Rev. de Med. E. G. Navarra VI: 145.

1962

DEPART.H!ENTO DE BIOQUIM!CA
DE LA F~CULTAD DE 1!EDICil\A DEL E. G. N.

Determinación de creatinina en líquidos biológicos

José M. ª Macarulla

RESUMEN

Se modifica la técnica de determinación d~ creatinina en el sentido de

aislar la creatinina y creatina de la muestra previamente al análisis colori-
métrico.
La muestra problema, al igual que los patrones, se pasa por una columna
de resina intercambiadora de cationes en forma ácida y se eluye creatina y
creatinina en una cantidad medida de NaOH. Se dan detalles de la técnica
y se discute ampliamente la validez del método con múltiples ensayos en
todas las circunstancias que pudieran afectar a los resultados.

A pesar de que se han desarrollado mo- car la reaccron fotocolorimétrica, elimi-

dernamente muchos métodos para la de-
terminación de la creatinina y de la crea-
tina 1 • 3• 4 , la reacción de Jaffe 2 • 6 , por su
gran sencillez, precisión y sensibilidad si-
gue ocupando un lugar preferente. Sin
embargo esta reacción puede ser inter-
feri:da por la presencia de sustancias re-
ductoras, cromógenas o precipitables
-tales como glucosa, cuerpos cetónicos,
pigmentos urinarios, hemoglobina, albú-
mina ... , etc.- que a menudo forman par-
te de la orina u otros líquidos biológicos.
Tomando como base de nuestro mé-
todo analítico esta reacción hemos desa-
rrollado una técnica simple de aislamien-
to previo de la creatinina, antes de apli-
nando de esta forma las interferencias
apuntadas y sin complicar sensiblemente
las operaciones. Con esta mejora, el mé-
todo resulta utilizable de manera sistemá-
tica y universal en el análisis diario de
la clínica.
Esencialmente consiste en la fijación
de la creatinina y creatina, junto con los
aminoácidos y otros cationes, sobre una
resina de intercambio catiónico. Mediante
un lavado con agua se eliminan las sus-
tancias neutras -glucosa, acetona, urea,
pigmentos ... - que pudieran interferir.
A continuación se eluye con NaOH ob-
teniendo una disolución de creatinina a
punto para la reacción colorimétrica.
146 JOSE '.\!." '.IJ.\CARULLA Vol. VI

Los resultados que se obtienen de es-

ta manera no son afectados por la pre-
sencia de glucosa, ni de cuerpos cetóni-
cos y no se requiere la precipitación pre- 3 mi
via de las proteínas tanto en orina como
en plasma, por lo que, en presencia de
estas sustancias, resulta más simple que
2 mf
los métodos habituales. Asimismo permi-
te concentrar la Creatinina y Creatina
existentes en un volumen grande de mues-
tra sin necesidad de evaporación.
1 mf

"Resina -
MATERIAL Y MÉTODOS

Los reactivos y materiales utilizados " ,

Succ;on
son los siguientes:
REACTIVOS
NaOH IN
CIH 4N
Acido pícrico saturado
Picrato alcalino
10 mi Ac. pícrico saturado
2 mi NaOH 10 %
1
1
1
Resina Sulfónica Ion-X
(tipo Dowex-50)
Agua Bidestilada
Creatinina 1 gr/L; 0,25 gr,'L; y 20 mgr/L.
Creatinina 1 gr/L

