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2.
Instrumentación
de microscopía óptica
2. Instrumentación de microscopía óptica
Lentes
Un medio transparente
limitado por dos
superficies
curvas
Lentes
Diferente curvatura
Lentes
Diferente curvatura
Lentes
Diferente curvatura
Lentes
Diferente índice de refracción
Lentes
Diferente índice de refracción
Lentes
Distancia focal:
El punto de convergencia de los rayos refractados cuando los
rayos incidentes provienen de una fuente tan lejana que
pueden considerarse paralelos entre sí.
Distancia
focal
Lentes positivas (convergentes)

Enfocan los rayos paralelos en un punto detrás de la lente
Biconvexa Plano-convexa Menisco
Lentes negativas (cóncavas)
Bicóncava Plano-cóncava Menisco


Divergen los rayos de luz

Distancia focal
F
Aberraciones de las lentes
ABERRACIÓN:
Imperfección de un sistema óptico que

produce una imagen defectuosa, deficiente
en nitidez o en su semejanza al objeto.
Tipos de aberraciones
Aberraciones geométricas Aberraciones cromáticas
● Aberración esférica ● De posición

● Astigmatismo ● De magnitud
● Coma
● Distorsión
● Curvatura de campo
Aberración esférica
Los rayos que atraviesan la lente cerca de sus extremos
convergen en un punto más cercano a la lente que los que
cruzan por el centro.
Causas:
● Daños en el objetivo, grasa de los dedos y restos de aceite de
inmersión en la lente frontal del objetivo.
● Cubreobjetos de espesor o índice de refracción inadecuado.
● Longitud de tubo incorrecta.
● Medio de montaje inadecuado.
● Espesor excesivo de la muestra.
Corrección:
● Combinación de lentes convergentes y divergentes con

aberraciones esféricas opuestas.
● Insertando diafragmas fijos en el objetivo reduciendo el
campo visual a la región central de la imagen.
Astigmatismo
Las líneas verticales y horizontales se enfocan en dos
puntos distintos del eje óptico.
Punto de enfoque de las líneas verticales
Punto de enfoque de las líneas horizontales
Punto objeto
Coma
Diferentes zonas circulares concéntricas de la lente
proporcionan aumentos distintos a una imagen desplazada
del eje.
Imagen
Punto objeto
Distorsión
La imagen aparece deformada a causa de un incremento o
descenso gradual desde el centro hasta el contorno. Las
líneas rectas aparecen curvadas.
Se produce en lentes a las que se les pone un diafragma.
Imagen normal Distorsión de cojín Distorsión de barril

Curvatura de campo
La lente enfoca una superficie plana del objeto como si
fuese esférica.
Cuando están enfocados los bordes del objeto no lo está el
centro y al revés.
El centro y los límites de la imagen se enfocan a distancias
distintas.
Aberración cromática de posición
Los distintos colores o longitudes de onda de la luz se

enfocan a diferentes distancias de la lente.
La imagen aparece rodeada de anillos con variedad de
colores según el enfoque.
λ azul < λ verde < λ rojo

Aberración cromática de magnitud
Los rayos de luz de un determinado color se proyectan

con más aumentos que los rayos de luz de otro color.
Aberración cromática
CORRECCIÓN:
● Utilizar una fuente de luz monocromática.
● Introducir un sistema de filtros que solo dejen pasar

unas pocas longitudes de onda.
● Sustituir la lente simple por un doblete de lentes

combinando distintos tipos con los índices de refracción
y dispersión adecuados.
Descripción del microscopio óptico

Partes mecánicas:
Son las partes y dispositivos que tienen la

misión de soportar los componentes ópticos a
la vez que facilitan las manipulaciones y el
uso del instrumento.

Tubo
(binocular) Columna
o brazo
Revólver
Platina
Movimiento
(foco)
Pie

Objetivo:

Objetivo:
● Es el sistema óptico convergente colocado en
el extremo correspondiente al objeto.
● La lente o conjunto de lentes que se sitúan
más cerca de la preparación.
● Su finalidad es formar una imagen real de
ésta que será observada a través de un ocular
o recogida en una pantalla.

Objetivo:
Sus principales características son
● Aumento
● Apertura numérica
Descripción del microscopio óptico: objetivo

Aumento:
Aumento total = Aumento objetivo x aumento ocular
Generalmente ocular = 10X

Por ejemplo, para un objetivo de 100X
Aumento total = 100 x 10 = 1000 aumentos


Aumento:
¿Qué significa un aumento de 1000X?
¡Hay que poner siempre la escala en las imágenes!


