Replicación del ADN

 La división celular requiere de la duplicación

del material genético

mitosis

meiosis

mitosis
 Mecanismo general

 La misma estructura del ADN

sugirió un mecanismo de
replicación de la información
◦ Cada hebra sirve como molde
para replicar la complementaria
Propiedades
 Semiconservativa: cada nueva molécula esta
formada por una hebra parental y una recién
sintetizada
◦ Experimentos de Meselson y Stahl
 Bidireccional: Se da hacia ambos lados del sitio de inicio
denominado origen de replicación
 A cada lado de la burbuja de replicación se forma una
horquilla de replicación
 Dirección de la síntesis: 5’ 3’
 Semidiscontinua: Una de las hebras no puede ser
sintetizada de continuo
◦ Consecuencia de la direccionalidad
Replicación en procariotas
 Mecanismo
 Inicio
◦ Reconocimiento de orígenes de replicación.
◦ Separación de hebras.
◦ Posicionamiento de maquinaria transcripcional.

 Elongación
◦ Crecimiento bidireccional de las horquillas de replicación.
◦ Replicación semiconservativa, semidiscontinua, coordinada.

 Terminación
◦ Reconocimiento de señales de terminación.
◦ Desensamble de replisomas.
 ADN polimerasas:
◦ Pol I
◦ Pol II
◦ Pol III (replicasa)
◦ Pol IV y V
 Necesitan 3’ OH libre
Maquinaria enzimática
 ADN polimerasas: Síntesis de ADN
 Primasas: Generación 3’OH libres
 Ligasas: Unión los fragmentos de Okazaki
 Helicasas: Separación de hebras
 Topoisomerasas: Mantenimiento del grado
de superenrollamiento
 SSBs: Mantenimiento de simples hebras
 Inicio
 Reconocimiento del
origen y apertura de las
hebras
 Elongación

 Primasa:
◦ Sintetiza fragmentos de
ARN (cebadores) que
provean los 3’ OH libres
◦ Puede comenzar sin
necesidad de cebador
Replisoma
Terminación
Replicación en eucariotas
  Los mecanismos son similares
 Más de un origen de replicación por cromosoma
 Es más complejo
Proteins Functions

RPA Single-stranded DNA binding; stimulates DNA polymerases;

facilitates helicase loading
PCNA Stimulates DNA polymerases and RFC ATPase
RFC DNA-dependent ATPase; primer-template DNA binding;
stimulates DNA polymerases; PCNA loading
Pol α/primase RNA-DNA primer synthesis
Pol δ / ε DNA polymerase; 3'-5' exonuclease
FENI Nuclease for removal of DNA/RNA primers
DNA2 Nuclease for removal of DNA/RNA primers
DNA ligase I Ligation of DNA
Mcm2-7 DNA helicase; primosome assembly, licensing factor
ADN polimerasas
 Ocurre durante la fase S
 Una única vez por ciclo celular
Horquilla eucariota
 Telómeros

 Son secuencias repetidas que

se encuentran en los
extremos de los
cromosomas lineales
 Entre otras funciones
resuelven los problemas de
replicar este tipo de
cromosomas
 Telomerasa

