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Herrera Mejia Maria Juliana 2012
Herrera Mejia Maria Juliana 2012
TRABAJO DE GRADO
MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL
FACULTAD DE CIENCIAS
Bogotá D.C.
2012
USO DE VECTORES LENTIVIRALES PARA MEDIAR LA TRANSFECCIÓN DEL
GEN DE LA ENZIMA N-ACETIL-GALACTOSAMINA -6-SULFATO-SULFATASA
EN CÉLULAS EN CULTIVO
Director
Evaluador
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de
Julio de 1946
AGRADECIMIENTOS
A mi tutor Javier Alméciga por abrirme las puertas del IEIM al brindarme este
trabajo de grado, por compartir conmigo cada uno de sus conocimientos, por
confiar en mí y apoyarme cada minuto con esa palabra de aliento y esa alegría al
llegar al laboratorio.
A todas las personas que hacen parte del IEIM por brindarme esa mano amiga y
A todas las personas que de alguna manera colaboraron y apoyaron para el buen
.
TABLA DE CONTENIDO
1.RESUMEN…………………………………............................................................16
1.1 ABSTRACT…………………………………......................................................17
2. INTRODUCCIÓN……………………………........................................................18
4.3.3 Diagnóstico……………………...………………………..…………………….40
4.3.4 Tratamiento……………………………...……………………………………...43
4.4.1 Generalidades…………………………………...……………………………..45
5. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...56
5.1 Objetivo general…….…………...……...………………………………………..56
6. METODOLOGÍA………………………………………………………………………57
8. CONCLUSIONES…………………………………………………………………….86
9. RECOMENDACIONES………………………………………………………………88
10. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………………..89
INDICE DE FIGURAS
Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares
HEK293 transfectados con vectores lentivirales……………………………………..76
Figura 16. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares
HEK293 transfectados con vectores adenoasociados………………………………80
Figura 18. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados célulares
HEK293 transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1……..82
INDICE DE TABLAS
Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “Células Lentivirus 1 MOI” y grupo “Células
Lentivirus 5 MOI” ………………………………………………………………………121
Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 1
MOI”…………………………………………………………………………...…………123
Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células Lentivirus 5
MOI”…………………………………………………………………………….………..123
Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “Medio células Lentivirus 1 MOI” y grupo “Medio
células Lentivirus 5 MOI”………………………………………………………………125
ANEXO C: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos
en células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-GALNS)
(Realizados en SPSS)……………………………………………………...…………126
Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Células
AVV-GALNS 5 GV” ……………………………………………………………………129
Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Células
AVV-GALNS 10 GV” …………………………………………………………………..130
Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 5 GV” y grupo “Células
AVV-GALNS 10 GV”…………………………………..……………………………….131
Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 1
GV”……………………………………………………………………………………….133
Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS 5
GV”………………………………………………………………………………….……134
Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS
10 GV”……………………………………………………….…………………………..134
Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio
células AVV-GALNS 5 GV” ………………………………….………………………..135
Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 1 GV” y grupo “Medio
células AVV-GALNS 10 GV”…………………………………….…………………….135
Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Células AVV GALNS 5 GV” y grupo “Células
AVV-GALNS 10 GV”……………………………………………………….…………..136
Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1
1 GV”…………………………………………………………………………………….139
Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1
5 GV”………………………………………………………………………………….…140
Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Células AVV-GALNS SUMF1
10 GV”…………………………………………….……………………………………..140
Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo
“Células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”……………………………..………………….141
Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y grupo
“Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”……………………………………………….142
Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Células AVV-GALNS SUMF1 5 GV” y grupo
“Células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”…………………………………..…………..142
ANEXO F: Análisis estadísticos correspondientes a los resultados obtenidos
en medios de células transfectadas con vectores adenoasociados (AVV-
GALNS SUMF1) (Realizados en SPSS)…………………………………………...144
Tabla 1.4.1 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS
SUMF1 1 GV”………………………………………………………………………...…145
Tabla 1.4.2 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS
SUMF1 5 GV”…………………………………………………………………….……..145
Tabla 1.4.3 T-student entre grupo “control” y grupo “Medio células AVV-GALNS
SUMF1 10 GV”………………………………………………………….………………146
Tabla 1.4.4 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 1 GV” y
grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV”………………..………………..147
Tabla 1.4.5 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV” y
grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”………………………………..148
Tabla 1.4.6 T-student entre grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 5 GV” y
grupo “Medio células AVV-GALNS SUMF1 10 GV”………………………………..148
1. RESUMEN
lisados celulares y 5,2 veces en los medios de cultivo con respecto a los valores
del control negativo, lo que los hace buenos candidatos para terapia génica en
Moquio A. Por otra parte, los vectores AAV mostraron un aumento en la actividad
hasta 2,1 veces más tanto en el lisado celular como en el medio. En presencia de
SUMF1 la actividad alcanzó fue 1,9 y 44,5 veces mas alto en el lisado celular y el
in vitro para MPS IVA en el que se pone en evidencia la posibilidad de hacer uso
esta enfermedad.
