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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE AGRONOMA

POST-PRACTICA MTODOS Y TCNICAS DE AISLAMIENTO DE AGENTES FITOPATGENOS (HONGOS Y CHROMISTAS)


LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGA Ing. Agro. GUSTAVO ADOLFO LVAREZ VALENZUELA

Pec Hernndez Marvin Mateo Carne: 200915859 Lunes Vespertina.

GUATEMALA 16 DE SEPTIEMBRE 2011

FACULTAD DE AGRONOMA NDICE INTRODUCCIN ................................................................................................................................... 3 OBJETIVOS ............................................................................................................................................. 3 MARCO TERICO ................................................................................................................................. 4 3.1. Mtodos y tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir de tejido vegetal ............................................................................................................................................ 4 3.1.1. 3.1.2. 4. 4.1. 4.2. Preparativos para el aislamiento (Segn Agrios) ................................................................. 4 Aislamiento de hojas ....................................................................................................................... 5

1. 2. 3.

MATERIALES Y MTODOS ................................................................................................................ 6 Materiales....................................................................................................................................... 6 Metodologa. .................................................................................................................................. 6 Procedimiento para efectuar la siembra .................................................................................. 6 Cultivo trampa .................................................................................................................................... 3 Tcnica de solucin de extracto de suelo ................................................................................. 6

4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. 5. 5.1. 5.2. 5.3. 6. 7. 8.

RESULTADOS Y DISCUSIN ............................................................................................................. 8 Aislamiento de agentes fitopatgenos ................................................................................. 8 Cultivo Trampa. ......................................................................................................................... 10 Tcnica de solucin de extracto de suelo ......................................................................... 12 5.3.1.1. Observaciones al Microscopio. ......................................................................................... 13

CONCLUSIONES ................................................................................................................................. 15 BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................... 16 anexos .................................................................................................................................................. 17 8.1. Qu otras tcnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que afectan plantas, ..................................................................................................................................... 17 8.1.1. 8.1.1. 8.1.1. 8.1.1. 8.1.1. 8.1.1. Aislamiento de hojas .................................................................................................................... 17 Induccin al desarrollo micelar ....................................................................................... 17 Aislamiento de tallos, frutos y otros rganos areos de la planta.............................. 17 Cultivo lquido ................................................................................................................................. 17 Placas de suelo de Warcup ......................................................................................................... 17 Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo ................................................. 17 Filtracin de partculas ................................................................................................................ 18 8.1.1.1.

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FACULTAD DE AGRONOMA 8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar algunos microorganismos (Hongos y bacterias),...................................................................... 18 8.3. Cmo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo patgeno a plantas (hongos o bacteria)? ..................................................................................... 20 8.3.1. 8.3.2. 8.3.3. 8.3.4. 8.3.5. 8.3.6. 8.3.7. 8.3.8. Medios Bsicos ................................................................................................................................ 20 Medios Enriquecidos..................................................................................................................... 20 Medios Selectivos ........................................................................................................................... 20 Medios Diferenciales ..................................................................................................................... 21 Medios para hongos ...................................................................................................................... 21 Medio para bacterias .................................................................................................................... 21 Agar V 8 .............................................................................................................................................. 21 Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio)............................................................................... 21

NDICE DE FIGURAS Figura No 1 Preparativos para el aislamiento .................................................................................................. 4 Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas. ................................................................... 5 Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota ................................................. 5 Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota ............................................................................................ 5 Figura No 5 Mancha negra en Rosa ...................................................................................................................... 8 Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa ............................................................................................. 8 Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae .......... 9 Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas .............................................................................. 9 Figura No 9 Manzana Inocualda con suelo (Magnolia). ............................................................................ 11 Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia. ........................................................................... 11 Figura No 11 Manzana inocualda con raiz de Magnolia ........................................................................... 11 Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo de las manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa. .......................................................... 12 Figura No 13 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 12 Figura No 14 Semilla en solucion de suelo. .................................................................................................... 13 Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de suelo............................................................................................................................................................................... 13 Figura No 16 Micelio de Phytophthora ............................................................................................................ 14 Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra .................................. 14

