BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ÁREA DE ECOLOGÍA

LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA

LABORATORIO DE ECOLOGÍA

EQUIPO 5

ÁNGELES CARRASCO GABRIELA MICHELLE

MONICA S. LOPEZ CASTAÑOS
HERNÁNDEZ GONZÁLEZ JOHANA PAOLA
SWARTWOOD MONTERO LUIS AXEL
TORRES VALDETANO ANGELES

DR. VERONICA CEPEDA CORNEJO

FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE

18- OCTUBRE- 2019

 DIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS EN DISTINTOS AMBIENTES
BIÓTICOS Y ABIÓTICOS

INTRODUCCIÓN:
Los microorganismos son aquellos organismos que, por su tamaño reducido, son
imperceptibles a la vista. También denominados “microbios”, estos organismos
cuentan con una organización biológica muy básica, una proporción importante de
ellos cuentan con apenas una única célula. Además, se caracterizan por existir
numerosas variedades, de diferentes formas y tamaños.
Los organismos unicelulares procariotas y eucariotas, junto con ciertos hongos y
algas componen el universo de los microbios.
Dentro de la naturaleza se pueden identificar diferentes tipos de microorganismos.
En particular las bacterias son hábiles colonizadoras de diversos ambientes terrestres
y acuáticos.Son los organismos más abundantes del planeta, resisten temperaturas
extremas y pueden encontrarse por millones en tan solo un gramo de suelo o en un
mililitro de agua. La utilidad de las bacterias en los ciclos biogeoquímicos es
imprescindible, así como su presencia en el tracto digestivo de los vertebrados.
Asimismo, son de gran importancia en la industria de los productos lácteos. No
obstante que algunas bacterias pueden resultar altamente nocivas y causar
enfermedades en los seres humanos como el cólera, difteria, lepra, tuberculosis, entre
otras.
El aislamiento de las bacterias que es la separación de un determinado
microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan,permite su estudio
e identificación. Los métodos de aislamiento incluyen entre otros la siembra en medios
de cultivo selectivos en donde sólo puede crecer un tipo de microorganismo y
diferenciales que es capaz de distinguir dos microorganismos por su crecimiento
diferencial en el mismo, usando las propiedades metabólicas de ambos en presencia
de un determinado nutriente y de un indicador. Existen algunos medios que por su
formulación permiten el crecimiento selectivo de ciertos grupos de microorganismos
e inhibe el desarrollo de otros.Para que una célula viva, crezca y se reproduzca, debe
ser capaz de incorporar y transformar (mediante el metabolismo) los compuestos
químicos que necesita para obtener energía (catabolismo), así como las moléculas
que pasarán a formar parte de su material celular (anabolismo). Todas las reacciones
químicas que se llevan a cabo son catalizadas por enzimas (catalizadores biológicos
de naturaleza proteica y actividad específica), las cuales se clasifican, de acuerdo al
lugar del ambiente celular donde actúan, en exoenzimas y endoenzimas. Las pruebas
bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o
ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa
en uno o más microorganismos. Estas pruebas permiten identificar levaduras,
bacterias entéricas, no entéricas, y otras más. La presente práctica pretende la
exploración de bacterias que crecen en distintos ambientes bióticos que son los
organismos vivos que influencian la forma de un ecosistema. Pueden referirse a la los
componentes bióticos qué es la flora y fauna de un lugar y sus interacciones;
Y los componentes abióticos los cuales se centran en el estudio de los componentes
no vivos del medio ambiente que rodean a las especies y que le permiten vivir.

JUSTIFICACIÓN:
La presente práctica se enfocará en estudiar los diferentes tipos de microorganismos
que se encuentran presentes en los suelos de el pino “Pinus maximartinezii”. La
práctica nos permitirá preparar y utilizar medios de cultivo específico pues para que
las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento
de todo microorganismo contaminante para poder manifestar peculiaridades en el
metabolismo bacteriano. Las tinciones diferenciales son una herramienta muy útil
para identificar el tipo de bacteria ya sea Gram-negativas o gram- positivas pero
insuficiente para llegar al nivel necesario de información, para ello se utilizarán las
pruebas bioquímicas que serán de gran ayuda para identificar bacterias pues es
indispensable poner de manifiesto rasgos especiales de su metabolismo y fisiología
ya que, la simple observación de su forma y tamaño, ofrece una información muy
limitada que apenas nos permite encuadrarlas en grandes grupos.

OBJETIVO: Identificar los distintos ambientes bióticos y abióticos en los cuales

pueden crecer las bacterias y conseguir su aislamiento mediante el uso de medios
de cultivo selectivos y diferenciales.