16
1.1 ABSTRACT
cornea. Currently no effective therapies exist for MPS IVA, for which is important to
evaluate different strategies for the development of a safe and effective therapy for
vector to mediate the delivery of GALNS gene to cultured cells, in comparison with
lentivirals vectors produced a 3.1- and 5.2-fold increase in enzyme activity cell
cells. On the other hand, the AAV vectors showed an increase in the activity up to
of 2.1 times in both cell and culture medium. Furthermore in presence of SUMF1
gene the activity reached up to 1,9 in cell lysate and 44,5 times more in culture
medium than that observed in nontransfected cells. This is the first in vitro assay
for MPS IVA, which demonstrates the feasibility of using lentiviral vectors to
17
2. INTRODUCCIÓN
carácter multisistémico de las MPS (2). Las MPS se producen por acumulación
progresiva de GAGs en los lisosomas de las células del tejido conectivo, incluido
enzimas lisosomales que los degradan en unidades menores dentro del lisosoma.
MPS IVA presenta una incidencia que varía entre 1:45000 nacidos vivos, en
Holanda y Portugal, a 1:76000 nacidos vivos, en Irlanda del Norte (5). Hasta el
18
momento, Colombia no cuenta con cifras sobre la incidencia de esta enfermedad.
Sin embargo, algunos estudios apuntan a que Colombia podría ser uno de los
países con mayor número de individuos afectados con esta enfermedad (6,7).
claros rasgos de individuos afectados con MPS IVA; lo que sugiere la presencia
terapia segura y efectiva para estos pacientes. Dentro de las diferentes opciones,
la terapia génica puede ofrecer al paciente efectos positivos por las siguientes
razones (9): (a) niveles de actividad enzimática del 10% permiten pasar de un
estricta del gen terapéutico, por tratarse de genes de expresión constitutiva, (c) la
ratones y 8 años en perros y (e) la coexpresión con el gen del factor activador de
19
permitido incrementar hasta 3 veces la actividad de diferentes sulfatasas,
partir del cultivo de células 293FT con el fin de realizar una posterior titulación de
20
3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
utilizando terapia de reemplazo enzimático como la más viable. Esta tiene como
dicho procedimiento, y presenta costos que pueden alcanzar los US$500.000 por
Es aquí donde la terapia génica surge como una posible estrategia para el
adecuadamente (20).
21
En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo de la Pontificia Universidad
Morquio A. Los ensayos in-vitro e in-vivo han mostrado la factibilidad de usar estos
paciente MPS IV A. Estos resultados serán comparados con los obtenidos con
22
4. MARCO TEÓRICO- REFERENTES CONCEPTUALES
Los errores innatos del metabolismo son un grupo de enfermedades genéticas que
23
tejidos (25). Entre ellos se encuentran el dermatán sulfato (DS), heparán sulfato
hialurónico (2).
las células del tejido conectivo, incluido cartílago y hueso. Son causadas por la
deficiencia de las enzimas lisosomales que los degradan (26), las cuales se
la cual posee una herencia ligada al cromosoma X, las MPS son desórdenes de
sistema nervioso central. Sin embargo, entre pacientes con la misma deficiencia
24
I (32,33), MPS II (31,34), MPS VI (35,36). Esta última ha demostrado beneficios
37, 38).