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FACULTAD DE AGRONOMA 1. INTRODUCCIN En la estructura de los hongos patgenos, las diversas formas que desarrollan: Estructuras vegetativas. Estructuras propagativas. Estructuras reproductivas. Estructuras de conservacin. Todo estos datos entran en juego cuando se quiere clasificar a los diferentes agentes fitopatgenos. Para que se logre observar las diferentes estructuras que se mencionaron anteriormente es necesario en algunas ocasiones y en algunos tipos de hongos fitopatgenos en especial que se necesita de poder aislarlos para determinar el agente causal. El aislamiento consiste en el proceso de separacin de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas, hojas, tubrculos, tallo races o suelo) para hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial (Por ejemplo medio PDA). El aislamiento y cultivo persigue diversos fines, el ms comn en un laboratorio de fitopatologa es para diagnosticar la causa de una enfermedad desconocida. El cultivo de microorganismos tiene enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biologa de estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo: Los hongos pueden o no formar cuerpos fructferos en medios artificiales; estos cuerpos pueden presentar variacin, Existen hongos que no se pueden cultivar (parsitos obligados) y otros que requieren medios complejos para su desarrollo. Las tcnicas para aislar hongos son diversas y dependen del hongo a estudiar a continuacin se presenta una recopilacin de informacin sobre los tipos de tcnicas de aislamiento de los diversos hongos fitopatgenos que afectan a los cultivos de importancia agrcola. 2. OBJETIVOS Conocer cuando se utiliza el mtodo de aislamiento como siembra directa. Conocer la tcnica de aislamiento de siembra en solucin de suelo. Conocer las dimensiones utilizadas en la perforacin de la manzana en el la tcnica de aislamiento conocida como cultivo trampa. Determinar el tiempo que tarda en reaccionar la manzana verde inoculada con raz de planta para determinar la presencia de oomycotas. Determinar el organismo oomycota LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGA 3

FACULTAD DE AGRONOMA 3. MARCO TERICO 3.1. Mtodos y tcnicas para el aislamiento de agentes fitopatgenos a partir de tejido vegetal

La mayora de las enfermedades de las plantas se diagnostican al observarlas a simple vista o mediante al microscopio, lo cual hace innecesario el aislamiento del patgeno. Sin embargo, hay muchas enfermedades bacterianas y fungosas en las que es imposible identificar al patgeno que ya se encuentra mezclado con uno o ms contaminantes, porque an no ha producido sus cuerpos fructferos caractersticos y esporas, debido a que una misma enfermedad puede deberse ya sea a uno o a varios patgenos morfolgicamente semejantes o tal vez a algn factor del ambiente, o bien a que la enfermedad es causada por un nuevo patgeno hasta ese momento desconocido, el cual debe aislarse y estudiarse. Como es habitual, los patgenos de enfermedades desconocidas deben aislarse de los tejidos enfermos de una planta a fin de que se pueda llevar a cabo un estudio de sus caractersticas, hbitos, etc 3.1.1. Preparativos para el aislamiento (Segn Agrios) Siempre que se desee aislar una bacteria o un hongo patgeno de los tejidos de una planta enferma, deben llevarse a cabo los siguientes procedimientos preliminares.

Figura No 1 Preparativos para el aislamiento

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FACULTAD DE AGRONOMA 3.1.2. Aislamiento de hojas En caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo. En ocasiones, el aislamiento del patgeno a partir de tizones y manchas foliares bacterianas o fungosas se logra mediante la esterilizacin superficial de la zona infectada con soluciones de Cloro o de Rada, separando una pequea porcin del tejido infectado con un escalpelo estril u otro objeto y colocndola en una caja de Petri que contenga un medio nutritivo. Sin embargo, el mtodo ms comn para aislar a los patgenos de las hojas infectadas y de otros rganos de la planta es aquel en el que se seleccionan varios cortes pequeos de 5 a 10 mm2 a partir del borde de la lesin infectada, a fin de que contenga tejidos enfermos y tejidos al parecer sanos (figura 2). Los cortes esterilizados en su superficie durante menos tiempo generalmente contienen al patgeno y a varios contaminantes, mientras que los que se han esterilizado durante ms tiempo no permiten el desarrollo de cualquier tipo de microorganismos debido a que han sido destruidos por el esterilizante de superficie.

Figura No 2 Metodologia de aislamiento de hongos en hojas.

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FACULTAD DE AGRONOMA 4. MATERIALES Y MTODOS 4.1. Materiales. Agua destilada y estril, Papel absorbente estril, Asa, Pinzas, Atomizador, Papel absorbente, Film, Marcador indeleble, Microondas, Campana de flujo laminar.

