RESUMEN

En esta práctica vamos a hacer un recuento de bacteria viables de una serie de muestras
de leche. Para ello vamos a sembrar un medio de cultivo , en este caso PCA (Place
Count Agar) con una serie de diluciones de lucha cruda .Una vez hechas las diluciones y
sembradas en las placas de Petri ,las dejaremos un tiempo determinado y contaremos las
ufc (unidades formadoras de colonias) de cada placa ,siendo solamente válidas las que
estén en el rango de 15 a 150 colonias.

El material que vamos a utilizar es el básico del laboratorio microbiológico ,así como el
trabajo realizado en condiciones estériles ,para lo cual emplearemos autoclave ,cabina
de flujo laminar, quemador Bundsen , etc…

Los resultados avalan más o menos la característica de que en cada dilución

desarrollada ,que era en grado 10, descendía el número de colonias en el mismo grado.

INTRODUCCION

Sabemos que la leche es un producto biológico con una serie de características , siendo
la más importante la nutritiva al contener carbohidratos , proteínas , grasas , etc…

La leche cuando es ordeñada del animal incorpora otros componentes, entre los que
están los microorganismos.En condiciones higiénicas normales incorpora hasta 105
ufc/ml , frecuentemente enterobacterias.Así la leche se comercializa la mayor parte
después de un proceso de pasteurización UHT , para que contenga un número máximo
de 5 ufc/ml de enterobacterias.

En la práctica vamos a comparar el recuento de bacterias viables de la leche UHT con

las de la leche cruda.

No obstante la leche cruda al tener un gran número de bacterias ,habrá que diluirla, en
una seire de diluciones , 100,10-1,10-2,10-3,para hallar la más adecuada para el recuento
de colonias.

Una vez que tengamos el recuento de las colonias en cada placa , calcularemos el
número de ufc/ml de cada una de ellas mediante la fórmula :

∑colonias / (Vol muestra sembrada placa x dilución muestra sembrada)

Posteriormente realizaremos el cálculo de la media y la desviación estándar de todas las

diluciones y comprobaremos cual es la mejor de las series de diluciones para determinar
las ufc/ml de la leche cruda.
OBJETIVOS

El objetivo principal de la práctica es el de familiarizarse con las condiciones de trabajo

de un laboratorio microbiológico.Para ello nos valemos del recuento de bacterias viables
en la leche cruda y sus diluciones.

Así como el realizar correctamente un banco de diluciones a partir de una muestra dada.

Realizar los cálculos correctos para determinar el número de ufc/ml , poniendo atención
al factor de dilución y al volumen de la muestra sembrada en la placa.Así sabremos cuál
es la dilución más adecuada para el recuento de bacterias en la leche cruda.

METODOLOGIA

Para preparar el medio de cultivo donde se sembraron las muestras se realizó una
disolución de 1,41 gr de PCA (Plate Count Agar) en 60 ml de agua
destilada.Posteriormente se midió su Ph con el Ph-metro (Crisson Micro Ph 2000)
previamente calibrado y con una precisión de ± 0,02.Como nos dio una medida de 7,00
no hubo que ajustarla con las soluciones de NaOH , o de HCl.

Se esterilizón en el autoclave durante 20 min a 1210C y 1 atm.Después para trabajar en

condiciones estériles se repartió el medio de cultivo dentro de una cabina de flujo
laminar entre 5 placas de Petri , donde se dejo solidificar durante unos 40 min.

Para la realización de un banco de diluciones a partir de una muestra dada,se trabajó

también en un ambiente esteril alrededor de un mechero Bundsen.Para ello se cogió 0,1
ml de volumen de leche correspondiente y se diluyó en 0,9ml de Ringer ,utilizándose
micropipetas automáticas y tubos de Eppendorf.

La siembra de las placas se realizón con una nasa de Digralsky , depositando 0,1 ml de
cada una de las muestras de leche en la superficie del medio de cultivo y sembrándolo
con dicha nasa .Las placas después derotuladas se metrieron dentro de la incubadora a
370 durante 48 horas en posición invertida para impedir que si se formara condensación,
las gotitas cayeran sobre el cultivo.