25
Enfermeda acetilglucosamin IIIA sulfato
d de a-sulfato-6-
Sanfilippo sulfatasa
D
MPS IVA 253000 N- 16q24.3 Corta estatura, displasia Queratán
Enfermeda acetilgalactosami esquelética severa, sulfato y
d de na-6-sulfato opacidad corneal, condroitín
Morquio A sulfatasa hipoplasia de la sulfato
odontoides, laxitud de
articulaciones
MPS IVB 253010 ß-galactosidasa 3p21.33 Fenotipo similar a MPS Queratán
Enfermeda IVA sulfato
d de (QS)
Morquio B
MPS VI 253200 N- 5q12 Disostosis múltiple, Dermatán
Enfermeda actilgalactosamin opacidad corneal, sulfato
d de a-4-sulfatasa inteligencia normal,
Maroteaux- (arilsulfatasa B) muerte en la
Lamy adolescencia
MPS VII 253220 ß-glucuronidasa 7q21.11 Disostosis múltiple, Heparán
Enfermeda hepatoesplenomegalia, sulfato,
d de Sly presentaciones fetales o dermatán
neonatales, moderado sulfato,
retardo mental. condroitín
4- y 6-
sulfato
La enfermedad Morquio A fue descrita por primera vez por el pediatra uruguayo
26
La incidencia varía entre 1:45000 nacidos vivos, en Holanda y Portugal, a 1:76000
nacidos vivos, en Irlanda del Norte (5). Aunque Colombia no cuenta con cifras que
a que este es uno de los países con mayor número de pacientes Morquio A (6,40).
repetitivas de disacáridos característicos para cada uno de ellos (Tabla 2). Estos
QS, uno de los dos GAGs acumulados en MPS IVA, es un heteropolisacárido que
unidad principal se repite (43). A diferencia de los otros GAGs que presentan una
27
amplia distribución en el organismo, el QS se encuentra principalmente en córnea
tamaño (42).
proteína del núcleo (42), con una longitud que varia entre 8 a 34 residuos, y un
28
o N-acetilglucosamina (46, 50). QS II puede ser dividido así: QS II-A que está
cual están ausentes los residuos de fucosa y ácido N-acetilneuramínico (42, 51).
en MPS IV B, remueve los residuos de galactosa, mientras que las tres isoformas
29
Tabla 2. Estructura de las diferentes cadenas de glicosaminoglicanos.
Condroitín Ácido D- N-
Sulfato glucurónico acetilgalactosamina
(GlcA) (GalNAc)
Dermatán Ácido L- N-
Sulfato idurónico acetilgalactosamina
(IdoA) (GalNAc)
30
diferencia del QS, el C6S se encuentra ampliamente distribuido en el organismo
Los números en la figura corresponden a las enzimas deficientes en 1 = MPS IVA, 2 = MPS IVB, 3 = MPS IIID, 4 = Enfermedad de Sandhoff,
31
4.3.1.2 Gen GALNS
este posee una longitud de 50 kb con 14 exones y 13 intrones. Con excepción del
exón 14 (800 pb), los exones poseen un tamaño entre 67 y 175 pb, mientras que
el tamaño de los intrones varía entre 380 pb (intrón 7) y 14 kb (intrón 14). La señal
gen GALNS, con un marco de lectura abierto de 1,5 kb que codifican para una
p.G301C, p.S162F y p.F69V en pacientes del viejo Caldas, de las cuales la última
32
no ha sido reportada en otras poblaciones (6) (56) Posteriormente, las mutaciones
de ellas puntuales, están asociadas con fenotipos atenuados, mientras que 101 se
encuentran asociadas con fenotipos severos, todas éstas mutaciones sin sentido,
inserciones (54).
33
El péptido señal de 26 residuos dirige la proteína naciente al retículo
Antes de salir del RE tres residuos de glucosa y uno de manosa son removidos del
sulfatasas (61), que para GALNS se encuentra en la posición C79 (59). El residuo
mediante ataque nucleofílico por parte de uno de los grupos hidroxilo al grupo
formilglicina es regenerado (62). FGE es codificada por el gen SUMF1 que posee
abierto de lectura que predice para una proteína de 374 aminoácidos (63,64).