Material vegetal enfermo, Una manzana o tomate verde, Caja con instrumental de laboratorio, Cristalera estril (vidrios de reloj y cajas Petri), Medios de cultivo, Mechero, Alcohol, Hipoclorito de sodio,

4.2.

Metodologa.

4.2.1. Procedimiento para efectuar la siembra

Las porciones de tejido vegetal se depositaron en el primer vidrio de reloj (agua estril).

Seguidamente se traslado al vidrio de reloj que contiene alcohol, permanecio durante 30 seg.

Posteriormente se traslado al siguiente vidrio de reloj que contiene agua estril, para eliminar el exceso de alcohol.

Seguidamente se procedio a pasarlos al siguiente vidrio de reloj con hipoclorito de sodio, permanecio durante a 30 segundos.

Posteriormente se paso sucesivamente en los dos vidrios de reloj que contienen agua estril.

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Se colocar las porciones de tejido sobre una hoja de papel filtro estril, para quitarles el exceso de agua.

Pasar las porciones de tejido a papel estril con el fin de eliminar el exceso de agua en los tejidos.

Depositar las porciones de tejido en la caja petri o tubo de ensayo donde se har crecer el microorganismo.

Cuidar que el recipiente se encuentre cerca de la llama del mechero, evitar exhalar sobre el medio de cultivo.

Previo a introducir el tejido enfermo, debe flamear la boca del recipiente donde se cultivar el microorganismo.

Las cajas petri debern identificarse con el nombre de la persona y da de laboratorio e incubarse a 28 C durante 8 das.

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FACULTAD DE AGRONOMA 4.2.2. Cultivo trampa

Desinfeccin del rea de trabajo

Desinfeccin de Manzana

Desinfeccin del material raz de magnolia

Con un sacabocados a cada fruta se le hacen de 3 a 4 perforaciones, (1x1 cm.) y con una profundidad de 1.5 cm

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Llenar agujeros con material raz de magnolia

Llenar agujeros con material raz de magnolia Sellarlo y colocarle fecha

Incubarlo a temperatura ambiente

Posteriormente incuban en un recipiente cerrado a temperatura ambiente por espacio de 36 a 48 horas, luego de las cuales pueden verse las lesiones ocasionadas por Pythium o Phytophthora alrededor de los puntos de inoculacin. En la figura 3 se muestra un proceso de incubacin a medio ambiente. Cuando la inoculacin resulta positiva y el agente coloniza dentro de la manzana, pueden observarse lesiones firmes color marrn rodeando los puntos de inoculacin. En la figura 4 se muestran los sntomas desarrollados y considerados como positivos a la presencia de Oomycetos en frutas de manzana inoculadas con un sustrato considerado como sospechoso de contener a alguno de estos patgenos LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGA 4

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Figura No 3 Lesiones provocadas por generos del phyllum Oomycota

Figura No 4 Colonizacion por hongos Oomycota

Se procedio al aislamiento in vitro en medio de cultivo selectivo (PARPBH), para ello se cortan las manzanas que presentan sntomas positivos y se procedio a extraer tejido infectado de pulpa en la regin ms externa de la lesin o zona de avance. Se muestra la forma en que es separada cada una de las lesiones y se procede a observar su consistencia y velocidad de avance. Simultneamente se procede a cultivar las semillas de la fruta en solucin de suelo para que genere estructuras reproductivas.

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FACULTAD DE AGRONOMA 4.2.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo

Se peso 50 g de suelo y se mezclo con 500 cc de agua. 1

Se dejo por 24 horas reposando la solucin. 2

Se tomaron 100 cc de la solucin y se aforo a 1000 cc con agua destilada 3

Se esterilizo en autoclave por 20 minutos a 15 psi 4

La solucin se dejo enfriar y est lista para utilizar. 5 Para provocar desarrollo de esporangios, se colocaron en una caja de Petri, 10 cc de la solucin y se depositaron en ella las semillas con micelio de Pythium y Phytophthora, provenientes de las manzanas inoculadas con suelo o races y que habian dado positivo.

