UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE HIGIENE Y SEGURIDAD
INDUSTRIAL

PREPARACIÓN - DILUCIÓN DE MUESTRAS AMBIENTALES. ENUMERACIÓN

DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES.

TERCER LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

HUGO NELSON HUARI RAMOS - 20162212H

REYES OBREGON JOSEPH JOEL - 20180619I
FABRICIO TORRES SILVA – 20180272I

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
12 de Abril de 2019
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INDICE

I. RESUMEN
II. INTRODUCCIÓN
III. OBJETIVOS
A. OBJETIVO GENERAL
B. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
IV. MARCO TEÓRICO
V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A. MATERIALES
B. METODOLOGÍA
VI. CONCLUSIONES
VII. RECOMENDACIONES
VIII. FUENTES DE INFORMACIÓN
BIBLIOGRAFÍA
IX. ANEXOS
X. APÉNDICE

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I. Resumen
La elección de los métodos de laboratorio a utilizar para la detección de
contaminación microbiana debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados
y de alta sensibilidad que hayan sido validados por los organismos
internacionales o nacionales.
Para implementar cualquier método de detección, se requiere preparar las
muestras del alimento, lo que generalmente consiste en la elaboración de
diluciones que permitan disminuir la concentración del microorganismo en la
muestra y poder observar mejor.

II. Introducción
Los alimentos, al igual que el agua, no son, en general, productos estériles.
En el caso del agua, sobre todo en el agua potable, además de presentar una
baja carga microbiana, determinadas especies microbianas deben estar
ausentes. En el caso de los alimentos, la carga microbiana varía dependiendo
del tipo de alimento.

La calidad microbiológica del agua y de los productos alimentarios hace

referencia a dos aspectos fundamentales: la calidad higiénico-sanitaria y la
calidad comercial. La primera tiene una gran importancia debido a que su
ausencia conlleva un considerable riesgo para la salud del consumidor, ya que
tanto el agua como los alimentos pueden ser vehículos de microorganismos
patógenos. Respecto a la segunda, cabe señalar que hay microorganismos
que aunque carezcan de significado sanitario, pueden ser causa de la
alteración del agua o alimento, modificando el color, aroma, sabor,
consistencia o aspecto.

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III. Objetivos
a. Objetivo General:
 Cuantificar la población de microorganismos aerobios viables en
determinada muestra.

b. Objetivos Específicos:
 Valorar la importancia de la toma de muestras.
 Aplicar en la práctica las técnicas de preparación y dilución de muestras para
conseguir un adecuado recuento de microorganismos aerobios mesófilos.
 Aprender el reconocimiento de numeración de microorganismos mediante
los métodos de Recuento en Placa por Siembra en profundidad y en
superficie.

IV. Marco Teórico

MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS

En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de desarrollar en

presencia de oxígeno a una temperatura comprendida entre 20°C y 45°C con una
óptima entre 30ºC y 40ºC. El recuento de microorganismos aerobios mesófilos, en
condiciones establecidas, estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de los productos analizados, indicando
además de las condiciones higiénicas de la materia prima, la forma como fueron
manipulados durante su elaboración. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no
implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora bien, salvo en
alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar:

- Excesiva contaminación de la materia prima. - Deficiente manipulación durante el

proceso de elaboración.

- La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.

- La inmediata alteración del producto.

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En el uso o la interpretación del recuento de microorganismo aerobios mesofilos hay

ciertos factores que deben ser tenidos en cuenta:

Este recuento es sólo de microorganismos vivos.

La utilidad del indicador depende de la historia del producto y el momento de la toma

de muestra. En alimentos perecederos manipulados correctamente pueden
desarrollar recuentos elevados y perder calidad si son almacenados por un período
de tiempo prolongado. En este caso, el recuento no se encontraría elevado por la
condición de higiene del producto, sino por la vida útil del mismo.

- Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboración, por ejemplo, un proceso

térmico, pueden enmascarar productos con altos recuentos o condiciones deficientes
de higiene. Además, el almacenamiento prolongado en congelación o con pH bajo
puede producir una disminución del recuento.