METODOLOGÍA
PRIMERA PARTE
Preparación de medios
1. Se pesan en la balanza los reactivos a utilizar al 25% para preparar el medio que le
tocó al equipo: LB

Reactivo Cantidad (al 25% de la cantidad

determinada)

LB De 3.75 gr se pesó 3.875 gr

NaCl De 2.5 gr se pesó: 2.375 gr

Agar bacteriológico De 16 gr se pesó 4 gr

Tabla 1. Cantidades de cada reactivo utilizado para la preparación del medio LB.

2. Se esteriliza la campana de extracción usando benzal y la lámpara UV y se

desinfectan los guantes del operador aplicando etanol al 70 %
3. Se procede a abrir y presentar las cajas petri y se vierte el contenido previamente
preparado en las cajas petri aproximadamente ⅔
4. Se deja solidificar y posteriormente se tapan y etiquetan para introducirlos a la
incubadora unos días a 37 C° para asegurarse que no se contaminaran durante el
proceso de preparación

PROCESO ¿POR QUÉ?

Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente
estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan
alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento
microbiano normal del o de los especímenes inoculados en
dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión
como agente esterilizante)

Medio LB El medio Luria-Bertani (LB), es uno de los más usados para el

cultivo de Escherichia coli y de otras especies bacterianas,
debido a que es rico en nutrientes, de fácil elaboración y
permite el crecimiento de una gran variedad de cepas. Está
constituido por tres componentes, de los cuales uno es
mineral, el NaCl, y dos son orgánicos: la triptona (o peptona)
y el extracto de levadura
 Medio TGE El agar extracto de glucosa triptona se utiliza para el cultivo y
enumeración de microorganismos en productos lácteos y
agua embotellada en un entorno de laboratorio. El agar
extracto de glucosa triptona no está destinado a ser utilizado
en el diagnóstico de enfermedades u otras condiciones en
humanos.
En los 1930, Bower y Hucker desarrollaron un medio para
detectar bacterias en la leche y otros productos lácteos.
Prickett utilizó un agar glucosa que contenía triptona para
estudiar bacterias termófilas en la leche. En 1948, la
Asociación Americana de Salud Pública (APHA) adoptó el
agar extracto de glucosa triptona para su uso en las pruebas
de leche y productos lácteos. Actualmente, la APHA especifica
el agar extracto de glucosa triptona para el procedimiento de
recuento heterotrófico en placa en pruebas de agua
embotellada.

El agar extracto de glucosa triptona también se conoce como

agar levadura dextrosa.

Solución salina Solución de cloruro sódico en agua purificada. Se considera

fisiológica cuando tiene la misma presión osmótica que el
plasma sanguíneo

Tabla 2. Justificación de la preparación de cada medio cultivo.

SEGUNDA PARTE
Siembra e inoculación
Recolección de muestra:
Se acudió al jardín botánico y se eligió una porción del suelo del árbol Pinus
maximartinezii para recolección de muestras.
1. Usando una brújula, se ubicaron los 4 puntos cardinales con respecto al
árbol.
2. Iniciando por cualquiera de los puntos, se tomó una muestra de unos 5g a una
distancia de 1m del tronco del árbol y con una profundidad de unos 10cm
retirando los residuos superficiales (hojas , ramas etc) para asegurándose que
se tome una muestra del suelo .
3. Se tomaron muestras de todos los puntos cardinales y se mezclaron en una
bolsa ziploc etiquetadas con el nombre del árbol(Pinus maximartinezii).
Sembrado
1. Afuera de la campana de extracción pesar 1 gr de la muestra recolectada
anteriormente (Pinus maximartinezii)
2. A partir de este paso se hace en la campana de extracción: colocar el gramos del
suelo en un tubo de 9 mL de solución salina, agitar y dejar reposar
3. Tomar una alícuota de 0.5 mL con la pipeta y llevarla al tubo 1 de 4.5 mL de solución
salina, agitar y dejar reposar.
4. Repetir el paso 3 otras dos veces para tener soluciones más diluidas que al final
queden como de: 1/10, 1/100 y 1/1000.
5. Se realizan 4 placas, la primera de TG con la solución 1/10, la segunda de TG con la
solución 1/100, la tercera de cromoagar con la solución 1/100 y la cuarta de TG con
la solución 1/1000.
6. Finalmente tomar una alícuota de 0.5 mL en el cultivo TG y cromoagar según
corresponda y extenderla con el asa de triangular de vidrio, cerrar la caja de petri y
llevarla a inoculación para el crecimiento de los microorganismos.

Técnica de dilución por extensión en placa.