Se identifican las cajas y se dejaron temperatura ambiente . El micelio crece en el trmino de 24-48 horas

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Positivo

Desinfeccin rea de trabajo

Corte de la manzana

Solucin de suelo

Preparacin rea de trabajo rea de trabajo

Siembra de Semillas en solucin de suelo

Siembra del Oomycota en medio de cultivo selectivo (PARPBH)

Sellado he identificacion

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FACULTAD DE AGRONOMA 5. RESULTADOS Y DISCUSIN 5.1. Aislamiento de agentes fitopatgenos En las hojas se observaron diferentes manchas grandes de color pardo a negro, tena la forma de estrella. Las hojas se tornan de un color amarillo y posteriormente se caen. Esta enfermedad debilita a la planta debido a que su fuente de produccin de nutrientes es afectado n este caso es la hoja Se tomaron pedazo tanto de la parte sana como enferma de la hoja afectada como se menciona en la metodologa.
Figura No 5 Mancha negra en Rosa

El hongo inverna en forma de micelio o como ascsporas y conidios en las hojas y tallos de los rosales infectados ambos tipos de esporas producen infecciones primarias de hojas en la primavera mediante penetracin directa. El micelio se desarrolla en el mesfilo, pero al cabo de dos semanas forma acrvulos y conidios en el haz de la hoja (fase sexual). De los aislamientos realizados no se logr la siembra correcta solo uno de los cuatro reacciono al medio empezando a crecer los micelios del hongo, pueden haber varios motivos por los cuales no se logr que los dems pedazos de tejido no hayan crecido en el medio puede que el tejido tomado simplemente no contena al hongo, otra de las causas puede ser que los tejidos se hallan colocado demasiado tiempo en los compuestos tanto de alcohol o hipoclorito, esto debido a que como se observa en la figura 6 las porciones de tejidos parecer estar muertas o secas dentro del

Figura No 6 Organismo aislado de hoja de rosa

medio de cultivo. Segn varias investigaciones en literatura el agente causal de la enfermedad el cual se aisl probablemente es Diplocarpon rosae que es conocida comnmente como la mancha negra de la rosa.

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FACULTAD DE AGRONOMA Diplocarpon rosae es un hongo que causa la rosa Punto Negro enfermedad. Debido a que fue observado por personas de varios pases al mismo tiempo (alrededor de 1830), la nomenclatura de los hongos variados con cerca de 25 nombres diferentes. La etapa asexual se sabe ahora que Marssonina rosae , mientras que el estado sexual y ms comn se conoce como Diplocarpon rosae . Diplocarpon rosae en temporadas como micelio, ascosporas y conidias en las hojas y tallos. En la primavera durante condiciones hmedas y hmedas, ascosporas y conidios son llevados por el viento y la lluvia salpica al tejido de la hoja de reciente aparicin. Tras la infeccin, la enfermedad progresa a partir de las hojas ms bajas hacia arriba provocando la defoliacin y manchas de negro en las hojas. Pertenece al phyllum ascomycota Este hongo ascomycota en su fase asexual se le conoce como Marssonina rosae y como se observa en la figura 7, lo que se esperara es observar las esporas bicelular. Es muy caracterstico en este hongo.

Figura No 7 Espora asexual. bicelular esporas de hongos del anamorfo Marssonina rosae

Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5368965

En la fase sexual lo que se observara sera una estructura de resistencia del tipo apotecio que dentro tendra ascosporas y dentro de estas se encontraran ascas, debido a esto es que a este hongo se le clasifica en el phyllum ascomycota.

Figura No 8 Espora sexual Apotecio, Ascospora y ascas

Fuente: http://www.ipmimages.org/browse/detail.cfm?imgnum=5390063 LABORATORIO INTRODUCCIN A LA FITOPATOLOGA 9

FACULTAD DE AGRONOMA 5.2. Cultivo Trampa. FECHA CARACTERSTICAS

FOTOGRAFA (SIEMBRA DE RAZ DE MAGNOLIA)

30/08/2011

En esta fotografa lo que se observa es el hongo recin inoculado por lo que todava no muestra indicios de presencia del Oomycota.

01/09/2011

A las 48 horas todava la manzana no mostraba caractersticas de presencia del hongo, sin embargo cabe destacar que la consistencia de la manzana ya no era la misma como se mostraba inicialmente.

02/09/2011

La manzana que contena las races de magnolia que se sospechaba que estaba infectada con phytoptora era la que ms indicios mostraba de la presencia del Oomycota

05/09/2011

Tanto la manzana que contena suelo como las que contenan races, era un diagnostico positivo de la presencia del Oomycota.