- El recuento de mesófilos nos indica las condiciones higiénico sanitarias de algunos

alimentos, pero no tiene significado sanitario

- En otros productos que han sido madurados con bacterias (por ejemplo, quesos) o
alimentos que dentro de su formulación tienen conservadores.

TÉCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO

Existen diferentes métodos para realizar el recuento de las bacterias, ellos son:

Recuentos celulares directos (físicos).

 Recuento directo en cámaras al microscopio óptico común.

 Microscopía de fluorescencia.
 Recuento en contadores electrónicos de párticulas.

Recuento de bacterias viables.

 Recuento de unidades formadoras de colonias.

 Determinación del numero mas probable.
 Estimación del numero por el método de las diluciones por extinción.

Masa celular (físico)

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 Directa: por pesada.

 Indirecta:
 contenido de nitrógeno (químico).
 por turbidimetría.
 contenido de fosfolípidos.

FASES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO

Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:

1. La fase lag en la que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones

y pone en marcha su maquinaria metabólica para poder crecer activamente.

2. La fase exponencial.

3. La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo

que no significa que no se dividan algunos, sino que la aparición de nuevos
individuos se compensa por la muerte de otros.

4. La fase de muerte en la que el número de microorganismos vivos disminuye

de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes
circunstancias.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parámetros. No

debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parámetros
del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de
ellos podemos medir el resto. Entre los métodos principales de recuento de
microorganismos podemos destacar:

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 TURBIDEZ

Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen

microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las células
en suspensión y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un
espectrofotómetro que mide la cantidad de luz que transmite una solución o un cultivo
líquido de células microbianas. A mayor masa de células en un cultivo, mayor será su
turbidez, y menor la cantidad de luz que se transmitirá de manera que la lectura en el
espectrofotómetro será mayor. Se utiliza en cultivos densos.

 RECUENTO DE COLONIAS O RECUENTO ESTÁNDAR EN PLACA

Es un método muy utilizado cuando se necesita determinar el tamaño de la población

bacteriana de una muestra. El recuento de microorganismos, en este caso, se basa
en que cada uno desarrollará una colonia visible. Pero debido a que una muestra no
es totalmente homogénea con respecto a su composición microbiológica, es posible
que una colonia se origine de un microorganismo o de cientos de ellos, dando en este
último caso un recuento menor del real. También es posible que muchas de las
bacterias presentes en la muestra no puedan crecer en las condiciones elegidas (pH,
temperatura, medio de cultivo, tiempo, etc.). En este caso el recuento también será
inferior al real. Lo que sí se sabe es que cada colonia observada se formó a partir de
por lo menos un microorganismo. Esta es una condición necesaria y suficiente.
Entonces la colonia es considera una unidad formadora de colonia (ufc) a los efectos
de los cálculos.

 RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA DE PROFUNDIDAD

Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 35ºC sobre placa de Petri
que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se
rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las
placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un
método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios
facultativos o microaerofilos.

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 RECUENTO EN PLACA DE SIEMBRA POR EXTENSIÓN EN SUPERFICIE

Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la

superficie de un medio de cultivo en placa Petri. En este método todas las colonias
crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el
recuento de bacterias aerobias

CRECIMIENTO BACTERIANO

 Durante la fase de adaptación o rezago, las bacterias se adaptan a las

condiciones de crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales
están madurando y no tienen aún la posibilidad de dividirse. Durante la fase
de adaptación del ciclo de crecimiento de las bacterias, se produce la síntesis
de ARN, enzimas y otras moléculas. Así que en esta fase
los microorganismos no están latentes.
 La fase de liberación logarítmica o exponencial es un período caracterizado
por la duplicación celular.5 El número de nuevas bacterias que aparecen por
unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no
se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto, el número
de células de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo.
 Durante la fase estacionaria, la tasa de crecimiento disminuye como
consecuencia del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos
tóxicos. Esta fase se alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los
recursos que están disponibles para ellas. Esta fase se caracteriza por un
valor constante del número de bacterias a medida que la tasa de crecimiento
de las bacterias se iguala con la tasa de muerte bacteriana.

