0.01 gramos
de este reactivo en la balanza analítica y disolverlo en 100 ml de agua destilada.

4.- Mezclar la solución de Hidróxido de Potasio con la preparación de azul de

metileno y alcohol en un matraz balón aforado, posteriormente agitar el matraz para
homogenizar la mezcla.
PROCEDIMIENTO
Preparación del frotis (muestras liquidas)

1. Flamear el ansa.

2. Colocar una gota de la suspensión mixta de bacterias sobre el portaobjetos.

3. Dejar secar espontáneamente.

4. Fijar el preparado sobre el portaobjetos, asegurando con una pinza y pasarlo tres
veces sobre la flama, con la parte del preparado hacia arriba.
Preparación del frotis (muestras solidas)
1.- Flamear el ansa para esterilizarla.

2.- Colocar una gota de agua en el portaobjetos, después colocar con el asa la
muestra, extendiéndola en la superficie del portaobjetos.

2. Dejar secar espontáneamente.

3. Fijar el preparado sobre el portaobjetos asegurando con una pinza y pasarlo tres
veces sobre la flama, con la parte del preparado hacia arriba.
Tinción simple
1. La lámina fijada es tratada con solución de azul de metileno durante 1 a 2 minutos.

2. Lavar ligeramente con agua. Escurrir.

3. Secar poniendo el portaobjetos en la flama, con ayuda de unas pinzas.

4. Agregar sobre el preparado coloreado una pequeña gota de aceite de cedro y

examinar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x).
5. Comentar brevemente las observaciones.
NOTA: Con otros colorantes como el cristal violeta o la fucsina, el procedimiento
puede ser el mismo, siendo necesario alterar el tiempo de tratamiento (2 a 60
segundos con cristal violeta y 15 a 30 segundos con fucsina).

Tinción de Gram
1. La muestra fijada es tratada con solución de cristal violeta durante 1 a 2 minutos.

2. Lavar ligeramente con agua. Escurrir.

3. Cubrir el preparado con lugol durante 1 a 2 minutos.

4. Decolorar rápidamente con alcohol 95 o GL y lavar ligeramente con agua.
Escurrir.

6. Cubrir con solución de fucsina (o safranina), durante 30 segundos para contra-

colorear.

7. Lavar y escurrir.
8. Secar el portaobjetos con la flama.

9. Agregar sobre el preparado una pequeña gota de aceite de cedro y examinar al

microscopio con el objetivo de inmersión (100x).

10.- Repetir el mismo procedimiento con el portaobjetos de muestra sólida, aunque

puede realizarse de manera simultánea.
RESULTADOS
Muestra 1

Simple

Son Gram positivas, se puede observar

estreptococos en diferentes lugares donde se
esparció la muestra.

Cristal violeta

Son Gram negativa, se observa algunos

estreptococos y estreptobacilos.

Muestra 2

Simple

Son gram positivas,se observan algunos

estreptobacilos y diplobacilos.
 Cristal violeta

Son Gram negativas se observan varios bacilos

y estreptobacilos.

CONCLUSIÓN
La observación de bacterias con microscopía óptica, en un laboratorio de
Microbiología, puede realizarse por diferentes procedimientos como son la
observación directa de microorganismos “in vivo” o el tratamiento con colorantes
mediante tinción positiva y negativa, procesos dirigidos a incrementar el contraste y
por consiguiente a optimizar el resultado. Se describen aquí los métodos y las
técnicas más habituales para la observación de muestras con microscopía óptica,
así como procedimientos de observación con microscopía de fluorescencia y
confocal con diferentes tipos de fluorocromos y sondas moleculares.

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su

entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de
tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el
contraste.

Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico

oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en
sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales,
vigentes y de uso universal que ayudan al diagnóstico microbiológico.

La practica se realizo con muestras tomadas del agua de grifo del tecnológico,
durante la realización de esta práctica se puedo observar las distintas bacterias que
estaban presentes en las muestras las observamos en el microscopio y por su
morfología podíamos decir de que tipo de bacterias se trataba.

Bibliografía
file:///C:/Users/Blanca/Downloads/819-989-1-PB.pdf (20/05/2019)

https://es.wikipedia.org/wiki/Bacilos_%28banda%29 (20/05/2019

https://es.wikipedia.org/wiki/Enterococcus (20/05/2019)