MATERIAL
Fotocolorímetro "Spectronic" 520 mµ
Matraces aforados de 100 mi.
Matraz)
a}oT o do
\
Fig. 1.-Disposición de la columna de resina
Tubos de centrífuga graduados hasta 15 mi. de inL~rcambio catiónico, para el aislamiento
Pipetas graduadas y aforadas d= la cr~atinina
Baño de agua a 30° C
Material corriente de Laboratorio

l. Montaje de la cohnmma de resina. de la creatmrna. En efecto, si hay poca

Hemos elegido como tubo de vidrio
graduado la parte superior de una bureta
de 10 ml, cuyo diámetro interno es de
4-5 mm. Tal como se indica en la fig. l,
se coloca dentro del tubo estirado a la
llama un filtro de lana de vidrio, encima
del cual se introduce resina sulfónica en
suspensión acuosa, hasta ocupar en repo-
so algo más de 1 ml. La cantidad óptima
de resina y la relación grosor-altura son
resultado de una serie de ensayos para
determinar el grado de fijación y elución
resina o la relación grosor-altura es gran-
de, parte de la creatinina queda sin fi-
jar y se pierde con los líquidos previos de
lavado. Si hay demasiada resina o la
relación grosor-altura es pequeña, se ne-
cesita mayor volumen de sosa para la elu-
ción completa. En otro artículo nues-
tro 4 publicamos la preparación de una
columna análoga para aislar aminoácidos.
La parte inferior de la columna y una
aguja de inyecciones convenientemente
doblada atraviesan un tapón de politeno
adaptable directamente al cuello esmeri-
Junio 1062
lado de los matraces de 100 ml. El mismo
tapón con una arandela de goma es adap-
table a la boca de los tubos de centrífu-
ga. Mediante una trompa de agua y una
llave de paso se puede someter al líqui-
do de la columna a un vacío regulable 4 •
2. Lavados de activación de la resina.
La resina nueva debe acondicionarse
mediante una serie de lavados alternan-
tes con ácidos y bases para separar las
impurezas solubles y dejarla finalmente
en forma activa. A continuación indica-
mos las cantidades de reactivos y ve-
locidad de lavado que han resultado me-
jores para activar la resina. En el acon-
dicionamiento previo se repite varias ve-
ces el lavado activador (A), que esque-
matizamos a continuación.
3. Aislamiento de la Creatinina de la
muestra.
La cantidad de muestra que se emplea
para el análisis dependerá de la concen-
tración de creatinina y de la sensibilidad
del fotocolorímetro. En nuestro trabajo
ordinario, tomamos 0,5 ml de orina y
2 ml de plasma para cuyas cantidades
se han calibrado las curvas patrón. De
tomar otros volúmenes hay que corregir
los resultados de acuerdo con la diluc:ón
efectuada.
Las operaciones a realizar para el ais-
lamiento de la creatinina en orina vie-
nen dadas en la siguiente marcha ana-
lítica (B).
Como es fácil deducir de estos datos las
operaciones de aislamiento de la creati-
nina duran unos 22 minutos pudiendo rea-
lizarse varios análisis al mismo tiempo.
4. Reacciones colorimétricas.
Para estudiar la analogía del método
que emplea resina para el aislamiento
previo de la creatinina con el método
clásico de Folin 1 , se han realizado com-
14'7
parativamente las reacciones colorimétri-
cas procurando guardar el máximo para-
lelismo. Para ello en matrac·es aforados
de 100 ml se colocan los reactivos que
se indican y en el orden anotado en el
esquema (C).
5. Construcción de las curvas patrón.
Aplicamos las reacciones colorimétri-
cas con y sin resina empleando sucesiva-
mente: O, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ml de disolución
de creatinina de 0,25 gr /1 obteniendo
1
1001
º" 3
Creatt"nÍnlll j-/I
Fig. 2.--Reacción colorimétrica para determi-
nar creatinina en 0,5 mi de orina. Las curvas
con resina (C. R.) y sin resina (S. R.) corres-
ponden respectivamente al empleo o no de la
resina
una gama de coloraciones que leídas en
el fotocolorímetro nos permiten dibujar
las curvas: con resina (C.R.) y sin resina
(S.R.) de la fig. 2.
Observamos que las curvas de la fig. 2
aunque no idénticas son próximas y pa-
ralelas, condiciones necesarias para su
utilización cuantitativa. La r:::acción co-
lorimétrica empleando resina, da lecturas
menores en un 4 % no teniendo esto nin-
guna trascendencia puesto que tanto el
148 JOSE ~! " ~!ACARTJLLA Vol. VI