34
otras sulfatasas por saturación del sistema, y (3) coexpresión de una sulfatasa con
ácido siálico, las enzimas lisosomales son modificadas por la adición de residuos
35
siendo esta la base para el desarrollo de terapias de reemplazo enzimático, génica
El dominio N-terminal está conformado por una hoja ß-plegada con 10 cadenas y
36
8 α-hélices, mientras que el dominio C-terminal consiste de una hoja ß-plegada
cargados (59).
desde una forma severa caracterizada por una marcada displasia esquelética,
37
opacidad corneal, enfermedad de válvulas cardiacas y hepatoesplenomegalia
leve, a formas medias o atenuadas con menor compromiso óseo (Figura 4). A
diferencia de otras MPS, los pacientes con MPS IVA no presentan compromiso de
los dos años de vida, siendo los más comunes las deformidades óseas, la corta
desplazada hacia atrás. El genu valgum aparece durante este periodo causando
38
Figura 4. Características Clínicas. Principales características clínicas observadas en pacientes
con fenotipo clásico de mucopolisacaridosis IV A.
39
Debido a los problemas óseos y de articulaciones que dificultan el cuidado
4.3.3 Diagnóstico
este modo las pruebas cualitativas incluyen la precipitación de los GAGs con
40
sensibilidad cercana al 100%, una especificidad alrededor del 90% y la capacidad
de permitir el diagnóstico de pacientes MPS IS, III y IV, los cuales no son
pueden variar desde 1,2% hasta 37% de los valores normales (80), y en
(81).
41
Figura 5. Reacción enzimática del método de cuantificación de actividad GALNS. ß-GAL: ß-
Galactosidasa de Aspergillus oryzae.
(82). Basado en el hecho de que las mutaciones sobre el gen GALNS tienen un
42
espectrometría de masas en tandem (LC-MS/MS), en muestras de sangre y orina,
4.3.4 Tratamiento
De esta manera, alrededor de los 5 años de edad los pacientes Morquio A pueden
43
cirugías en la cadera, rodillas y fémur, para corregir problemas de marcha y
Por su parte, aunque se ha probado que el trasplante de médula ósea puede tener
importantes beneficios, aunque variables, en pacientes con MPS I, II, III y VI (28),
este no es una alternativa para el tratamiento de pacientes MPS IVA debido a que
mientras que en otros tejidos como hueso, pulmón y riñón, los valores fueron
4.4.1 Generalidades
44
La terapia génica es definida como la transferencia de material genético, ADN o
ARN, que se realiza con el propósito de producir algún efecto terapéutico que
reimplantadas.
representan el 83% del total de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha. En
ADN desnudo. Sin embargo, es poco eficiente por el corto tiempo de vida media
debido a la presencia de enzimas que lo degradan (94). Por ello, durante las
optimizar la transferencia génica y lograr una alta expresión del gen de interés
45
durante un periodo prolongado de tiempo (91). En este sentido, el método mas
utilizado para realizar la entrega del gen es el uso de vectores derivados de virus,
entre los que se encuentran los retrovirus, virus del herpes simplex, adenovirus,
Por otra parte entre los vectores no virales se encuentran los polímeros catiónicos,
se han desarrollado métodos físicos que facilitan y aumentan el ingreso del vector
resumidas en la Tabla 3.