● Ángulo de apertura:
Es el formado por los rayos extremos que
intervienen en la imagen.
Objetivo
2α
Muestra

● Apertura numérica:
Es una medida de la capacidad para recoger
la luz y resolver detalles pequeños a una
distancia objeto fija.
Apertura numérica, A.N. = n x sen α
n es el índice de refracción del medio

α es el semiángulo de apertura

Apertura numérica:
● Expresa el diámetro del haz luminoso que

puede recoger el objetivo.
● Se entiende que cuantos más rayos

procedentes del objeto entren en la lente para
formar la imagen mejor será la calidad de
ésta, así como su definición.

Apertura numérica:
A.N. = n x sen α
●
Se puede aumentar α. Pero llegar al máximo
teórico de 90º se ve limitado en la práctica.
● Se puede aumentar n. Mediante líquidos de
inmersión.

● Aumento útil:
Es la relación entre el tamaño de la imagen y
el tamaño del objeto.
Hay un mínimo para que se puedan resolver los detalles

que está en torno a 500 veces la A.N.
Hay un máximo más allá del cual no se obtiene más
resolución ni más información y está en torno a 1000
veces la A.N., son aumentos vacíos.

● Poder de resolución:
El inverso de la mínima distancia entre dos
puntos que todavía se entienden como
separados, d.
Se define en relación a la A.N. y a λ.
d = 0,61λ / A.N.

Poder de resolución: d = 0,61λ / A.N.
Plan-apo (inmersión) 100 X - A.N.=1,40
● Luz azul (400 nm)

d = 0,61*400/1,40 = 174 nm
● Luz roja (650 nm)

d = 0,61*650/1,40 = 283 nm

● Distancia de trabajo:
La distancia entre la lente frontal del objetivo y
la muestra cuando ésta está enfocada.
Objetivo
Distancia de trabajo (WD)
Muestra

Distancia de trabajo elevada: Distancia de trabajo corta:
Baja resolución Alta resolución
d = 0,61λ / A.N.
A.N. = n x sen α

Tipos de objetivos según las correcciones:
● Acromáticos: corregida la a. cromática para rojo y azul, y
la esférica para verde.
● Semiapocromáticos (fluorita): corregida la a. cromática y
esférica para 2 ó 3 colores.
● Apocromáticos: corrección cromática y esférica para 4 ó
más colores.
● De campo plano: curvatura de campo muy corregida.

Tipos de objetivos según las correcciones:
A. esférica A. cromática Curv. campo
Acromáticos 1 color 2 color no
Plan-acromáticos 1 color 2 color sí
Fluorita 2 – 3 colores 2 – 3 colores no
Plan-fluorita 3 – 4 colores 2 – 4 colores sí
Plan-apocromát. 3 – 4 colores 4 – 5 colores sí


Indicaciones en el exterior de los objetivos:
Fabricante
Correcciones
Apertura numérica
Aumentos
Distancia de trabajo
Óptica corregida a infinito
Sin cubreobjetos



Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)
tubo

Longitud de tubo: Óptica corregida a infinito (ICS)
La distancia imagen se sitúa en el infinito, es decir, los

rayos de luz que salen del objetivo son tan paralelos
que parece que la imagen se forme en el infinito.
Se coloca estratégicamente una lente de tubo dentro

del cuerpo del tubo entre el objetivo y el ocular para
producir la imagen intermedia.
Descripción del microscopio óptico: (ICS)

Óptica corregida a infinito
ocular
objeto
objetivo lente intermedia
Óptica finita
ocular
objeto
objetivo
Sistemas de iluminación:
● Condensadora
● Fuentes de iluminación
Condensadora:
Es el sistema óptico convergente situado

antes de la platina encargado de iluminar
adecuadamente el objeto para obtener el
máximo rendimiento del objetivo.
Descripción del m. óptico: condensadora

Cuando la A.N. de iluminación es casi igual a la A.N.
máxima del objetivo se disminuye el contraste.
En las muestras de contraste alto con detalles diminutos

se debería iluminar la A.N. del objetivo por completo.
Pero si la muestra tiene poco contraste se debe

disminuir el cono de iluminación de la A.N. del objetivo
para impedir que la imagen quede borrosa debido al
poco contraste.
Descripción del m. óptico: condensadora

El cono de luz que ilumina la A.N. de objetivo se controla
por medio de un diafragma de iris.
Si el diafragma está muy cerrado la imagen está

demasiado contrastada y se pierde resolución.
Pero si está muy abierto la imagen sufre alteraciones a
causa de la difracción.
La posición correcta será cerrar hasta aproximadamente

2/3 del campo de visión cuando se observa el plano
focal posterior de la lente objetivo.

