ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

VICERRECTORADO ACADÉMICO
DIRECCIÓN DE DESARROLLO ACADÉMICO

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FACULTAD DE RECURSOS NATURALES
CARRERA DE INGENIERÍA FORESTAL

GUÍA DE LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA FORESTAL

PARALELO: SÉPTIMO “B”

PRÁCTICA No. -3 Obtención de las diferentes metodologías para establecer tejidos

vegetales en condiciones asépticas, además determinar el efecto de soluciones desinfectantes
y tiempos de exposición a las que son sometidos los tejidos y por ende localizar, disectar y
sembrar in vitro diferentes tipos de explantes.

DATOS GENERALES:

NOMBRE: (estudiante(s) CODIGO(S): (de estudiante(s)

Roxana Vilema 607

Erika Peña
Karen Sánchez
Evelyn Chicaiza
Daniel Guevara
Isaias Huisha 655
Luis Tugulinago 674

GRUPO No.: 2

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

09/05/19 22/05/19
 1. OBJETIVO:

2.1. Objetivo General:

´
Obtener las diferentes metodologías para establecer tejidos vegetales en condiciones asépticas,
además determinar el efecto de soluciones desinfectantes y tiempos de exposición a las que son
sometidos los tejidos y por ende localizar, disectar y sembrar in vitro diferentes tipos de
explantes.

2.2. Objetivos específicos:

 Aprender la metodología para establecer tejidos vegetales en condiciones asépticas.

 Determinar el efecto de soluciones desinfectantes y tiempos de exposición a la que son
sometidos los tejidos.
 Obtener los conocimientos para localizar, disectar y sembrar in vitro diferentes tipos de
explantes.

2. EQUIPOS, REACTIVOS Y MATERIALES

 Material vegetal de guarango

 Medio de cultivo
 Jabón anti-bacterial
 Cepillo de dientes de cerdas medianas
 Cloro
 Fungicida (benomil, captan)
 Agitador magnético con control de temperatura
 Bisturí
 Navajas para bisturí estériles del número 11 y 22
 Campana de aire de flujo laminar (limpia y funcional)
 Lámpara de alcohol
 Pinzas de disección
 Alcohol contenido en frasco de boca ancha para flamear bisturís y pinzas
 Cajas Petri estériles
 Servilletas y papel estériles

3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Se tomará segmentos nodales de guarango provenientes de la casa de cultivo y preparados de
acuerdo al procedimiento mencionado en la fase 0, serán lavados con agua corriente y detergente
antimaterial, se cortaran en secciones de tallo con una yema, enseguida se sumergirán en benomil
(1-2gl-1) y después se seguirá el procedimiento indicado en la fase 1 y se establecerá los
siguientes tratamientos:
NaCLO Tiempo (min) N de plantas
3% 5 30
10 30
15 30
90

Análisis de las variables

Tabla 1: Analisis de los explantes vivos

Los resultados de la variable de los explantes vivos, presentaron diferencias significativas entre los
tratamientos (p = 0.384).
Tabla 2: Analisis de los explontes necrosados
Los resultados de la variable de los explantes necrosados, presentaron diferencias significativas entre los
tratamientos (p = 0.5660).

Tabla 3: Analisis de los explantes contaminados

Los resultados de la variable de los explantes contaminados, presentaron diferencias significativas entre
los tratamientos (p = 0.0007).
Tabla 4: Analisis del numero de brotes
Los resultados de la variable número de brotes, presentaron diferencias significativas entre los
tratamientos (p = 0.0573).

4. RESULTADOS

No. No. % % No.

No. Explantes No. Explantes % de
Tratamientos Explantes Explantes Explantes Explantes de
contaminados Necrosados brotes
cultivados muertos muertos Necrosados brotes
5 minutos 30 4 9 30 15 50 36 46,75
10 minutos 30 3 7 23,33 19 63,33 25 32,47
15 minutos 30 14 16 53,33 16 53,33 16 20,78
Tabla 5 : Resultados finales

Los explanter extraídos del banco de plantas donadoras del vivero de la facultad de recursos
naturales se utilizó para establecer en el cultivo in vitro. Como resultado se observó que El mejor
tratamiento para la desinfección de los explantes con 3.0% de hipoclorito de sodio fue en el
tratamiento de 10 minutos, con un 10% de explantes contaminados dándonos como resultado de
un 90% de explantes libres de contaminantes microbianos visibles, estos datos concuerdan con el
estudio realizado por (Núñez et al., 2017) realizado en las mismas condiciones; por otro lado se
observó en los tratamientos de 5 y 15 minutos un alto porcentaje de contaminación.
El mayor número de brotes se registró en el tratamiento de 5 minutos con un 46,76% del total, a
diferencia de los tratamientos 10 y 15 minutos que registraron un número inferior siendo estos
32,47% y 20, 78%.
Se evidencio que en el tratamiento de 10 minutos existió un alto porcentaje de explantes
necrosados siendo este un 63,33%, dato similar al registrado por (Núñez et al., 2017) en el que
menciona que el incremento del tiempo de desinfección favorece la oxidación fenólica.
Con respecto a la mortalidad de explantes se evidencio un alto índice de mortalidad en los
tratamientos de 5 y 15 minutos siendo estos 30% y 53,33 %; esto quiere decir que el tratamiento
de 10 minutos en el mejor con un porcentaje de 23,33%.