Se realizó el contaje de las colonias aparecidas en cada una de la placa.Para favorecer

dicha acción se dispuso las placas a contraluz y con un rotulador se iba marcando cada
colonia en el dorso de la placa.

Posteriormente se realizaron los cálculos y el tratamiento estadístico de los datos

obtenidos por el conjunto de la clase.
RESULTADOS

Los resultados de las 5 placas fueron los siguientes:

TIPO DE LECHE COLONIAS VALIDEZ

UHT 1 SI
LC 100 74 SI
LC 10-1 8 NO
LC 10-2 0 NO
LC 10-3 2 NO
Tabla 1 : Recuento de colonias en las cinco placas de Petri

En una primera ojeada a la Tabla 1, vemos que hay dos placas válidas, y el resto no , ya
que el rango de validez era de 15-150 colonias.Decimos que hay dos porque en la placa
de leche UHT por definición debe de haber <5 ufc/ml , que es lo que marca la ley,por lo
que la podemos considerar como placa válida.

Una de las premisas que queríamos observar si se cumple en parte, ya que de la LC 100
a la LC 10-1 hay una disminución ≈ grado 10,que es una de las hipótesis de partida , que
en cada dilución de grado 10 disminuyeran las colonias en grado 10 también.Por eso
pensamos que ha habido poco crecimiento en la serie,ya que si en la primera dilución
hubiese habido más colonias posiblemente habría habido más en las siguientes.

En cuanto a los resultados del grupo entero tenenmos los siguientes valores:

UHT : 6,0,7,6,1,>150,6

LC 100 : >150,>150,95,>150,74

LC 10-1: 70,70,27,115,38,22,8

LC 10-2: 16,6,8,62,0,7

LC 10-3: 2,2,0,>150,10,2,28

Con estos datos y aplicando la fórmula :

Ufc/ml = ∑colonias / vol. Muestra x dilución muestra

Construimos la siguiente tabla:

Muestra de leche y Placas Totales Placas Válidas Media ufc / ml Desviación Estándar
dilucción ±

UHT 7 6 4,33 3,01

CRUDA 100 5 2 845 14,84
CRUDA 10-1 7 6 5700 35,179
CRUDA 10-2 6 2 39000 35,526
CRUDA 10-3 7 1 280000 ----
Tabla 2 : Resultados del conjunto de la práctica.

Vemos en la Tabla 2 que la premisa de que la leche UHT tiene que tener por ley un
máximo de 5 ufc/ml si se cumple ,ya que hecha la media nos da 4,33 ufc/ml ,por lo que
esta parte de la práctica ha resultado satisfactoria.

En el resto vemos que no ha sido así , ya que,ha habido varias placas con
contaminación, lo que desvirtúa los resultados posteriores.Por ejemplo en la disolución
normal 100 sólo han resultado válidas dos placas , lo que hace que el error se acentúe en
demasía.

Por lo que no podemos decir qué dilución es la más adecuada para poder determinar las
ufc/ml de la leche de vaca cruda.

CONCLUSIONES

En el capítulo de conclusiones podríamos decir que de las dos premisas que se nos
pedían al principio ,solamente una la hemos podido probar.La leche de vaca
pasteurizada UHT tiene menos de 5 ufc/ml como exige la ley.

La otra condición que nos pedían, qué dilucción de leche cruda era la óptima para poder
medir las ufc/m en dicha leche,no la podemos responder debido a los claros casos de
contaminación que se han producido en el proceso.

Por lo tanto la conclusión final en cuanto a los resultados sería la de repetir el

experimento.

No obstante en cuanto al objetivo de familiarizarse con el método de trabajo en un

laboratorio de microbiología,así como el de realizar bancos de dilucciones , y el resto
del trabajo creo que se ha visto cumplido.