LAVADO ACTIV ADOR DE LA RESINA (A)

Velocidad
Volumen en mi/minuto Tiempo aprox.
Orden Líquido de lavado en mi. 1 mi "" 25 gotas en minutos

Na OH lN ... 5 2 2,5
2 Agua Bid estilada ... 10 5 2
3 CIH 4N ... ... ... ... 6 2 3
4 Agua Bid estilada ... 10 5 2

MARCHA ANALITICA PARA EL AISLAMIENTO

DE LA CREA TININA EN ORINA (B)

l. Se adapta la columna de resina a un matraz para regular la velocidad de paso de lí

quidos según se indica en la fig. 1.
2. Se somete la resina a un lavado activador (A).
3. Se vierte sobre la resina húmeda -hay 0,1 mi de agua sobrenadante- 0,5 mi de orina
y se dejan pasar gota a gota.
4. Se lava la resina con 10 mi de agua bidestilada, primero lentamente, después a razón
de 5 mi/minuto, para separar los compuestos neutros y ácidos.
5. Se cambia la columna de un matraz aforado limpio para recoger la disolución que con-
tendrá la Creatinina.
6. Se pasan 8 mi de NaOH lN a la velocidad de 1 mi/minuto y se recogen en el aforado
para la reacción colorimétrica.

REACCIONES COLORIMETRICAS (C)

a) Reacción de color sin resina b) Reacción de color con resina

l. Muestra de creatinina l. La misma muestra de creatinina fi-
(un patrón ó 0,5 mi de orina) jada por resina eluída
2. 20 mi de ácido pícrico saturado 2. 20 ml de ácido pícrico saturado
3. 4 mi de NaOH IN
(común a ambos)
Calentar a baño María 30° C, durante 10 minutos
Dejar enfriar a 25° C y aforar a 100 mi
Leer la absorción en un fotocolorímetro con filtro verde (o Spectronic
520 mlJ.). Tomando como blanco la disolución de 20 mi de ácido pícrico
y 4 de NaOH lN aforada a 100 ml.

a) Reacción de color sin resina. b) Reacción de color con resina.

l. Verter la muestra de creatinina en l. Muestra de creatinina recogida en
un tubo de centrífuga de 15 mi. un tubo de centrífuga de 15 mi,
conteniendo 1 ml de ClH 6N.
(Común a ambos) , Neutralizar con ácido o base según
convenga.
Aforar con agua a 10 mi.
Añadir 5 ml de picrato alcalino.
Colocar en baño de agua a 30° C durante 10 minutos.
Fotocolorímetro (Spectronic, 520 m,u), tomando como blanco la disolución
de 5 mi de picraco alcalino y 10 ml de agua bidestilada.
Junio 1962 <_:HE-'\TIN!'.\1A EN L!QLTIDOS BIOLOCICOS i49

patrón como la muestra sufren la misma
desviación.
Una vez hechas las curvas por medio
de dos series de lecturas, son utilizables
hasta que se renueven los reactivos.
6. Modo de operar con una orina
!izan las reacciones indicadas en el es-
quema D.
El resultado de la lectura fotocolori-
métrica llevada a la fig. 3, da por interpo-
lación gráfica la concentración de Creati-
nina buscada.
Discusiones y resultados.

Con 0,5 mi de orina se realiza el mis- Antes de aceptar la plena validez y

mo tratamiento indicado para el patrón. aplicabilidad del método hemos realiza-
El resultado de la lectura fotocolorimé-
trica, se lleva al gráfico, obteniendo por
interpolación la concentración de crea-
tinina de la muestra.