Consiste en inocular una serie de frascos tipo antibiótico que contiene 9mL del medio
de cultivo apropiado según el tipo de bacteria que se quiera evaluar.
Se extrae una alícuota de 1mL de la muestra, se inocula en el primer frasco, se agita,
se vuelve a extraer una alícuota de 1 mL del primer frasco y así sucesivamente.
● La manifestación de crecimiento bacteriano se observa por la turbidez del
medio de cultivo.
● Está técnica nos permite un doble objetivo, el aislamiento de colonias y
además el recuento de los microorganismos que tenemos en el cultivo original.
● Se recomienda para microorganismos aeróbicos estrictos.

MEDIO DE CULTIVO ¿POR QUÉ SE UTILIZÓ?

El agar extracto de glucosa triptona se utiliza para

cultivar y enumerar microorganismos en agua y
Medio TGE productos lácteos.
Caldo TGE, también conocido como membrana
Tryptone Glucose Extracto de caldo, se utiliza para
enumerar microorganismos por filtración por membrana

Medio LB El medio LB aporta diversos nutrientes que promueven

de forma eficaz el crecimiento de los microorganismos,
como:

● Péptidos y peptonas de caseína.

● Vitaminas (vitaminas del complejo B).
● Oligoelementos (por ejemplo, nitrógeno, magnesio,
azufre,).
● Minerales.
Los péptidos y peptonas son proporcionados por triptona
(producto de la digestión de la caseína proveniente de la
leche con enzimas pancreáticas). Éstas aportan péptidos
pequeños y aminoácidos libres, solubles en agua y no
coagulables por efecto del calor. Vitaminas y
determinados oligoelementos son proporcionados por el
 extracto de levadura. Los iones de sodio para el
transporte y el equilibrio osmótico se proporcionan por el
cloruro de sodio. Bacto-triptona se utiliza para proporcionar
los aminoácidos esenciales para el crecimiento de
bacterias, mientras que el extracto de Bacto-levadura se
utiliza para proporcionar una gran cantidad de compuestos
orgánicos útiles para el crecimiento bacteriano.

Solución salina Se debe utilizar un diluyente isotónico para diluir las

células bacterianas con el fin de proporcionar una
concentración adecuada para observación al
microscopio, determinar recuentos de células, analizar
propiedades genéticas o metabólicas, lavar las células
en preparación para su estudio o preparar inóculos
normalizados.

Se utiliza de manera sistemática como diluyente para

ajustar la turbidez de las suspensiones de células
bacterianas y así mantener la integridad y viabilidad de
las células.

Se usó chromagar ya que es un medio selectivo y de

Chromagar diferenciación para el aislamiento de hongos. Con la
inclusión de sustratos cromógenos en el medio, las
colonias de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei
producen colores diferentes, lo que permite la detección
directa de estas especies de levaduras en la placa de
aislamiento. Una ventaja adicional del medio es la fácil
detección de cultivos mixtos de levaduras, debido a los
diferentes colores que presentan sus colonias.
Tabla 3. Justificación de el cómo y/o el por qué se utiliza cada medio en los organismos
aislados del suelo del árbol Pinus maximartinezii.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

TERCERA PARTE
Análisis de microorganismos e Índices de biodiversidad
1. Se tomaron las placas de TG y cromoagar de la solución 1/100 para contabilizar los
microorganismos mediante el uso del estetoscopio.
2. Anteriormente se llevaron las placas a la campana de extracción para secar el agua
de las tapas.
Índice de Shannon-Wiener
Uno de los índices más utilizados para determinar la diversidad de especies de plantas de un
determinado hábitat. Para utilizar este índice, el muestreo debe ser aleatorio y todas las
especies de una comunidad vegetal deben estar presentes en la muestra. Se calcula con la
siguiente fórmula:

Especie Pi Pi* Ln(Pi)

A-8 0.127 -0.2620

B-14 0.222 -0.3341

C-3 0.047 -0.1437

D-2 0.031 -0.1077

E-1 0.016 -0.0661

F-20 0.317 -0.3642

G-4 0.063 -0.1741

H-4 0.063 -0.1741

I-4 0.063 -0.1741

J-7 0.111 -0.2440

Total: 63 Total: -1.6799

Tabla 4: Resultados para obtener el índice Shannon Weaver.

H= −𝛴𝑃𝑖 ∗ 𝐿𝑛𝑃𝑖
H=(-)(-1.6799)
H= 1.6799

H: normalmente toma valores entre 1 y 4.5. Valores encima de 3 son típicamente

interpretados como “diversos”.

