LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA: Tinción diferencial o prueba de Ziehl Neelsen

Introducción

La Coloración de Ziehl-Neelsen es una coloración diferencial útil en la identificación de

Micobacterias, aunque no permite la diferenciación de distintas especies. La característica de
ácido-resistencia de estos microorganismos hace de esta coloración un método rápido en el
diagnóstico, presuntivo, de infección micobacteriana. Las micobacterias son coloreadas de rojo
por la Fucsina y retienen el color a pesar de la acción del ácido y del alcohol Esta coloración es útil
en la detección de bacterias del género Mycobacterium en muestras de esputo. La presencia de
bacilos rojos sobre fondo azul constituye un diagnóstico casi definitivo de tuberculosis La
Coloración de Ziehl-Neelsen utiliza tres reactivos. El colorante primario es la fucsina que tiñe toda
la preparación de rojo brillante, como mordiente se utiliza flameado de la preparación con el
colorante. La solución decolorante elimina el colorante primario excepto el de los bacilos ácido
alcohol resistente. (BAAR). Por último, el azul de metileno tiñe de azul el resto de la preparación.
Los BAAR se observan en rojo, todo el resto (contraste) aparece en celeste o azul.

El objetivo de esta práctica se basa en el aprendizaje de la tinción de Ziehl-Neelsen, para la

posterior visualización de bacterias ácido-alcohol resistentes, también lograr identificar
estructuras propias de la morfología microscópica de una tinción de Ziehl-Neelsen y reconocer que
significa la presencia de todos los diferentes tipos de bacterias que se pueden observar.

¿Por qué se realiza esta prueba? La realización de esta prueba de laboratorio es de suma
importancia en lo que es la microbiología clínica, y el diagnostico de algunas enfermedades, es
necesario que la reconozcamos de manera correcta, es indispensable en la identificación de
bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR), como M. tuberculosis o el Phylum Apicomplexa
(coccidios intestinales) entre otros como bacterias del género Nocardia.

Competencias

 El estudiante identifica a través de la tinción o prueba de Ziehl Nelseen para la

visualización de estructuras bacterianas, la presencia de bacilos acido alcohol resistentes
(BAAR), en muestras de pacientes con patología sospechosa de tuberculosis, diferenciando
tanto (bacilos del género Mycobactrium en muestras de esputo así como también otros
bacterias de distintos géneros en la proporción de un diagnostico en la microbiología
medica
 El estudiante conoce los principios teóricos básicos en los cuales se basa la técnica de
tinción de Ziehl Neelsen, como lo es el conocimiento el concepto de acido alcohol
resistencia.
Procedimiento

Foto No. 1 (Toma de muestra)

Una vez realizado el frotis y después de fijarlo iniciamos la técnica de tinción diferencia de ZIenhl
Neelsen, recordemos que una tinción diferencial es el proceso en el cual se aplican dos colorantes,
un colorante primario que seria la fucsina fenicada y el colorante de contraste azul de metileno de
Loeffler al 1%, y un decolorante que es el alcohol-ácido Ziehl Neelsen, que permiten diferenciar la
composición de la pared celular bacteriana.

Para efectuar la técnica de tinción, el primer paso requirió la aplicación de calor a la muestra, este
procedimiento se realizó mediante el calentamiento directo sin embrago el proceso también se
puede llevar a cabo de manera indirecta con vapor:

1. Se coloco el portaobjetos sobre el puente.

Foto No. 2 (Muestras en portaobjetos sobre el puente)

2. Se aplicaron unas gotas del colorante primario Fucsina fenicada a los portaobjetos
evitando que este escurriera.
 Foto No. 3 (aplicación de la Fucsina fenicada)

3. Se calentó el frotis haciendo pasar el mechero encendido en lapsos de 5 a 10 segundos, y

luego se esperaron algunos minutos, específicamente 5 minutos, se realizó lo que
llamamos proceso de flameado, fue importante evitar que el colorante hirviera, se secara
o que se cristalizara.

Foto No. 4 (Calentamiento del frotis con el mechero)

Durante el calentamiento el colorante tiñe a todas las células.

4. transcurrido el tiempo el portaobjetos se lavo con agua hasta que salió el color.