7. Determinación de la Creatinina en

Debido a las bajas concentraciones de

creatinina en plasma es conveniente em-
plear mayor volumen de muestra, compa-
rar con patrones menos concentrados y
10
disminuir la dilución final.
La fijación y elución de creatinina la
realizamos análogamente con la única di-
ferencia de conectar la columna de resina
a un tubo de centrífuga graduado de 15 10 10 30 40

ml en lugar de un matraz de 100 ml.
En el esquema (D) indicaremos la mar-
cha analítica para construir la curva pa-
trón de creatinina en plasma. Las canti-
dades de disolución de creatinina de 20
mg/l a emplear son las siguientes: O; 0,5;
l; 2; 3 y 4 mL
Con los resultados de esta reacción co-
lorimétrica obtenemos las curvas de la
fig. 3. Para ellas tienen vigencia las mis-
mas observaciones realizadas anterior-
mente con la tig. 2.
Al tratarse de concentraciones más ba-
jas se observa mayor fluctuación en los
resultados. por lo tanto la curva patrón
conviene que sea promedio d·e 4 series de
determinaciones concordantes.
Para el análisis de creatinina en plas-
ma, se toman 2 ml de muestra, se intro-
ducen en una columna de resina y se rea-
8
Creol"/mna ":j./l
Fig. 3.-Reacciones colorimétricas para la de-
terminación de creatinina en 2 ml de plasma
o suero. Las curvas con resina (C. R.) y sin
resina (S. R.) corresponden respectivamenfo al
empleo o no de la resina
do las comprobaciones cualitativas y
cuantitativas correspondientes que resu-
mimos a continuación.
1) La fijación por completo de la
creatinina en la columna de resina, y elu-
ción total de la fracción alcalina, que pos-
teriormente utilizamos para el análisis.
2) La posible alterabilidad de la crea-
tinina dependiente de la manipulación.
3) La posibilidad de formarse creati-
nina a partir de otras sustancias, princi-
palmente creatina.
150 JOSE M.º MACAHTJLLÁ \loL VI

T A B L A l
Distribución de la Creatinina patrón (léase texto)
Lectura en e]
Fotocolorimetro Concentración de Creatinina
Líquidos 520 (en ",' 1 dd total}

1) Líquidos previos de lavado ... 0,6 0,9

2) Fracción alcalina útil (8 ml
NaOH 1 N) 65 95
3) exceso de JO ml de Na OH 1N ... 0,7 1
4) Creatinina testigo (sin pasar por
resina) 67,5 100

4) La interferencia de otras sustancias c10n al lavar la resina con un exceso de

en la reacción colorimétrica.
5) Las modificaciones en la intensidad
inherente al propio método.
Para determinar el carácter cuantitati-
vo de la fijación y elución de la creati-
nina -reseñado en el apartado 1- hemos
tomado dos muestras iguales de creatini-
na patrón. A la primera le hemos aplica-
do directamente la reacción calorimétri-
ca clásica (C-a). Hemos vertido la segun-
da sobre la resina activa y hemos recogi-
do cuantitatinmente tres fracciones dis-
tintas.
1) Todos los líquidos de lavado pre-
vios a la elución con NaOH l N.
2) La fracción alcalina obtenida al
pasar por la resina los primeros 8 ml de
NaOH IN.
3) La fracción obtenida a continua-
10 ml de NaOH lN.
Hemos aplicado la misma reacción ca-
lorimétrica a estas tres fracciones. reco-
giendo los resultados en la T;i.bla I.
De la tabla se deduce que recogemos
en la fracción útil un 95 ',X, de la Creati-
nina que perdemos eL los líquidos
del lavado por falta de fijación un 1 %
y que queda sin eludir otro l % que re-
sultará eliminado en otros lavados pos-
teriores.
La explicación lógica del 3 % de Crea-
tinina que queda sin localizar hay que
buscarla o bien en su posible destrucción
(apartado 2) o en la disminución de la
intensidad de la reacción calorimétrica
(apartados 4 y 5).
Para investigar los apartados 2 y 3 so-
bre posible i nterconversión entre creati-
na y creatinina en el trabajo normal y en