46
4.4.3 Vectores derivados de virus adenoasociados y su uso en terapia génica
AAV, cada uno de los cuales posee una afinidad por algún tejido en especial
aumento hasta de 100 veces en la expresión de las enzimas, con respecto a los
En este sentido, la principal diferencia entre los serotipos AAV se encuentra en las
proteínas de la cápside. Los AAV son partículas virales con una cápside formada
por 60 subunidades de las proteínas VP1, VP2 y VP3 en una relación 1:1:18,
47
siendo en tamaño VP1>VP2>VP3 (106). Los 8 serotipos poseen una homología
cadenas, los cuales representan las regiones estructuralmente variables entre los
receptores celulares, por parte de cada uno de los serotipos. Para el caso de
HSPG también es usado por AAV3 (111), mientras que AAV1, AAV4, AAV5 y
AAV6 interactúan con glicanos con ácido siálico terminal (112,115). Las MPS son
excelentes candidatos para su tratamiento por terapia génica debido a que: (1)
atenuadas de la enfermedad (27, 105), (2) debido a que los genes que codifican
48
una regulación estricta del transgén (116), (3) es posible realizar la corrección del
corrección cruzada mediada por el receptor de manosa-6-fosfato (30, 38, 117), (4)
ensayos preclínicos en diferentes modelos animales (ratón, rata, perro y gato) han
permitido niveles enzimáticos terapéuticos hasta por 1,5 años en ratón (118) y 3
en las enfermedades producidas por la deficiencia de una sulfatasa (MPS II, MPS
IIIA, MPS IIID, MPS IVA, MPS VI), la coexpresión con SUMF1, in vitro e in vivo, en
modelos animales de EDL, siendo los más frecuentes los lentivirus, adenovirus y
virus adenoasociados (9). Para el caso de los AAV en las MPS estos han sido
empleados en MPS I (120), MPS II (121), MPS IIIA (11), MPS IIIB (122), MPS VI
49
esta enfermedad. Sin embargo, con el objetivo de incrementar los niveles de
Los lentivirus son el grupo mas complejo de los Retrovirus siendo el VIH el
masa de ~ 2,5 x 108 Da (126-128) y una densidad de 1,16 g/ml en los gradientes
nuclear (CN), una cápside (CA), una matriz asociada a la membrana (MA),
membrana plasmática (125), la cápside contiene el genoma viral ARN y las tres
este puede ser transcrito por la transcriptasa reversa en ADN de doble cadena tras
(132).
50
Figura 6. Composición estructural de los lentivirus.
la transcripción tiene lugar, la envoltura del virus se elimina lo cual permite que el
ARN viral se libere paralelamente con las enzimas necesarias para la transcripción
MA (130, 135-137).
51
Tabla 4. Funciones de las proteínas que componen los Lentivirus (130)
Proteínas accesorias (Nef, Vif, Vpu, Vpr) Importante para la infectividad y patogenicidad
del VIH
final del ciclo de vida viral, el genoma viral de ARN de longitud completa se
transporta fuera del núcleo siendo capturado por la poliproteína gag y la partícula
celular (131).
52
Figura 7. Ciclo de replicación de Lentivirus.
también contienen genes reguladores rev y tat (Figura 8). Rev actúa como un
Además, el gen accesórico vpr, vpu, vig y nef (Figura 8) aumenta la liberación
viral y mejora la capacidad viral para escapar del sistema inmune. Vif (factor
53
la proteína viral R (VPR) causa la fase G2 del ciclo celular en el cual la expresión
estable en las células diana (125, 141), por lo cual se están convirtiendo en los
54
se pueden producir empleando proteínas de la envoltura de otros virus
(pseudotipos) (132).
producción de vectores virales. Cuando el ADN viral se transcribe al ARN del virus
pierde secuencias en el extremo 5' y 3' (la secuencia promotora y la señal del Poly
A). Durante la transcripción reversa, el virus copia las secuencias sobre el extremo
eliminado, la supresión también se copia en el extremo 5' del ARN. Para que la
investigación estándar de la biología celular que involucra una amplia gama tanto
ensayos dirigidos a células T para expresar un gen contra el VIH con resultados
55
5. OBJETIVOS
1. Producir vectores lentivirales a partir de virus derivados del VIH que porten el
células HEK293.
fibroblastos de piel.
56
6. METODOLOGÍA
(Invitrogen) (Figura 9)
57
Las células 293FT se cultivaron en medio medio D-MEM completo suplementado
alcanzar una confluencia del 90-95%. Este día fue considerado como el día
completo con suero sin antibióticos. Para cada muestra a transfectar se preparó
58
incubado a 37°C en una humedad de 5% CO2. Al cabo de 72 horas de
(155).
de PEG 6000 de 8,5 % y 0.3 M de NaCl. La mezcla se incubó durante 1,5 horas a
almacenaron -80°C.
sembradas en una placa de 6 pozos, se incubaron a 37°C con una humedad del
59
se removió y se adicionaron las diluciones de los vectores a la placa. Al siguiente
µg/µL de blasticidina, para seleccionar las células transducidas con los vectores.