Índice de Simpson
Es otro método utilizado, comúnmente, para determinar la diversidad de una comunidad
vegetal (Dominancia). Se calcula con la fórmula siguiente:
Especie Abundancia Abundancia Abundancia relativa
relativa al cuadrado

A 8 0.11940299 0.01425707

B 14 0.20895522 0.04366229

C 3 0.04477612 0.0020049

D 2 0.02985075 0.00089107

E 1 0.01492537 0.00022277

F 20 0.29850746 0.08910671

G 4 0.05970149 0.00356427

H 4 0.05970149 0.00356427

I 4 0.05970149 0.00356427

J 7 0.10447761 0.01091557

“D” 0.17175317
Tabla 5: Resultados calculados para obtener el índice Simpson.
1-D= 0.82824683

El índice es una representación de la probabilidad de que dos individuos, dentro de una

misma región y seleccionados al azar, sean de la misma especie. El rango del índice de
Simpson va de 0 a 1, así:

– Cuanto más se acerca el valor de D a 1, menor es la diversidad del hábitat.

– Cuanto más se acerca el valor de D a 0, mayor es la diversidad del hábitat.

Es decir, cuanto mayor es el valor de D, menor es la diversidad. Esto no es fácil de interpretar

de manera intuitiva y podría generar confusión, razón por la cual se llegó al consenso de
restar el valor de D a 1, quedando de la siguiente manera: 1- D

Índice de equitatividad
Indica el grado de igualdad de la distribución de la abundancia de las especies. Por ejemplo,
la equitatividad máxima indica que todas las especies de la comunidad tienen el mismo
número de organismos.

E = H / Ln(s) = 1.6799/ Ln (5.555246931) = E= 0.9799662273

El valor (E) de la equitatividad de especies varía entre los valores “0” y “1”; donde el valor “0”
representa baja equitatividad (o alta dominancia por pocas especies) y el valor “1” representa
total equitatividad en la representación de individuos de cada especie detectada en el
muestreo

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Índices de biodiversidad

Shannon-Wiener Simpson Equitatividad

POCO DIVERSO. MUY DIVERSO ALTA EQUITATIVIDAD

Nuestro valor obtenido fue de El valor que obtuvimos fue de Nuestro valor obtenido fue de
1.6799, el cual nos indica una 0.82824683, siendo un 0.9799662231, el cual nos
baja diversidad de especies, ya número bastante cercano al indica una alta equitatividad
que se encuentra por debajo uno, podemos considerarlo de especies, ya que se
del número 2, debido a que como diversidad alta. aproxima más al valor del
valores entre 2 y 3 son número 1.
considerados normales y
valores superiores a 3 son
altos en diversidad de
especies.
Tabla 6: Interpretación de los resultados obtenidos de cada índice de biodiversidad.

CUARTA PARTE
Identificación bioquímica
 Pruebas bioquímicas

Prueba Metodología Interpretación de resultados

POSITIVO NEGATIVO

FERMENTADOR DE AZÚCARES
TSI 1. Se inoculó cada cepa en los tubos con TSI
Agar, se inoculan primero por picadura en el
color amarillo/miel o pico si todo el tubo se torna
fondo del tubo y terminar con estría simple rojo rojo
en la superficie.
2. Se incubaron los tubos a 35°C durante 24 a PRODUCCIÓN DE 𝐻 2 𝑆𝑂 4
48 horas.
3. Se hicieron observaciones a las 24 y 48
Ennegrecimiento del sin ennegrecimiento
horas de incubación. medio

PRODUCCIÓN DE GAS

presencia de burbujas o sin presencia de burbujas

rompimiento del medio o rompimiento del medio

MIO 1. Se inocularon por picadura hasta el fondo MOVILIDAD

del tubo cada uno de los tubos con agar
SIM. turbidez o crecimiento Crecimiento solo en la
2. Se incubaron los tubos a 35°C durante 24 a más allá de la línea de línea de siembra
48 horas. siembra
3. Se realizaron observaciones a las 24 horas.
INDOL

anillo color rojo incoloro-amarillento

ORNITINA

color púrpura color amarillo

OF 1. Se inoculó por picadura hasta el fondo del -color amarillo color verde sin
tubo cada uno de los tubos. (fermentativo) crecimiento
2. Se incubaron los tubos a 35°C durante 24 a -color verde con
48 horas. crecimiento
(oxidativo)
3. Se realizaron observaciones a las 24 horas.