 En la fase de declinación, las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.

Este modelo de crecimiento del cultivo básico en lotes se mantiene y pone su
énfasis en los aspectos de la proliferación de bacterias que pueden diferir de
las del crecimiento de la macrofauna. Se hace hincapié en clonalidad, división
asexual binaria, el breve tiempo de desarrollo en relación con la replicación en
sí, la tasa de mortalidad aparentemente baja, la necesidad de pasar de un
estado inactivo a un estado reproductivo y, por último, la tendencia de cepas
adaptadas de laboratorio para agotar sus nutrientes.

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V. Procedimiento Experimental
a. Materiales
 Licuadora y vaso de licuadora  Balanza
 Balanza  Pipeta bacteriológica de 10ml
 Cuchillo  Pipeta bacteriológica de 1ml
 Pinza  Refrigeradora
 Espátula estéril  Tubos de ensayo
 Tijera  Matraz
 Placas Petri de vidrio

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b. Metodología

MÉTODO 2
Dilución:

Procedimientos:

1. Pesar 10gr de muestra en condiciones de asepsia.

2. Homogenizar con 90ml de solución diluyente (AP) en licuadora.
3. Realizar disoluciones decimales empleando tubos con 9.0ml de solución
diluyente.
4. Adicionar previamente de 15 a 20ml de agar (APC) triptona extracto de
levadura fundido y enfriado a 45°C en placas Petri estériles y dejar solidificar
el APC.
5. Depositar 1.0ml de cada disolución en cajas Petri estériles.

Siembra:

Procedimientos:

1. Para la siembra por diseminación emplear la espátula de Drigalsky.

2. Dejar secar superficie de placa por 10min.
3. Incubar las cajas en posición invertida a 35 °C por 72h.
4. Adicionar control de esterilidad:
- Más 1ml de AP estéril y APC (15-20ml)
- Más APC (15-20ml)
5. Contar aquellas placas que tengan entre 30 a 300 colonias y reportar con
ufc/gr.

VI. Conclusiones
 El recuento de colonias se realizará después de la inoculación y respectiva
incubación del cultivo a la temperatura adecuada en nuestro caso es la
temperatura de 35°C.
 Existen diversos métodos para contar colonias, el que se utiliza más es el
Pour Plate; sirve para hacer el análisis cuantitativo como el cualitativo.

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VII. Recomendaciones
 Al tomar la muestra de carne molida de la licuadora con la pipeta estéril de
10ml.
 Hacer la inoculación con pipeta estéril de 1ml.
 Hacer el debido proceso con un mechero para mantener la esterilidad de los
objetos a emplear.

VIII. Fuentes de información

Bibliografía
MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA-Tomo I: Microbiología Ambiental I ManacordaA.
M., Cuadros D. P y Álvarez A. S. Año 2007

Gamazo, C., López-Goñi, I., y R. Díaz. 2005. Manual práctico demicrobiología. Ed. Masson.
S.A. Barcelona. España

Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack.Brock. 1998.Biología de los

Microorganismos. Ed. Pretice Hall. 8ª edición.

R. Díaz, y col. 1999. Manual Práctico de Microbiología. 2a edición. Ed.Masson, Barcelona

IX. Anexos

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X. Apéndice
a. Diagrama de flujo

MÉTODO 1

Dilución:

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Siembra:

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MÉTODO 2:

Dilución y Siembra:

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b. Procedimiento calculo
Muestra de carne: 10gr.
Agua peptonada (AP): 90ml
Agar APC: 10 a 15 ml

c. Datos obtenidos:

MÉTODO 1
N° de
Placa Petri
colonias
AP+APC 1
APC 2
-5
10 115
10-4 Es el primero que se le
78
añadió el APC.
10-3 138
10-2 153
10-1 296

MÉTODO 2
N° de
Placa Petri
colonias
AP+APC 2 Se presentó vapor en la
APC Ninguna placa.
10-5 5
10-4 44
-3
10 90
10-2 126
10-1 17 colonias contables,
17
las otras están muy
juntas no se pueden
contar.

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CONTEO DE COLONIAS:

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