T A B L I
Interconversión de Creatini11a y Creatina
Absorciún Concentración
Líquidos en Fotocolodmetro en Creatinina

l) Crea tina sin pasar por resina .. 1,6 2,3

2) Creatina sin pasar por resina.
hervida 12 17,l
3) Creatina pasada por resina:
a) líquidos previos del lavado ... 0,6 0,85
b) fracción alcalina útil (8 ml
NaOH lN) 3,6 5,16
c) exceso de 10 ml de NaOH lN. 0,4 0,57
d) fracción alcalina útil, hervida. 18,1 24,4
4) Creatinina patrón, hervida 66,8 98
5) Crnatinina patrón, testigo 67,5 100
junio 1962 UU.AT!NJNA EN LH,/UIDOS BIOLOGICOS
condiciones forzadas, hemos hervido du-
rante 30 minutos las disoluciones ácidas
de creatinina y creatina, que figuran en
la Tabla II y cuyas reacciones calorimé-
tricas se han realizado por el método clá-
sico (C-a).
De la tabla II podemos deducir al-
gunas consecuencias muy importantes:
a) La cantidad de creatinina destruí-
da, al hervirla en medio ácido, es muy pe-
queña. En consecuencia el paso por la
resina no destruye prácticamente la crea-
tinina.
b) La creatina no da -como sa-
bemos- la reacción de Jaffe, y al ser
hervida tiende a transformarse en creati-
nina.
c) La creatinina se fija y se eluye en
la resina de modo idéntico a como lo ha-
ce la creatinina, por esta causa el méto-
do que publicamos es muy útil para de-
terminar también creatinina. Sin embar-
go, es de advertir que el paso por la
resina favorece el que una pequeña parte
de creatina se transforma en creatinina.
Como la concentración fisiológica de
creatina es muy baja, este efecto no re-
percute en los resultados habituales de 12
creatinina.
Respecto a otras sustancias que pue-
dieran dar la reacción de J affe, eliminada
la glucosa, cuerpos cetónicos, Ac. ascor-
bico, etc., (apartado 5) por no ser de na-
turaleza catiónica, no queda ya práctica-
mente ninguna en concentración aprecia-
T A B L A
Efecto del cloruro sódico sobre la intensidad de la rearción colorimétrica (C-a)
de la Creatinina patrón
Creatinina patrón Ab~orcíón
(en ml) {n 520 m,u.
o o
0,5 8,9
1 18,3
2 35
3 52
4 67,5
151
ble. En cuanto a la posibilidad de inter-
ferencias de otras sustancias en la reac-
ción calorimétrica nos interesa especial -
mente el efecto de la cantidad de cloruro
sódico e hidróxido sódico que pudi·eran
variar como consecuencia de la neutrali-
zación -método de creatinina en plas·
ma- y por efecto de la distinta propor-
ción de cationes: método de creatinina en
la orina.
Forzando las condiciones hemos ensa-
yado el efecto de estos dos compuestos
y tabulado los resultados (Tablas III
y IV).
La presencia de cantidades notables
de cloruro sódico disminuye ligeramente
la intensidad de la reacción calorimétrica.
En la tabla III comparamos la reacción
calorimétrica obtenida con Creatinina pa-
trón de 0,25 gr /L en ausencia y en pre-
sencia de cloruro sódico.
Claramente deducimos que hay una li-
gera disminución en la intensidad calori-
métrica que puede, juntamente con el ex-
ceso de NaOH que veremos a continua-
ción, justificar la aparente pérdida de un
3 % de creatinina que antes habíamos
observado.
Para determinar la influencia de la can-
tidad de NaOH sobre la reacción de Jaf-
fe hemos ensayado esta reacción con 4 ml
de creatinina 0,25 gr/L y 20 ml de áci-
do pícrico saturado puro añadiendo las
cantidades de NaOH IN que anotamos
en la tabla IV.
I I I
Absorción
(n 520 mu con 4 mi