Tratamiento: 5 minutos Tratamiento: 10 minutos Tratamiento: 15 minutos

Gráfico:1 Explantes con mejor resultado.

5. EVALUACIÓN:
¿Cuáles son los principales patógenos que se encontró en el establecimiento de cultivo?
Los principales patógenos que se han encontrado en el establecimiento de cultivo son hongos y
bacterias. Uno de los principales sistemas utilizados para obtener semilla original es la
multiplicación in vitro o micropropagación para la posterior obtención de minitubérculos libres
de patógenos. Los medios de cultivo utilizados en este sistema proveen una mezcla rica en
nutrientes que puede permitir también el rápido desarrollo de hongos y bacterias. Una vez que
estos contaminantes se establecen en el medio de cultivo crecen rápidamente agotando los
nutrientes del medio y produciendo toxinas dañinas para el explante (Pérez, 2016).

Hongos: Los hongos son microorganismos eucarioticos filamentosos que por lo general no
presentan pigmentos fotosintéticos, con núcleo rodeado de membrana, con una reproducción
sexual o asexual (Morales, s.f.).
Bacterias: Las bacterias son consideradas como los contaminantes más comunes y las que
ocasionan los problemas más serios, porque pueden ser sistémicas, y su detección es más difícil.
La mayoría de las bacterias aisladas como contaminantes del cultivo de tejidos son especies que
no se conocen como patógenos de plantas in vivo. A diferencia de los hongos y levaduras, estas
bacterias no producen crecimiento visible en el medio o síntomas en las plantas hasta un tiempo
después de haber sido introducidas dentro del cultivo de tejidos. Esta habilidad para establecerse
latentes hace que sea difícil inferir la fuente de contaminación así como el momento en que las
bacterias son detectadas en las plantas. Muchas de ellas son introducidas con el explante,
mientras que otras son claramente introducidas en el laboratorio durante el subcultivo
(Folgueras, 2000).
 ¿Qué sugerencias considera necesarias para atenuar la contaminación?

*Para lograr atenuar la contaminación en la práctica sería necesario tener la adecuada asepsia en
el medio de cultivo, realizar paso a paso los procedimientos para colocar los explantes en el
medio de cultivo y utilizar adecuadamente el etanol.
*Según Perik nos dice que existen diversas ténicas de atenuar contaminación como el usos de
fungisidas y antibióticos en la planta madre, el explante o el medio de cultivo; Sin embargo no se
recomienda la adición de antibióticos al medio para controlar la contaminación bafcteriana
porque no son efectivos en la mayoría de los casos. Ocasionalmente puede ocurrir el
ennegrecimeinto del tejido, con posterior necrosis del explante. Para evitarlo se sugiere disminuir
la intensidad de la luz, agregar antioxidantes al medio y el explante, subcultivar con frecuencia y
sumergir el explante en medio líquido por un día (Pierik, 1987).

6. CONCLUSIONES
 Se pudo concluir que el mejor tratamiento en cuanto a la especie forestal que es el
Guarango fue el de 10 minutos, dándonos un porcentaje de contaminación del 10% a
comparación del tratamiento de 5, 15 minutos que su grado de contaminación fue mayor
y el número de explantes contaminados en el tratamiento de 10 minutos fueron 3, menor
a los demás tratamientos, la cual se rectifica que es el mejor tratamiento para un
desarrollo de calidad de los diferentes explantes sembrados.
 Se concluye también que en el caso de la mortalidad de explantes el tratamiento de 10
minutos responde mejor ya que se registró un porcentaje menor de mortalidad a
diferencia de los tratamientos 5 y 15 minutos. Con esto se ratifica que el tratamiento de
10 minutos es el más adecuado.
7. RECOMENDACIONES
 Se recomienda tener la asepsia adecuada en el medio de cultivo ya que de esta manera se
puede reducir considerablemente la contaminación en los explantes.
 Para reducir la mortalidad se recomienda tener un buen material de propagación y
manejarlos correctamente para evitar pérdidas.

9. BIBLIOGRAFÍA
 Núñez et al., 2017. Establecimiento in vitro de Caesalpinia spinosa (Mol.) O. Kuntz
Disponible en: https://www.academia.edu/13215577/Establecimiento_in_vitro_de_
Caesalpinia_spinosa_Mol._O._Kuntz
 Perez, S. 2016. Hongos contaminantes en el establecimiento in vitro de ápices de papa.
Disponible en: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0258-
59362016000400007 (Consultado el 14 de mayo del 2019).
 Morales, C. s.f. Hongos contaminantes. Disponible en:
https://es.slideshare.net/eportfolio13/hongos-contaminantes (Consultado el 14 de mayo
del 2019).
 Folgueras, Maryluz. La contaminación microbiana en la micropropagación in vitro de las
raíces y tubérculos tropicales/ Maryluz. Folgueras. -Tesis para aspirar al título de Master
en Agricultura Sostenible (Mención Sanidad Vegetal), L. Herrera, Tutor. Santa Clara, Villa
Clara. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, 2000, -71 h.
 Pierik, R. L. M. 1987. IN Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers.
Dordrecht (Netherlands). 343 p.

10. ANEXOS