 Enzima capaz de resolver

el problema de
acortamiento de los
extremos
 Ribonucleoproteína
Mantenimiento de la información
hereditaria
 Errores durante la replicación:
◦ Las ADN polimerasas no son 100% fieles
◦ Los errores son reparados en un alto
porcentaje de las veces
◦ Cuando los errores escapan los mecanismos
de reparación ocurren cambios en la
secuencia del ADN: Mutaciones
 Las mutaciones también pueden ocurrir
por fenómenos post replicación
(mutágenos físicos, químicos, etc.)
 Mecanismos de reparación
 Las propias replicasas son capaces de reparar
sus errores durante la elongación:
◦ actividad correctora de prueba (proofreading)
◦ Implica una actividad exonucleasa 3’ 5’
Mecanismos de reparación
Replicación de ADN in-vitro: PCR
 Permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés
 Algunas aplicaciones:
◦ Clonado acelular de moléculas de ADN
◦ Detección de secuencias sin purificación previa
◦ Análisis de expresión génica
◦ Secuenciación de ácidos nucleicos
◦ Amplificación de ADN para su posterior clonación celular
◦ Aplicaciones en medicina:
 Diagnostico de enfermedades hereditarias/infecciosas
 Diagnóstico parental (amniocentesis, vellosidades coriónicas)
 Tipado de tejidos para transplantes
 Detección de células tumorales
 Estudios de asociación genotipo-fenotipo
◦ Técnicas forenses: huellas genéticas (Identificación de polimorfismos)
 Identificación individual
 Tests de paternidad
◦ Filogenia
◦ Análisis de genética poblacional
 Reacción de replicación in-vitro:
 Molde
 ADN polimerasa: Taq polimerasa (termoestable)
 Cebadores:
◦ 3’ OH libre
◦ Definen la región a amplificar
 dNTPs (A, C, G, T)
 Condiciones para el funcionamiento de la enzima:
◦ Buffer
◦ Mg++ (cofactor de la enzima)
 Procedimiento
 Desnaturalización del
ADN (94ºC)
 Agregado e
hibridación de los
cebadores (50ºC-
65ºC dependiendo de
los cebadores)
 Elongación (72ºC)
 Repetición de estas
etapas (25-35 ciclos)
 Luego de terminados los ciclos se obtienen
millones de moléculas de la región blanco
 La hace una técnica extremadamente sensible
◦ Ventaja: se puede amplificar ADN partiendo de
muy poco material
◦ Desventaja: Contaminaciones
Variantes del método
 rt- PCR:
◦ Se usa una transcriptasa reversa para pasar
una muestra de ARN a ADN obteniendose
ADN copia (ADNc)
◦ Se realiza un PCR para amplificar el ADNc de
interés
◦ Estudios de expresión génica
◦ Clonado de genes eucariotas (eliminación de
intrones)
 PCR cuantitativo (real time PCR, qPCR):
◦ Se diferencia en que en cada ciclo de amplificación
se cuantifica la cantidad de ADN obtenida
◦ Permite inferir la cantidad de moléculas de molde
que existía originalmente en la muestra:
 Cuantificación de la expresión génica
 Cuantificación de microorganismos
 Secuenciación de ADN
 Método de Sanger (nobel en 1980)
 Utiliza dideoxinucleotidos (ddNTPs) para
terminar una reacción de síntesis de ADN in-
vitro
 Realizando 4 reacciones independientes
(una para cada base) se puede inferir la
secuencia original
 Secuenciación automática
 Sigue el mismo principio
 A diferencia del método anterior cada ddNTP se
marca con una molecula fluorescente diferente
 Esto permite realizar una unica reaccion en la cual
estan presentes los 4 ddNTPs marcados
 Los fragmentos obtenidos se separan por
electroforesis capilar
 La detección se realiza en un punto fijo al final de la
corrida
 Secuenciación de genomas
 Cada reacción de secuencia es capaz de leer
unas 500 pb
 Como se obtuvo la secuencia continua del
conjunto de los cromosomas humanos?
 Cada cromosoma tiene en promedio 150Mb
(genoma completo 109)
 Construcción de biblioteca de ADN genómico
fragmentado al azar
 Lectura de secuencias individuales
 Las secuencias individuales son solapadas y
ensambladas (contigs)
 Para asegurarse de que todas las secuencias estén
representadas se leen unas 10 veces la cantidad de
bases del genoma
 La velocidad de producción de las secuencias ha ido
en aumento.
 Recientemente se dio un salto en este sentido con el
desarrollo de los secuenciadores de “próxima
generación”
 No usan terminación de cadena
 Se coloca una base cada vez y se detecta cual fue
incorporada a cada molécula que se esta
secuenciando
 Producen en una única reacción de secuencia
millones de lecturas de fragmentos diferentes
(paralelización)
 109 1011 bases por corrida (menos de 1 día)
 De esta forma se secuencio el genoma entero de
Watson en menos de 1 mes a un “bajo” costo