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La manzana que contena suelo fue la que tardo ms en reaccionar a la presencia del Oomycota esto puede ser porque las condiciones ambientales del suelo no eran las ptimas en el momento de la tomas de la muestra por lo que la cantidad de Oomycotas presentes no era tan alta.

Figura No 9 Manzana Inocualda con suelo (Magnolia).

Unas de las manzanas que fue inoculada con races de Magnolia (Magnolia guatemalensis ) esta fue reacciono en menor tiempo en comparacin con la que fue inoculada con suelo, esto no da la pauta de que la planta estaba infestada con el Oomycota.

Figura No 10 Manzana Inoculada con raiz de Magnolia.

La tercera manzana al igual que la segunda que tambin fue inoculada con races de la planta infestada con el Oomycota, presentaba una diagnostico positivo de la presencia del hongo. Esto corrobora lo que se intua de debido a que la planta donde fueron tomadas las muestras presentaba sntomas caractersticos de la presencia del Oomycota.

Figura No 11 Manzana inocualda con raiz de Magnolia

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FACULTAD DE AGRONOMA 5.3. Tcnica de solucin de extracto de suelo Las tres manzanas a las cuales se les practic la prueba del cultivo trampa y dieron positivo tambin pasaron a la siguiente prueba el cual era la determinacin del genero de Oomycota el cual era la que estaba afectando a las plantas. El Oomycota trata de moverse hacia el centro de la manzana porque tiende a llegar a las semillas esto debido a que las semillas son ricas en energa, porque estn llenas de reservas para la nueva planta que germinara por eso el Oomycota busca siempre llegar a ella. Por lo que la para la siembra en el medio selectivo PARPBH se toma porciones de la manzana en la zona conocida como zona de avance del hongo que
Figura No 12 Siembra en Medio selectivo PARPBH y siembra se semilla en solucion de suelo de las manzanas que dieron positivo la prueba del cultivo trampa.

est cercano donde estn las semillas.

A las 24 horas de la siembra de las semillas en solucin de suelo la primea en reaccionar fueron las semillas extradas de la manzana inoculada con races de la planta infectada, confirmando con ello que, esta es la que mayor infestacin del Oomycota tena. El micelio del hongo tiene una coloracin blanca y crece rpidamente porque las semillas tienen muchos nutrientes que el Oomycota necesita. La solucin del suelo su funcin es la de simularle al Oomycota que est en el suelo y por lo tanto ataca a la semilla.
Figura No 13 Semilla en solucion de suelo.

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A las 24 despus de la siembra de semillas de manzana en solucin de suelo la que menos reacciono fueron las semillas prevenientes de la manzana la cual fue inoculada con suelo. Esto porque como se mencion anteriormente, como posible causa que en el suelo no haya un alta cantidad del Oomycota.

Figura No 14 Semilla en solucion de suelo.

5.3.1.1.

Observaciones al Microscopio.

Figura No 15 Montaje del micelio del Oomycota a las 24 horas de la siembra en solucion de suelo

A las 24 horas despus de la siembra el Oomycota solo haba producido hifas y esto hacia que no se pudiera determinar si era phytopthora o no porque no tena caractersticas especficas por lo que haba que esperar mas tiempo.

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A las 48 horas despus de la siembra en solucin de suelo se realiz nuevamente un montaje sobre el oomycota, pero lo que se encontr es una contaminacin del micelio de este hongo con otros hongos. Pero despus de una cuidadosa seleccin de la parte que se necesitaba se encontr con el micelio de Phytophthora
Figura No 16 Micelio de Phytophthora

Figura No 17 Micelio de Phytophthora a las 48 horas despues de la simbra

En el montaje que se ve en el lado izquierdo de la figura 17 se muestra el micelio de Phytophthora, pero al lado derecho se hace una aceracin de ello y se observa el oogonio caracterstico de este oomycota, adems de ello se muestra de una osporo que se esperara que a lo largo del tiempo mostrase este microorganismo. Por lo que despus de una largo proceso se lleg a determinar que la planta de magnolia si estaba infestada con Phytophthora.

