Trabajo Práctico Nº 3 - Ciclo Lectivo 2019 - Preparación de medios de cultivo.

Objetivos:
Adquirir conocimientos sobre preparación y usos de diferentes medios de cultivo en un laboratorio de microbiología.
Introducción:
Gran parte de la microbiología depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto sólo es posible si
se dispone de los medios de cultivo adecuados.
Un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes, en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el
objeto de aislar las diferentes especies de microorganismos, proceder a su identificación y llevar a cabo estudios complementarios.
Aunque todos los microorganismos necesitan fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y varios minerales, la composición
precisa de un medio adecuado dependerá de la especie que se quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente.
Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

1. Según su consistencia
- Medios Líquidos.
Son los que se presentan en este estado, denominándose por ello caldos. Contienen los nutrientes antes citados, con adición de algún tam-
pón, capaz de mantener el pH adecuado. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión de microorganismos
de una determinada concentración.

- Medios Sólidos.
Se prepara añadiendo un agente gelificante a un medio líquido determinado.
Los más usados son gelatina y agar.
Este conjunto, convenientemente esterilizado, se vierte en una placa de Petri o en tubos. Las exigencias nutritivas y las condiciones físico-
químicas son similares a las de los medios líquidos. Pero, a diferencia de ellos, presentan la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre
que la cantidad de inóculo esté suficientemente diluida.

- Medios Semisólidos.
Se preparan a partir de medios líquidos, agregando un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno
de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.

2. Según su composición.
- Medios complejos.
Son aquellos que contienen ingredientes cuya composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante.
Además, no se conoce exactamente la proporción de cada uno de sus componentes. Esto tiene ciertos inconvenientes en condiciones experi-
mentales, donde la reproducibilidad no podrá ser exacta. En la práctica estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

- Medios Sintéticos
Son aquellos que poseen exclusivamente componentes químicos definidos (se conocen todos los componentes) disueltos en agua destilada,
donde la proporción de cada uno de sus componentes es conocida exactamente. Entre ellos se encuentran los medios mínimos, pues en ellos
se intenta comprobar el crecimiento de un microorganismo determinado, con muy pocos nutrientes. Los medios definidos son ampliamente
usados en investigación, pues a menudo se quiere conocer que está metabolizando el microorganismo experimental.

- Medios Semisintéticos.
Cuando alguno de sus componentes no tiene composición definida. En estos casos, se añaden factores de crecimiento bajo la forma de un
extracto orgánico complejo, como por ejemplo, extracto de levaduras, peptona cono fuente de nitrógeno, glucosa como fuente de carbono.

3. Según su utilización o función.

- Medios Selectivos (o Inhibidores)
Pueden ser sólidos o líquidos, a los que se les agrega uno o más agentes de selección. Favorecen el crecimiento de microorganismos particu-
lares, en los que la “selectividad” se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo compuestos químicos, que sean nocivos
para los microorganismos cuyo crecimiento no interesa.
 - Medios Diferenciales.
Son siempre sólidos y se utilizan para diferenciar colonias. Son medios que diferencian entre grupos distintos de microorganismos e incluso
permiten una identificación tentativa según las características biológicas del microorganismo. A estos medios se les agrega, por ejemplo, un
indicador de pH que permite diferenciar a microorganismos que fermentan un determinado hidrato de carbono.
- Medios Enriquecidos.
Son medios a los que se le agrega un nutriente extra (además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indis-
pensables para el crecimiento de microorganismos exigentes). Pueden ser líquidos o sólidos. En estos medios no crece un determinado grupo
de microorganismos sino todos.
- Medios de Identificación.
Son los medios destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo.
Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser
metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.
- Medios de Transporte.
Se usan para transporte de aquellas muestras que no van a procesarse de inmediato o que deban ser trasladadas de un laboratorio a otro.
Estos medios son generalmente semisólidos, tamponados y sin sustancias nutritivas.

Algunos de los medios más utilizados en microbiología clínica son:

 Caldo Nutritivo: es un medio líquido usado para todo tipo de bacterias. Las bacterias crecen en el líquido y aparece como una sustancia
espesa y turbia, con colonias difícilmente observables.
 Agar Nutritivo: es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece
sólido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen
mejor las colonias pequeñas.
 Agar Sangre: es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que
incluyen bacterias aerobias y anaerobias, aunque no es medio de elección para anaerobios. Permite visualizar reacciones hemolíticas que pro-
ducen muchas especies bacterianas.
Ejemplo: Streptococcus spp
 Agar Chocolate (CHOC): es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre. Contiene glóbulos rojos,
que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este agar se usa para el delicado y exigente crecimiento de bacterias respiratorias, como
por ejemplo Haemophilus influenzae.
 Agar MacConkey: es una medio selectivo y diferencial para la detección de organismos coliformes y patógenos entéricos como las
bacterias Gram negativas y cepas que fermentan la lactosa. Ejemplos: Escherichia coli , Enterobacter y Klebsiella.
 Agar CLED (Agar cistina-lactosa deficiente en electrolito): es un medio de cultivo no inhibitorio usado en el aislamiento y diferenciación
de organismos urinarios. Al ser deficiente en electrólitos, previene del crecimiento exagerado de las especies de Proteus. La cistina promueve la
formación de colonias dependientes de cistina. Los fermentadores de lactosa producen colonias amarillas en el agar de CLED; las NO fermenta-
doras de lactosa dan colonias azules. Ejemplos: Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus.

Parte experimental:
Durante el trabajo práctico se realizarán preparaciones de diferentes medios de cultivo. Para la preparación de los medios de cultivos se
deberán tener en cuenta las indicaciones del fabricante.
Procedimiento general:
 Pesar la cantidad de medio de cultivo indicada por el fabricante.
 Colocar las cantidades pesadas en un frasco adecuado (previamente limpio y rotulado) que será el recipiente en el cual se va a esterilizar
el medio de cultivo.
 Disolver el medio de cultivo agregando agua destilada hasta completar el volumen total y calentar a baño maría hasta disolución total
del medio.
 Verificar rápidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el fabricante. Es indispensable efectuar esta verificación,
pues el pH del agua destilada puede variar según las condiciones de obtención y almacenamiento. El ajuste debe hacerse a temperatura am-
biente.
 Una vez preparados los medios deben esterilizarse. La mayoría de los medios de cultivo se esterilizan en autoclave, durante 15 minutos,
a 121ºC.
 Posteriormente los medios deben ser etiquetados y se debe aclarar la fecha de su esterilización y ser guardados en heladera hasta su
utilización.