Las células fueron cultivadas durante 12 días realizando cambios del medio de
cultivo cada 3 días. Al cabo de los 12 días se removió el medio y las células se
lavaron dos veces con PBS. Enseguida se adicionó cristal violeta y se incubó
transducción (TU)/mL.
Xiao et al. (156). En este método, células HEK293 se cotransfectaron con: (a) el
plásmido portando el gen de interés flanqueado por los ITRs, (b) el plásmido de
empaquetamiento pXX2 el cual portan las secuencias de los genes Rep y Cap del
60
Para la Cotransfección se empleó la mezcla de liposomas catiónicos
pXX6-80 en una relación molar 1:1:1 que corresponde a una relación 5:5:15 en
ADN plasmídico (25 μg) se diluyó en 1,5 mL de medio de cultivo libre de suero
ambiente para permitir que los liposomas formaran los complejos con el ADN;
cultivos de células HEK293, mezclando suavemente por rotación para permitir que
61
y se continuó con la incubación en las mismas condiciones descritas durante 48
un baño de hielo seco con etanol y un baño serológico a 37° C, mezclando con
cuantificación. Bajo estas condiciones las suspensiones virales son estables por
un año.
genomas virales por mL (gv/mL) tiene en cuenta tanto los coeficientes de extinción
de las proteínas de la cápside del serotipo 2 (VP1, VP2 y VP3), como el del ADN
viral, que depende del peso molecular del genoma del vector. Este método permite
purificadas, con una correlación del 98% con otros métodos de cuantificación
solución viral purificada por 10 min a 75ºC con 0,5 µL de SDS al 20%, midiendo la
absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Como blanco se empleó una solución
62
de NaCl al 0,9%, la cual fue tratada de igual forma que las muestras. La
ITRs para cada vector basado en el peso molecular de cada nucleótido: A = 312,2
riñón embrionario humano transformadas con ADN del adenovirus humano tipo 5
(Ad5) (158). Esta línea celular posee una alta eficiencia de transfección, que la
conejo fueron donados por la Dra. Martha Raquel Fontanilla del Grupo de Trabajo
Nacional de Bogotá
63
6.3.2 Transfección células HEK293 con vectores lentivirales (154).
volumen total del medio que contenía los virus tan bajo como fue posible, con el fin
de cultivo de las células y se mezcló el medio que contenía los virus suavemente
medio fresco y 3x1011 gv, 1,8 X1012 gv y 3,6 X1012 gv se adicionaron a cada pozo.
Como control negativo se emplearon células HEK293 sin transfectar. Todas las
64
se recolectó el medio de cultivo y las células se tripsinizaron y resuspendieron en
posteriores análisis.
reemplazó por medio fresco dos horas antes y las células se transfectaron con 1:1
65
La determinación de la actividad enzimática se baso en el método descrito por van
parada (glicina 24 g/L, Na2CO3 21,2 g/L, NaOH 7,5 g/L, pH10) La fluorescencia de
los lisados celulares las unidades de enzima se dividieron por los miligramos de
proteína en el lisado (U/mg), mientras que para los medios de cultivo la actividad
66
Para el análisis estadístico las medias se compararon mediante prueba de t-
67
7. RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
para mejorar la bioseguridad del vector (160); posee HIV-1 psi secuencia
68
El vector contiene el promotor de citomegalovirus humano (CMV) que produce
deaminasa: BSD de Aspergillus terreus (169) o brs de Bacillus cereus (168). Estas
(169).
69
Figura 11. Peso molecular, formula y estructura de la Blasticina (154).
293 FT; esta es una línea celular modificada genéticamente, derivada de células
células mamíferas (172), (2) incluir el gen de codificación SV40 para facilitar la
70
Figura 12. Plásmido pCMVSPORT6.
lentivirales.
71
blasticina. La tabla 5 resume los resultados obtenidos para el proceso de titulación
de los vectores:
10-2 30
10-3 27
10-4 24
10-5 22
10-6 19
por Nair A et al. (176) y Ansorge et al. (131), los cuales estaban en el orden 1011
HEK293 puesto que según las instrucciones del fabricante, lo ideal para llevar a
HEK293.