OXIDASA 1. Se toma con un asa bacteriológica una Coloración morada en los en la tira no hubo cambio
muestra bacteriana a partir de una colonia primeros 30 segundos de coloración
aislada proveniente de un cultivo de 24h.
2. La muestra se pone en contacto con la tira
o disco impregnado
CATALASA 1. Se toma con un asa bacteriológica una Presencia de burbujeo ya Sin presencia
muestra bacteriana a partir de una colonia sea que se mantenga por de burbujeo
aislada proveniente de un cultivo de 24h. un corto y largo periodo
de tiempo
2. La muestra se pone un un portaobjetos
previamente lavado y desinfectado
3. Se le agrega 3 gotas de peróxido de
hidrógeno
NOTA: tose se realiza en una campana de
extracción

TINCIÓN 1. Se cubrió el frotis de los organismos de La bacteria se ve de color La bacteria se ve de color

GRAM nuestra cepa 1,3 y 4. Y, se con 2 gotas púrpura/morado al ser rosa al ser observada en
de cristal violeta durante 60 segundos. observada en el el microscopio
microscopio
Se lavó cuidadosamente el frotis con
agua destilada para eliminar el exceso
de colorante.
2. Se eliminó el exceso de agua y se cubrió
el frotis con 2 gotas de lugol por 30
segundos. Se lavó con precaución el
frotis con agua.
3. Se inclinó el portaobjetos y aplicó gota a
gota el decolorante hasta que no fluyera
más colorante. Se lavó de inmediato
con agua.
4. Se aplican 2 gotas de safranina durante
30 segundos. Se lavó de nuevo con
agua, se quitó el exceso de agua y se
dejó secar al aire.

Tabla 7. Metodología de cada una de las pruebas bioquímicas con su respectiva

interpretación de los resultados obtenidos.

Pruebas bioquÍmicas
Núm.
cepa
TSI MIO OF OXIDASA CATALA AEROBIA/ TINCIÓN
SA ANAEROBIA GRAM

M I O

1 + ++ - - - - + aerobia positiva

2 + + - - - / / aerobia -

3 + + - + - + + anaerobia positiva

4 + + - + - - + aerobia positiva

5 + +++ - - fermentativo / / aerobia -

6 + + - + - / / aerobia -
Tabla 8. Resultados de las pruebas bioquímicas de cada cepa.

Número de cepa Nombre del organismo identificado

1 Bacillus pumilus.

2 Campylobacter lari

3 Bacillus amyloliquefaciens

4 Kurthia gibsonii

5 Erwinia amylovora

6 Proteus mirabilis
Tabla 9. Nombre de las especies identificadas de cada cepa.

CONCLUSIONES:
El valor científico asociado a hallar la diversidad biológica de un ambiente es muy amplio
siendo foco fundamental de muchas investigaciones o siendo soporte para muchas otras,
además de su importancia en temas de actualidad como: los problemas que sufren los
ambientes por culpa del calentamiento global y la contaminación, sin embargo depende en
gran parte de las buenas prácticas realizadas en cada etapa que abarcan desde una
investigación teórica, pruebas de campo hasta pruebas de laboratorio y interpretación, por lo
cual su correcta aplicación es fundamental para cualquier persona que desee dedicarse al
área de las ciencias biológicas.

BIBLIOGRAFÍA:
● Mac Faddin J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clínica. 3era ed. Editorial Panamericana.
Buenos Aires. Argentina
 ● Ruiz, P.. (2011). Pruebas bioquímicas primarias: Tinción de GRAM,
prueba de catalasa, prueba de oxidasa, prueba de O/F y motilidad.
microbitos blog Sitio web:
http://microbitosblog.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-primarias
● Carmona V.(2013).Diversidad de las pruebas de diversidad. sitio web:
ttps://www.researchgate.net/publication/260192894_La_diversidad_d
e_los_analisis_de_diversidad
● Rodríguez C.(2001)Manual de medios de cultivo. 2ed. editorial
BIOCEN.La Habana.
● Madigan, M. T., J. M. Martinko y J. Parker. 2003. Brock. Biología de los
microorganismos. 10ªEd. Prentice Hall Iberia. España
● Briceño, K. (2018). Índice de Simpson: Fórmula, Interpretación y
Ejemplo. lifeder Sitio web: https://www.lifeder.com/indice-simpson/

ANEXOS

Figura 1. Tubos con solución salina y muestra del suelo de Pinus Maximartinezii.
Figura 2 y 3. Placas con una gran diversidad de organismos sembrados en distintos medios, TG y
Chromagar.

Figura 4. Preparación de la técnica de sembrado.

 Figura 5. Resultados de la prueba con el reactivo de Ehrlich.

Figura 6. Prueba de OF con aceite, vista después de una

semana.

Figura 7. Prueba de OF sin aceite, vista después de una

semana.