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6. CONCLUSIONES En caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo (raspado). Tcnica de siembra directa de suelo, este mtodo se lleva a cabo introduciendo fragmentos del suelo fresco en la superficie de placas con diferentes medios de cultivo, para posteriormente observar el crecimiento micelial de los hongos presentes en las muestras. El cultivo trampa no es ms que los trozos de tejido se introdujeron en orificios de 5 mm de dimetro y 30 mm de profundidad, hechos en frutos maduros de manzana verde luego se cubrieron con cinta de enmascarar y se dejaron a temperatura ambiente. El tiempo que tard en reaccionar la manzana a la cual se le inoculo races de planta infectada con Phytophthora fue de 3 dias. En el cultivo trampa el organismo que se lleg a determinar es Phytophthora sp.

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FACULTAD DE AGRONOMA 7. BIBLIOGRAFA


1. AGRIOS, G. 1998. Fitopatologa.5.Edicin.EditorialMcGraw-Hill.Mxico.928p. 2. Loredo Vega

J. Universidad Autnoma De Sinaloa Unidad Regional Norte Escuela Superior De Agricultura Del Valle Del Fuerte Manual De Prcticas Del Laboratorio De Fitopatologa. Consultado el 17 de Septiembre 2011. Disponible en: http://www.slideshare.net/jloveuas/manual-de-prcticas-fitopatologa-3025383.

3. Arias E. Aislamiento e identificacin de hongos filamentosos del suelo. Trabajo de grado. Universidad Javeriana, Bogot Colombia. Consultado el 16 de Septiembre 2011. Disponible en: http://ciagrope.tripod.com/fitote20.html. 4. Principios de fitopatologa, Universidad Central de Venezuela, Facultad de Agronoma. Consultado el 10 de Septiembre 2011 Disponible en:http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Clase_1_PRINCIPIO S_DE_FITOPATOLOG%C3%8DA.pdf 5. Universidad de la Repblica, Facultad de Agronoma, Departamento de Proteccin Vegetal, Monte Video Uruguay. Practica de hongos. Consultado el 18 de Septiembre 2011. Disponible en: http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html y http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/clave_bacterias.html 6. Fitopatologa General, Universidad Agraria de Molina, Departamento de fitopatologa. Lima, Per. Consultado el 18 de Septiembre 2011. Disponible en:http://tarwi.lamolina.edu.pe/~fonz/fitogen/PDF/APUNTES%20DE%20CLASES1.pdf

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FACULTAD DE AGRONOMA 8. ANEXOS Qu otras tcnicas de aislamiento se conocen para microorganismos que afectan plantas,

8.1.

8.1.1. Aislamiento de hojas En caso de que la infeccin de las hojas de una planta avance en forma de tizn o mancha foliar fungosa y en caso de que las esporas del hongo aparezcan sobre su superficie, algunas de esas esporas deben depositarse sobre una caja de Petri que contenga medio de cultivo. 8.1.1.1. Induccin al desarrollo micelar

Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos de la raz. Este mtodo es el ms usado cuando se requiere tener a un hongo en cultivo puro. 8.1.1. Aislamiento de tallos, frutos y otros rganos areos de la planta La mayora de los mtodos que se han descrito para aislar bacterias y hongos patgenos de las hojas, pueden tambin utilizarse para aislar esos mismos patgenos de las infecciones superficiales de los tejidos mencionados. 8.1.1. Cultivo lquido En esta tcnica se toman 10 g (equivalente peso seco) de suelo fresco y se adiciona a erlenmeyers de 1000 mL con una solucin de agua destilada estril, peptona al 0,1%, Tween 80 al 0,5% y Cloramfencol (400ppm) 0,005mg/mL. Se coloca la mezcla en shaker giratorio durante 48 horas para luego dejarlo en incubacin esttica hasta observar el desarrollo de micelios en el lquido (aproximadamente 1 semana). 8.1.1. Placas de suelo de Warcup Fue desarrollado por Warcup en 1950, las placas se preparan dispersando pequeas cantidades (0.2-5 mg) de suelo pulverizado en una caja de petri estril, se adiciona agar a las placas y se agita lentamente para dispersar las partculas. 8.1.1. Fraccionamiento de la comunidad de hongos del suelo Esta tcnica involucra la preseparacin de propgulos del suelo utilizando centrifugacin por gradiente de densidad antes de la aplicacin en los medios de aislamiento. Se aslan especficamente, las esporas de diferentes tamaos.