72
solución viral purificada con títulos virales del orden de 10 13 vg (genomas virales)
/mL (Tabla 5), superiores a los reportados por Zolotukhin et al. (177) y Sommer et
13
AAV-GALNS 4674 3,512 4,000 0,878 3,58 x10
13
AAV-SUMF1 4467 2,535 2,223 1,140 3,97 x10
recuento total de 1,04 x106 células/mL, 5 % mas a lo obtenido por Warncke et al.
73
fibroblastos de conejo. Sin embargo no fue posible obtener el número suficiente de
transducir (sin adición de vector) fueron empleadas como control negativo. De esta
en el control negativo, 0,300 nmol/h/mg con 1 MOI y 0,325 nmol/h/mg con 5 MOI,
74
Actividad Enzimática
Células - Lentivirus
0,4
0,3
nmol/h/mg
0,2
0,1
0,0
Control 1 5
MOI
nmol/h/mg
Figura 13. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con
7
vectores lentivirales (2,1x10 UT/mL).
control negativo (células sin transducir). Según la prueba t-student realizada para
75
estadísticamente significativas entre ellos, indicándose, al igual que en los lisados
Actividad Enzimática
Medios - Lentivurs
0,07
0,06
0,05
nmol/h/ml
0,04
0,03
0,02
0,01
0,00
Control 1 5
MOI
nmol/h/ml
Figura 14. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293
7
transfectados con vectores lentivirales (2,1x10 UT/mL).
Con referencia a lo anterior, Byers et al. (179), basados en terapia génica, hicieron
sugieren que el efecto de la entrega del gen mediante el uso de este tipo de
76
vectores permite una expresión a largo plazo. Por su parte, Kim EY et al. (142)
proteína) que el control (11327,3 U/mg proteína). Así, el nivel enzimático de las
células tratadas fue 2,1 veces mayor que el control. De igual forma, en los medios
de cultivo (18936,6 u/mg) fue 2,4 veces más que en el control (8011,2 u/ml).
Ridet et al (180) evaluaron la entrega del gen GPX1 (LV-GPX) mediada por
lentivirales.
gen GALNS (AVV GALNS) se evaluaron 3,6 x 1011 genomas virales (gv), 1,8 x
1012 gv y 3,6 x 1012 gv. La actividad enzimática en los lisados celulares fue
mientras que las células sin transfectar la actividad fue de 0,0035 nmol/h/mg
77
(Figura 15). Estos resultados sugieren que existe un máximo de vector tolerado
Los valores anteriores fueron menores a los reportados por Alméciga CJ (14)
puesto que durante su estudio, los valores de actividad enzimática con el promotor
una actividad enzimática final de 12,64 ± 1,25 U/mg) al cabo de los 10 días. Por su
parte, el promotor AAT presentó una actividad máxima hacia el día 4 (18,63 ± 1,39
U/mg) que fue altamente significativa (p<0,001) con respecto a las células sin
transfectar. Este valor descendió 22% hacía el final del estudio, lográndose un
importante anotar que la concentración del sustrato empleada en este trabajo fue
0,032 nmol/h/ml para el control, 3x1011 gv, 1,8 X1012 gv y 3,6 X1012 gv
significativas entre ellos, indicándose, al igual que en las células, que con ,8 X1012
78
Actividad enzimática
Células AVV- GALNS
0,010
0,008
0,006
nmol/h/mg
0,004
0,002
0,000
Control 1 11 5 12 10 12
3,6 x 10 1,8 x 10 3,6 x 10
GV
nmol/h/mg GV
Figura 15. Actividad enzimática obtenida en lisados celulares HEK293 transfectados con el vector
13
AAV-GALNS (3,6x10 gv/ml).
estable durante los seis meses posteriores a una inyección intramuscular, con
79
modelo murino, alcanzando valores de actividad enzimática entre 2 y 10 veces los
Actividad enzimática
Medios AVV- GALNS
0,010
0,008
0,006
nmol/h/ml
0,004
0,002
0,000
Control 1 11 5 12 10 12
3,6 x 10 1,8 x 10 3,6 x 10
GV
nmol/h/mg GV
Figura 16. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293
13
transfectados con vectores adenoasociados (3,6x10 gv/ml).
la actividad GALNS de 1,2 mayor (0,0074 nmol/h/mg), con respecto a las células
(14) el cual corresponde a un amento de 2,4 veces mas que en el control negativo.
