Gusanos

en el cerebro
La dinámica hospedero-parásito en la infección
por Taenia solium

Cris9na Guerra Giraldez, PhD

Laboratorio de neurocis9cercosis

Coloquios de Física, PUCP 2017

•  Parásitos en el cerebro
•  La enfermedad y el parásito
–  Cómo los estudiamos
–  Qué estamos haciendo
–  Qué queremos saber

hIp://www.itstheitgirl.com
J Moore. Sci Am (1984)
J Moore. Sci Am (1984)
OMS: Food-borne parasite of greatest global concern
Ser humano (hospedero definitivo)

Cisticercosis humana
Teniasis Ingestión de huevecillos
Ingestión de por contaminación fecal
carne de cerdo
mal cocida.
Cisticercosis
porcina
Ingestión de
huevecillos o

Garcia et al. Lancet, 2014

proglótidos de
Cerdo (hospedero intermediario) T.solium
 (Neuro)cis+cercosis
Principal enfermedad parasitaria del SNC

Hospedero defini+vo
Ingesta de quistes
Teniasis

WHO:
50 mill

Ingesta de huevos
(ruta fecal-oral)
Cis+cercosis

Diversos
síntomas
neurológicos Pérdidas
económicas
Ataques Hospedero intermediario
epilép+cos
WHO/C.Gaggero
Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008, Vol. 8, No. 5
Inflamación (s. I DC)
 macrófago
Función de
…en el cerebro…

B. Becher et al. Nature Reviews Immunology 17, 49–59 (2017)

B. Becher et al. Nature Reviews Immunology 17, 49–59 (2017)
in vivo (modelo) Neurocisticercosis
in vitro
HIBRIDOMAS
(MAb)

INFLAMACIÓN Azul de Evans CULTIVO

Histopato. Efectos de tratamiento

IHQ
qPCR Daño vascular BHE
Daño neuronal Proliferación
Proteínas
Immuno-
localización
GFAP
Punto azul: hosp/pat Histología Detección
BHE afectada
Infiltración de células inmunes

AbboH 2006; Engelhardt 2009

 Evans blue y barrera hematoencefálica
• 1914. Alhsima afinidad por albúmina.
• Modelos animales
Niveles de TNF-α y IL-6 en el LCR de pacientes con NCC

Chavarria AJTMH 2001

Diseño experimental
EB EB EB
PZQ (n = 8)
2h 2h 2h

0 1 2 3 4 5 días

U (n = 3) PZQ 48h (n=4) PZQ T120h (n=4)

Muestras de cerebro y músculo

Histología qPCR
 Methodology
Sample
s
- Treatment
n=82 Histopath Presence of - BBB status
IHC
ology Aβ - Cyst
localiza9on
n=20 Molecular Total Expression of
cDNA
analysis RNA app gene

RT- qPCR
PCR
mRNA

cDNA
 El tratamiento aumentó la extravasación de azul de Evans

No PZQ

PZQ
No PZQ PZQ
38/108 201/261
 In vivo: extravasación de AE

Cerebro de cerdo no tratado: Quistes y tejido azules en

quistes y tejido incoloros crebro de cerdo tratado
 Background
A c u t e i n fl a m m a t o r y
response post-treatment:

•  Increase of vascular
permeability
•  P e r i c y s 9 c •  TNFa
inflamma9on •  IL-6
•  TNFa •  IFN-g
•  Pro-inflammatory and •  IL-6 •  IL13
regulatory citoquines •  IFN-g •  CTLA-4
•  IL13
•  CTLA-4 •  MMP-1
•  IL10 •  MMP-9
•  IL2RA(CD25) •  TIMP-1
•  TIMP2
 La inflamación y la disrupción de la BHE
se asociaron y fueron afectadas por el PZQ

clear blue clear blue

No PZQ
 Expresión de genes proinflamatorios
y regulatorios

•  Método: qPCR
 Regulación posi+va de genes
proinflamatorios en tejido AZUL

IL-1β

IFN-γ

TNF-α
 Regulación posi+va de genes
regulatorios en tejido CLARO

IL-2Ra

FoxP3

Respuesta protectora
 Rsumiendo
En el modelo de cerdo naturalmente infectado con Taenia solium:
▪  Se halló tejido pericís+co donde se extravasó el azul de Evans.
▪  La disrupción de la BHE aumentó luego del tratamiento.
▪  También aumentó la inflamación luego del tratamiento.
▪  La expresión de genes proinflamatorios (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ) fue
más elevada donde la BHE estuvo afectada.
▪  A la inversa, el gen de IL-10 (regulatoria) se expresó en mayor nivel
donde la BHE se mantuvo intacta.
Después probamos con an9inflamatorios