sin CINa) de CINa 2N)
o
8,5
17,4
33,9
50
66
152 JOSE M." MACM{ULLA
AB V CONCLUSIONES
Efecto del NaOH sobre la i11te11sidad de
reacción de Jaffe (véase texto)
NaOH IN Absorción
ailadida (en mi)
2 64,7
3 66,4
4 68
5 68,2
6 68,6
Observamos que una vez puestos los
4 ml de NaOH que la
un exceso ulterior de NaOH incrementa
sólo muy ligeramente la lectura colorimé-
trica.
Como nuestro método coloca aproxi-
madamente de 4 a 5 ml efectivos de
NaOH, la lectura no viene afectada por
la diferente salinidad fisiológica de la
muestra.
La tabla II nos ilustra claramente la
posibilidad de aplicar nuestro método al
aislamiento previo de la creatina. No
hemos desarrollado este aspecto porque
no era nuestro objetivo y porque en la
bibliografía 3 ha sido aplicado moderna-
mente.
The tecnique for the creatinine determina-
tion is modified by isolating this compound
from the sample. After this is done, the slightly
modified Jaffe's reaction is applied.
The sample problem -urine, serum, plas-
ma- is passed. previous to the analysis through
a cation-exchange resin in acid form. Both
creatinine and creatine are bothretained by the
resin. Al! the reducing, cromogenous, or pre-
cipitable substances are eliminated in the wa-
shing of the column, that is, if they are either
inert or anionic: but if they are cationic,
they remain fixed.
VI
En nuestro método no introducimos
ninguna modificación sustancial --sólo
las concentraciones de los
reactivos- en la reacción de Jaffe. Sin
embargo al aislar la creatinina antes de
proceder a su análisis eliminamos de mo-
do sistemático todas las sustancias reduc-
toras, precipitables o cromógenas que
dieran interferir, por lo que los
dos ganan en seguridad y precisión. La
pequeña que supone este
aislamiento previo viene compensada por
tratarse de un método único y universal
de eliminar cualquier interferencia. De
todas formas el tiempo de análisis es infe-
ferior al que se invertiría para ensayar la
presencia de cuerpos cetónicos, glucosa,
etc., antes de aplicar el método clásico.
De esto resulta un método algo más len-
to, pero mucho más seguro.
De nuestros ensayos sobre interferen-
cias de otras sustancías en las reacciones
colorimétricas, deducimos de que no afec-
tan sustancialmente al método el cual se-
rá aplicable sin restricciones en un am-
plísimo margen de casos.
Agradecemos la colaboración técnica a don
Andrés Purroy y doña Mercedes Preciado, de
gran eficacia en la consecución de este trabajo.
The colorimetric determination reveals a
slight loss of creatinine during the fixation and
elution In order to avoid the low
results, to loss of creatinine in the pro-
cess, the standard sample solution are sub-
mitted to the same fixation and elution.
With the results obtained from the standard
sample solutions, a graph is drawn to read
sample problem results.
The technique is described in detail the va-
lidity of the method discussed.
Junio 1962 CllE·\TINJ'iA EC\ LlQUmos BJOLOGICOS 153

BmuocHAFÍA

L CHVERAíN, J. A1111. Phann. fraru;. 16: 5. NAVARRO, S. Técnicas Fotocolorimétricas

413, 1958. aplicadas a la Bioquímica clínica. Mur-
2. FOLIN, o. y H. Wu. j, Biol. Chem. 38: cia, 1961.
81, 1919. <i. PHERS, J. H . ./. Rio/. Chem. 186: 177,
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4. MACARULLA, J. M. R. Esp. Fisiol. 15:
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