80
1,62 veces (0,0099 nmol/h/mg) con respecto al control, valor similar al reportado
por Alméciga CJ (14) 1,8 veces mayor a las células sin transfectar. Adicionalmente
Actividad Enzimática
Células - AVV GALNS SUMF1
0,020
0,015
nmol/h/mg
0,010
0,005
0,000
Control 1:1 1:2 1:5
GV
nmol/h/mg
Figura 17. Actividad enzimática obtenida en los lisados celulares HEK293 transfectados con
13
vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 (3,97 x10 ).
31,5 veces mas (0,0347 nmol/h/mg) en relación con el control negativo (0,0011
33,6 veces mayor (0,037 nmol/h/mg) respecto a las células sin transfectar se
81
presentó al realizar la cotransfección en una relación GALNS-SUMF1:2 mientras
Actividad Enzimática
Medios - AVV GALNS SUMF1
0,06
0,05
0,04
nmol/h/ml
0,03
0,02
0,01
0,00
Control 1:1 1:2 1:5
GV
nmol/h/ml
Figura 18. Actividad enzimática obtenida en los medios de los lisados celulares HEK293
13
transfectados con vectores adenoasociados AVV GALNS SUMF1 (3,97 x10 ).
2,1 kb, con un marco abierto de lectura que predice para una proteína de 374
82
ortólogos de M. musculus, D. melanogaster, C. elegans y algunos procariotes,
indicando un alto grado de conservación evolutiva de este gen (63, 183). SUMF1
sulfatasas por saturación del sistema, y (3) co-expresión de una sulfatasa con
Con relación a lo anterior, Cosma et al. (64) reportaron un incremento de 16, 3, 1,5
cotransfectadas con vectores derivados del virus del herpes simplex, portando los
83
genes de ASA y SUMF1, en una relación 1:1. Incrementos en la relación de
actividad ASA (64). Por otro lado, Takakusaki et al. (184) reportaron un incremento
mediante liposomas, con plásmidos portando los dos genes, en relación 1:2. Uno
de los trabajos más completos en este campo fue el desarrollado por Fraldi et al.
metacromática, condrodisplasia punctata ligada al X, MPS II, MPS III y MPS VI. El
difícil comparar los resultados del presente trabajo con los reportados en la
CMV, AAT Y AF1 en presencia de SUMF1, demostrando que de esta manera los
84
niveles enzimáticos aumentaban 2,4 veces, 1,5 veces y 1,5 veces, en una relación
respectivamente y 4,5 veces, 4,8 veces y 5,3 veces mas en una relación
GALNS:SUMF 1:2.
respectivamente. Los niveles incrementaron 1,8 veces, 3,5 veces y 4,0 veces
actividad enzimática que con el uso de vectores adenoasociados puesto que con
comparado con los resultados de células sin transfectar, mientras que con los
85
8. CONCLUSIONES
AVV GALNS SUMF1 portadores del gen humano GALNS, obteniendo un título
viral que permitió realizar una adecuada transfección a células HEK293 con una
aumento en el lisado celular de 3,09 veces mayor para 1 MOI y 2,8 veces para 5
MOI con respecto a las células que no fueron transfectadas mientras que en el
control negativo, lo cual deja en evidencia que este tipo de vectores son muy
Morquio A.
comparación al control negativo, puesto que al transfectar dichas células con 1,8 x
86
mas (GALNS: SUMF1 1:5) que en el control negativo mientras que en el medio se
presentó un incremento hasta de 44,5 veces mas (GALNS: SUMF1 1:5) que en las
que lo que se obtuvo con vectores adenoasociados, lo que evidencia que es mejor
5. Este es el primer ensayo in vitro para MPS IVA en el que se pone en evidencia
87
9. RECOMENDACIONES
2. Realizar ensayos in vivo que permitan continuar con el estudio, haciendo uso de
ratones o conejos MPS IVA con el fin de evidenciar resultados que permitan
suponer a los vectores lentivirales como unos potenciales candidatos para uso en
88
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