An9-TNF-REDUJO la expresión de IL-6

Results

Parameter Blue Clear

GFAP

CD44

Cadherin

Beta-
amyloid
Results
 Results
Parameter Blue Clear
VEGF+ vessels
GFAP
VWf+ vessels
iNOS+ vessels
MMP-9+
vessels
VEGF
Pericuffing
vascular

VEGF
 Results
Parameter Blue Clear
GFAP VEGFA,
PECAM1, vWF,
CDH5, ANG1,
ANGPT2,
EFNB2

VEGF

VEGF
 Descubrimiento colateral: el punto azul

Q totales Q con punto

U (2 cerdos) 3172 6 (0.2%)

PZQ (6 cerdos) 3736 245 (6.6%)

Hubo más en cerdos tratados

 Eosinófilos ac+vados estaban atacando al quiste
40X 1000X

daño del quiste

quiste ê
Inflamación
ê
Síntomas

Infiltrado
inmune

Estrategias
dirigidas?
Quiste muscular y tejido adyacente

B
 Punto azul en el cerebro
(151 quistes analizados)

cw
neck

cw

122 Q con tejido azul 10 Q tuvieron punto azul

2 de cerdos no tratados; 8 luego de PZQ
 Eos en la interacción hospedero-parásito
Inflam. moderada

Inflam. grave

“punto azul”

Inflam. muy grave

Quiste viable: suprime la respuesta inmune
Creemos que nuestro modelo
porcino será de mucha u+lidad
para definir las rutas de
neuroinflamación.
 ? Effect of treatment
Praziquantel
(PZQ) Inflamma+on

BBB disrup+on

Astrogliosis
?
and
Neuronal damage
 Reactive astrogliosis in NCC

Immunohistochemistry à an+-GFAP (glial fibrillary acidic protein)

RA 1 RA 2 RA 3 RA 4
Taenia solium

Capacidad
prolifera9va
elevada es
necesaria en
cuello y
progló9dos
inmaduros.
 Planarias, regeneración, neoblastos

Ryan S. King, and Phillip A. Newmark J Cell Biol 2012;196:553-562

Proliferación y regeneración en
planarias

Rossi. 2008
Iden9ficación in situ de neoblastos en
quistes de T. solium (NCC cís9ca).

Orrego.2014
 Antecedentes
A B C
M

D E F

M M
S

Células germinales en quiste racemoso y quiste vesicular. Vista macroscópica (A-D) y IHC empleando
marcaje con BrdU (B, C, E, F). Quiste racemoso mostrado en la fila superior y quiste vesicular mostrado en la
fila inferior. Barra (B, E) = 200 µm, (C, F) = 50 µm y (D) =100 mm. S: escolex, M: membrana.
 Células ¨madre¨de T. solium
Primero encontramos
las células en T.
solium

An9-BrdU

Ya las tenemos en cul9vo celular

HERRAMIENTA para inves9gar!
 3. Quiste superprolifera9vo (“racemoso”)

Museo del INCN- STM.

 Obje9vos específicos:
1.-Iden9ficar y caracterizar neoblastos en quistes de T.solium
(NCC racemosa).

Colecta de Quistes
racemosos

Cul9vo de parásitos
in vitro en presencia
de BrdU

IHQ
 2.- Aislar RNA de quistes de T.solium (NCC racemosa y cís9ca)

Cul9vo celular
(neoblastos)

Extracción de RNA
total

Cuan9ficación

RT-PCR

qPCR
 Quiste racemoso: ¿Dónde están las células germinales?
A B

an9-BrdU

C D

tricrómica

¿Qué ocurre con este quiste?