Fuentes de iluminación:
● Luz natural: ya no se usa.
● Lámpara incandescente: la más usada
● Lámpara de arco: iluminación intensa y sin estructura
● Lámpara de descarga: vapor de mercurio

Tipos de iluminación:
● Iluminación crítica
● Iluminación de Köhler
Iluminación crítica:
Se forma la imagen de la fuente luminosa sobre

la imagen a observar, en el plano de la muestra.
● Iluminación muy brillante pero desigual con

puntos de diferente brillo.
Iluminación de Köhler:
Se ilumina estricta y únicamente la parte observada

del objeto.
Proporciona una intensidad suficiente y uniforme.
● Evita la luz parásita que se produce en las partes

iluminadas y no observadas de la muestra.
Mantenimiento, limpieza y conservación

del microscopio óptico

Cualquier componente es INCREÍBLEMENTE CARO
Enemigos primordiales del microscopio:

● Polvo ¡¡Enemigo número 1!!
● Agua y humedad ambiental
● Grasa procedente de los dedos o del propio equipo
● Restos de medios de inmersión, medios de montaje y
medios de cultivo
● Ambientes químicamente agresivos
● Sol directo y fuentes de calor

Normas básicas:
● Cuando se hace mantenimiento de instrumentación hay

que invertir paciencia, no energía.
● Siempre es mejor prevenir que reparar.
● El microscopio óptico es un instrumento de precisión.
● Hay que trabajar sobre una superficie estable,
absolutamente limpia y con buena iluminación.
● Usar la herramienta del tamaño apropiado.
● No forzar nunca ningún elemento mecánico ni óptico
cuando se procede a desmontar y montar.

● Cuando se retira cualquier elemento óptico o mecánico
que deje abierto el camino óptico, es imprescindible cegar
inmediatamente el hueco que queda libre con la ayuda de
una tapa ciega, o bolsa de plástico y cinta adhesiva con
el fin de evitar la entrada de polvo y suciedad.
● No dejar nunca los tubos oculares o alguna posición del
portaobjetivos vacío, colocar un tapón ciego.
● Cuando se desmonta un objetivo, mientras una mano lo
desenrosca la otra lo sujeta.
● Cuando se monta un elemento óptico, no retirar la mano
hasta que no tengamos la absoluta certeza de que ha
quedado bien sujeto.

● Está desaconsejado desarmar los elementos de los
conjuntos ópticos (ocular, objetivo, condensador, …) si no
es absolutamente imprescindible, puesto que se pueden
producir desajustes irreversibles en el posicionamiento de
las lentes, ya que, en muchos casos, han sido centradas
en fábrica por medio de banco óptico, y hacerlos reajustar
es caro.
Si se tuviera forzosamente que desarmar, es
recomendable apuntar la posición, el orden y la
orientación de todos los elementos ópticos y de las
respectivas piezas de sujeción.

● Las ópticas y demás piezas que se vayan desmontando
hay que dejarlas en lugar seguro (cajas, estuches, …)
para evitar que rueden y caigan al suelo, depositándolas
en posición vertical y con el extremo que queda en el
interior del camino óptico protegido del polvo.
● Si hay que reparar cualquier elemento situado en la base
del microscopio y para ello hay que tumbarlo o darle la
vuelta, primero es necesario retirar todos los elementos
que se sostienen por gravedad (filtros, oculares, …).
● En ningún caso tocar el interior de los caminos ópticos
con los dedos, puesto que éstos suelen tener un
tratamiento superficial de color negro mate, y cualquier
huella de los dedos podría ocasionar brillos no deseados.

● Evitar golpear la lente frontal de los objetivos contra la
preparación que se observa o contra cualquier otro
objeto. Esto podría producir rayas o señales sobre la
lente, fisuras en el cemento que fija la lente, e incluso su
desplazamiento hacia atrás. Si se fisura el cemento se
corre el riesgo de que entren líquidos como los medios de
inmersión o de montaje.
● Los objetivos de inmersión hay que limpiarlos
inmediatamente al finalizar la sesión de observación.