Foto No. 5 (Enjuague de las muestras)

5. Posteriormente se agregaron unas gotas de alcohol-ácido Ziehl Neelsen hasta que el

reactivo escurrió incoloro.
 Foto No. 6 (Aplicación de Alcohol-acido Ziehl Neelsen)

6. Inmediatamente se lavó el exceso de reactivo.

Aunque a simple vista no lo podamos observar con la decoloración se arrastra la fucsina

fenicada al exterior de las células no acido ósea alcoholes resistentes por lo tantos estas
quedan incoloras

7. Una vez eliminado el exceso de alcohol acido se vertieron unas gotas del colorante de
contraste que como ya dijimos es el azul de metileno del Loeffler al 1% y dejamos que este
actuara durante 3 minutos. Este último reactivo solo impacta el color de las bacterias que
durante la decoloración perdieron al colorante primario, las cuales se tornan invisibles en
la coloración y reaccionan con el azul de metileno.

Foto No.7 (Aplicación del colorante de contraste)

Materiales utilizados

- Portaobjetos
- guantes
- Cultivo bacteriano
- Asa bacteriológica
- Mechero
- Puente
- Frasco con el colorante primario (fucsina fenicada)
- Frasco con el decolorante alcohol-ácido Ziehl Neelsen
- Frasco/tarro con el colorante de contraste azul de metileno de Loeffler al 1%
- Pinzas
- Aceite de inmersión
- Microscopio

Resultados

Luego de dejar secar la muestra en el portaobjeto ya preparado, utilizamos el aceite de

inmersión y nos alistamos para observar en el microscopio con objetivo de 100x, observando
su morfología, agrupación y color.
 Foto No. 8 (Visualización de resultados en el microscopio Tinción de Ziehl Neelsen)

Observamos un fondo celeste característico de una tinción de Ziehl Neelsen así como
micobacteria aislada y tenemos unos pequeños cocos azules. También identificamos
gérmenes, otros organismos y material de soporte. Recordemos que las bacterias teñidas
color rosa-morado son las acido-alcohol resistentes indicando su positividad frente al alcohol.
y que este caso no observamos, tuvimos una débil visualización en el caso de la foto anexada
no se aprecian, por el contrario observamos bacterias de color azul que son las no acido-
alcohol resistentes, esto se debe a que la pared de estas bacterias carecen de los
mencionados ácidos micólicos y otros lípidos que no permiten el paso de los colorantes por
esa razón se calienta el frotis, por lo que el colorante es arrastrado fuera de la célula y
entonces toma el color azul del colorante de contraste en este caso el azul de metileno del
Loeffler al 1%.

Conclusión

La tinción de Ziehl Neelsen es de suma importancia clínica y microbiológica, ya que nos

permite identificar mycobacterias. La ácido-alcohol resistencia es la capacidad de incorporar
ciertos colorantes y retenerlos después de someterlos a la acción de ácidos y alcohol y está
determinada por la presencia en la pared celular de los ácidos micólicos que son ácidos grasos
de cadenas rarmificadas de alto peso molecular.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese

la pared bacteriana que contiene ceras. La tinción consta de tres fases: 1-Tinción en caliente
con un colorante básico, 2-Decoloración en frío con una mezcla ácido-alcohol, 3-coloración de
contraste.

En esta práctica de laboratorio se logró implementar y evaluar la tinción de Ziehl Neelsen,

posterior a la realización del procedimiento, se observó en el microscopio con el objetivo
adecuado y sugerido por la encargada de laboratorio (objetivo de 100x) y vimos algunas
estructuras bacterianas en mayor cantidad las teñidas de color azul las NO acido alcoholes
resistentes y por otro lado se logró una nula visualización de micobacterias teñidas de rosa
(evidencia de bacilos acido alcohol resistentes).
Referencias

- Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Introductory Microbiology (1st ed.).
Cambridge University Press.
- Matos Dueñas K-Therine,(2018). Scribd. COLORACION ZIEHL Recuperado de:
https://es.scribd.com/doc/105657001/COLORACION-ZIEHL
- Lic. Lourdes M. Expósito Boué1, Téc. Ania Elba Bess Terry2, Lic. Milagros Pérez
del Valle.3 (2010). Revista de información científica EVALUACION DE LA
COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA recuperado de:
https://www.redalyc.org/pdf/5517/551757306007.pdf