¿Qué factores lo obligan a deshacerse de su escólex?
¿Por qué esa hiperproliferación en las membranas?
Fig 6: Pictures of the racemose cyst (date: january 12th), image
 A B C D

Fig1: Panoramic image of a sample of racemose cyst cul9vated with BrdU. A: DAPI, B: BrdU,
C: OCT-4, E: Merge.
A B C F

Fig2: Magnifica9on (20X-zoom 4), image of posi9ve cells. A: DAPI, B:

BrdU,C: OCT-4, E: Merge.
Identificación de neoblastos mediante marcaje con BrdU y OCT4
T. crassiceps

α-BrdU α-OCT4 Colocalización

DAPI Campo claro
(FITC) (TRITC) (FITC/TRITC/DAPI)

B D F H J

A C E G I
 Resultados preliminares
Aislamiento y purificación de neoblastos de T.solium
(NCC racemosa).
PCR of helminth prolifera+ve genes using cDNA

T. crassiceps cyst

(+) T. solium cyst

(-) no cDNA
qPCR profiles of the same genes

RC1

RC2

RC3

RC4

RC5

RC6
bp bp
cyst racemose

300
notum-1 200 150
100
Z ic 4

300 2 .0

-D D c t
***

X fo ld e x p r e s s io n 2
1 .5

zic-1 200
149 1 .0

0 .5

100
0 .0
C ys t R ace mose P r o g lo t t id s

200
prohibitin-1 113
100

200
chromobox-1 100 103

tho complex-1 500 485

400
300

400
actin 300 298
200
 Conclusions
Racemose cysts express proliferative genes (except RC2).

The proliferative genes are expressed differentially and they are

different from each other.

RC2 may be a ventricular cyst (could be degraded). We need to

check its history.
 Otros resultados: anexos
Anexo 1: Modelo T. crassiceps

- Jus9ficación
-  Antecedentes
-  Métodos
-  Resultados
-  Discusión
-  Conclusiones
-  Referencias

à La estrategia de op9mizar los métodos en T. crassiceps

mientras se recuperaron los cul9vos primarios de T. solium
compensó la pérdida de los mismos y permi9ó alcanzar los
obje9vos del proyecto en el 9empo dispuesto.
 Otros resultados: anexos
Anexo 2: Imágenes confocales

Se aprovechó entrenamiento del Dr. Jaeson Calla en la UC San Diego.

à Las imágenes confirman la

iden9ficación in situ hecha
previamente por
inmunohistoquímica, así
como la u9lidad del
an9cuerpo an9-BrdU para IFI.
 RA03 20x and 63x

DAPI α-BrdU α-OCT4 merge

20x






63x
RT-PCR a par+r de RNA de neoblastos de T. solium

Genes asociados a proliferación celular

 Correla+on between EB staining, MRI findings
and histology in deep and superficial cysts
from PZQ+ABZ 5d group.

strong correla9on between both techniques

and the histopathological findings; the loca9on
and intensity of gadolinium enhancement, as
well as EB staining, reflected the degree and
areas of histologically assessed
inflamma9onmmm
Cangalaya et al., PLoS Negl Trop Dis. 2016 Jul; 10(7): e0004869.
3. Iden9ficación de miRNAs enTaenia solium

Hammond. 2015
Financiamiento:
© by MaIhew Inman, Aka The Oatmeal
Parasites that change the behaviour of
their host
 Gracias
Facultad de Medicina Veterinaria - UNMSM
The Cys+cercosis Working Group in Peru Eloy Gonzales, Juan Calcina,
Ted Nash - NIAID-NIH Gianfranco Arroyo
Siddhartha Mahanty - NIAID-NIH Facultad de Veterinaria y Zootecnia - UPCH
Hugo García – UPCH, INCN Chris9an Pitot, Roy Andrade
Emico González - FMV UNMSM
Bob Gilman - UPCH L. de inmunología parasitaria - UPCH
Silvia Rodríguez, Yesenia Cas9llo
LIPN -UPCH /
NIAID-NIH Centro de Salud Global UPCH - Tumbes
Aymé Yupari Jaeson Calla Viterbo Ayvar, Ricardo Gamboa,
Beatriz García Juan Blume Luz M. Moyano
Carla Cangalaya José Maravi Otros
Cris+na Guerra Laura Kahn Javier Bustos (INCN)
Renzo Gu9érrez Luis Herrera Holger Mayta (UPCH)
Enrique Negreiros Miguel A Orrego
Gabriel Sevillano Pamela Pacheco

Beca de Esrmulo 2014: Dr. Francisco Tejada
Premio Porturas
Neurocys9cercosis lab:
Facultad de Ciencias y Filoso‚a-UPCH / NIAID-NIH

Ted Nash

Siddhartha Mahanty
Gracias!
¿… preguntas?
Inves9gación básica: un lujo
imprescindible

V. Bush, Science: the Endless Fron9er (1945)