● Los restos de aceite o de otros medios de inmersión,
además de retener suciedad, pueden acabar
introduciéndose por capilaridad entre la montura y la lente
frontal del objetivo.
● Al acabar la observación, limpiar el microscopio.
● Siempre que no se esté utilizando el microscopio, debe
estar completamente tapado por medio de una funda.
Las fundas de plástico son un buen aliado para proteger
los microscopios.

Electrónica, fuentes de alimentación y sistemas de
iluminación:
Retirar el polvo de las ranuras de ventilación.

-Soplando con una pera de goma
-Aire o nitrógeno a presión
-Aspiración
Ayudándose de un pincel limpio, seco y libre de grasa.

Limpieza de la lámpara:
● Alta temperatura, refrigeración por aire = polvo adherido

Dejar enfriar
Guantes de algodón
Retirar y limpiar con etanol
Suciedad carbonizada, usar amoníaco

Sustitución de la lámpara:
● Respetar la duración máxima de las lámparas de vapor

de mercurio
Se limpia antes de colocarla como si fuese una lámpara
usada

Parte mecánica:
Retirar el polvo superficial con un trapo fino.
En caso de vertido accidental de medios de montaje

líquidos o medios de inmersión, etc.
● Absorber el líquido con papel
● Disolver y limpiar los restos con agua destilada
● Secar bien

Parte óptica:
Retirar el polvo soplando con pera, nitrógeno o aire.
Limpiar en húmedo con papel óptico o trapo suave

humedecido en etanol, cristasol, isopropanol... con
movimiento circular.
Secar.

● En aquellos microscopios en que trabajan varias
personas la limpieza periódica de los oculares
contribuye a minimizar el riesgo de contraer conjuntivitis.
● Las huellas, los restos de medios de inclusión o de

montaje y el polvo presentes en el objetivo, sean del tipo
que sean, ocasionan una pérdida de resolución y
contraste debido a que dispersan la luz, dando la
sensación de que se tiene una aberración de esfericidad
elevada.
¡No usar nunca benceno, tolueno o xileno!
Son disolventes altamente tóxicos y muy agresivos frente

a pinturas y cemento de unión.

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Lentes positivas (convergentes)

Lentes negativas (cóncavas)

Bicóncava Plano-cóncava Menisco

Lentes negativas (cóncavas)

Lentes negativas (cóncavas)

Aberraciones de las lentes

Imperfección de un sistema óptico que

● Aberración esférica ● De posición

● Combinación de lentes convergentes y divergentes con

Punto de enfoque de las líneas verticales

Punto de enfoque de las líneas horizontales

Imagen normal Distorsión de cojín Distorsión de barril

Aberración cromática de posición

Los distintos colores o longitudes de onda de la luz se

λ azul < λ verde < λ rojo

Aberración cromática de magnitud

Los rayos de luz de un determinado color se proyectan

● Utilizar una fuente de luz monocromática.

● Introducir un sistema de filtros que solo dejen pasar

● Sustituir la lente simple por un doblete de lentes

Descripción del microscopio óptico

Son las partes y dispositivos que tienen la

Descripción del microscopio óptico

Descripción del microscopio óptico

Descripción del microscopio óptico

Descripción del microscopio óptico

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Aumento total = Aumento objetivo x aumento ocular

Generalmente ocular = 10X

Aumento total = 100 x 10 = 1000 aumentos

Descripción del microscopio óptico: objetivo

¡Hay que poner siempre la escala en las imágenes!

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Apertura numérica, A.N. = n x sen α

n es el índice de refracción del medio

Descripción del microscopio óptico: objetivo

● Expresa el diámetro del haz luminoso que

● Se entiende que cuantos más rayos

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Hay un mínimo para que se puedan resolver los detalles

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Se define en relación a la A.N. y a λ.

Descripción del microscopio óptico: objetivo

● Luz azul (400 nm)

● Luz roja (650 nm)

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Distancia de trabajo (WD)

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Plan-acromáticos 1 color 2 color sí

Fluorita 2 – 3 colores 2 – 3 colores no

Plan-fluorita 3 – 4 colores 2 – 4 colores sí

Plan-apocromát. 3 – 4 colores 4 – 5 colores sí

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico: objetivo

Descripción del microscopio óptico

Descripción del microscopio óptico

La distancia imagen se sitúa en el infinito, es decir, los