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FACULTAD DE AGRONOMA 8.1.1. Filtracin de partculas Se denomina tambin "lavado de suelo" y permite el aislamiento de hongos de fragmentos de micelio sumergidos en el sustrato, reduciendo la recuperacin de colonias de hongos originarios de esporas; de igual forma el aislamiento de especies con clamidosporas tambin es favorecido ya que sus propgulos no son removidos del todo por el lavado. 8.2. Investigue que tipo de medios selectivos son utilizados para desarrollar algunos microorganismos (Hongos y bacterias),

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FACULTAD DE AGRONOMA 8.3. Cmo puede saber que medio utilizar cuando desea aislar un organismo patgeno a plantas (hongos o bacteria)?

Inicialmente con los sntomas y signos que presente el microorganismo o alguno de los cortes realizados nos dan indicios si es un hongo o una bacteria partiendo de eso despus se puede seleccionar varios medios para su utilizacin se puede empezar con medios bsicos, y dependiendo la reaccin del microorganismo podemos llegar hasta un medo diferencial para estar seguros de que el organismo aislado es el requerido Para estudiar los microorganismos (p. ej.: hongos, bacterias) se necesita como requisito previo cultivarlos en condiciones de laboratorio, para lograr esto, es preciso conocer cules son los nutrientes y las condiciones fsicas que requieren. Por medio de estudios se ha logrado determinar las necesidades nutricionales de hongos y bacterias en forma general. Aunque algunas especies de estos microorganismos necesitan condiciones ms especficas para poder desarrollarse. La preparacin de medios de cultivo es importante para desarrollar microorganismos fuera de su ambiente natural y demostrar sus propiedades en el diagnstico. En fitopatologa se utilizan muchos medios. Estos medios varan ampliamente, de acuerdo a las necesidades particulares de los microorganismos bajo estudio. 8.3.1. Medios Bsicos Estos son los medios ms simples, que slo contienen lo necesario para proporcionar a los microorganismos los aminocidos, vitaminas, sales, y pequeas cantidades de carbono, nitrgeno, hidrgeno y otros elementos. Existen medios de cultivos lquidos y medios de cultivo slidos. Los medios de cultivo que no contienen agar o cualquier otro agente solidificante son medios lquidos. Para el estudio de las caractersticas de las colonias es indispensable el uso de medios slidos. La solidificacin se consigue agregando agar, gelatina, albmina de suero o de huevo. 8.3.2. Medios Enriquecidos La adicin de componentes como sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas al los medios bsicos, les proporcionan sustancias nutritivas complementarias para que el medio pueda soportar el crecimiento de los organismos exigentes 8.3.3. Medios Selectivos Son usualmente medios de agar bsico o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que impiden el crecimiento de la mayora de las bacterias, permitiendo por lo tanto, el crecimiento de unas cuantas seleccionadas, en los especmenes que contengan grandes nmero de microorganismos indeseables.

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FACULTAD DE AGRONOMA 8.3.4. Medios Diferenciales Son medios bsicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado ciertos reactivos que reaccionarn con algunos tipos especficos de bacterias en cierta forma observables. Por ejemplo: cuando se agrega lactosa y rojo neutro al agar nutritivo (medio bsico de cultivo), las bacterias fermentadoras de lactosa de diferenciarn de las no fermentadoras de lactosa por la formacin de productos finales cidos, demostrables por un cambio de color (rojo en un pH cido) del rojo neutro. Como es natural, al aadir algunas substancias inhibidoras a los medios diferenciales, puede hacrseles selectivos as como diferenciales. La mayora de los llamados medios diferenciales son de este ltimo tipo. La bacteria del gnero Xanthomonas y Erwinia presenta una coloracin amarillenta en el medio diferencial llamado YDC (levadura, dextrosa, calcio). 8.3.5. Medios para hongos A excepcin de algunas especies de hongos, la mayora de los mismos se desarrollan bien sobre un medio que contenga Papa, Dextrosa y Agar (PDA). 8.3.6. Medio para bacterias El medio para bacterias a utilizar es el conocido como Agar Nutritivo (AN). Se utiliza para el aislamiento de la mayora de las bacterias, como medio en la identificacin. 8.3.7. Agar V 8 Este medio es muy til para promover la esporulacin de ciertos hongos y para el desarrollo de otros muy exigentes en nutrientes. El jugo V 8 es un producto que contiene extractos de tomate, zanahoria, apio de vitaminas y minerales. 8.3.8. Medio YDC (Levadura, Dextrosa, Calcio) Se utiliza para la identificacin de las bacterias del gnero Xanthomonas y Erwinia, las cuales dan una coloracin amarillenta en este medio.

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