MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

GUIA RECUENTO MICROBIANO

WILLIAM HERNANDO SUAREZ QUINTANA

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

METODO ICONTEC

El presente método está basado en los lineamientos de la Norma técnica Colombiana

NTC-4092, que establece directrices generales para realizar análisis microbiológicos de
conformidad con las Normas Internacionales (ISO 7218 de 1997).

Consideraciones Generales

Para la correcta aplicación de esta norma, la preparación de la muestra es fundamental,

por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas
y por duplicado, además de inocular correctamente los volúmenes, 0,1 para superficie y
bajo ciertas circunstancias 1 ml, como cuando se sospecha de baja carga microbiana y 1
ml en análisis de profundidad.

Rangos para el recuento

Bacterias: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las unidades

formadoras de colonias (ufc), presentes en las cajas que contengan entre 15 y 300 ufc;
los análisis que aplican para dicho rango son: Aerobios mesófilos, Coliformes, Bacterias
termófilas, proteolíticas, lipolíticas, Clostridium sulfito reductor, S. aureus, etc., excepto
para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia o cuando se deban
realizar análisis especiales que requieren de una identificación posterior, como la
confirmación de S. aureus coagulasa positivos.

Hongos: Después del periodo especificado de incubación, se cuentan las ufc presentes
en las cajas que contengan entre 15 y 150 ufc, para Mohos y levaduras y Levaduras
osmófilas.

RECUENTO Y EXPRESION DE LOS RESULTADOS

CASO GENERAL

Se calcula el Número N de microorganismos presentes en la muestra, a partir del

recuento de dos diluciones consecutivas, se hace necesario que al menos una de las dos
cajas de cada dilución este dentro del rango, aplicando la siguiente formula:

N = ___________Σc______________
V (n1 + (0,1 x n2)) d

N: Número total de ufc por gramo o mililitro de la muestra.

Σc: Sumatoria del numero de colonias en cada caja examinada.
V: Volumen de muestra inoculada.
n1: Número de cajas retenidas en la primera dilución.
n2: Número de cajas retenidas en la segunda dilución.
d: Factor de dilución de la primera dilución empleada en el recuento.
0,1: Constante de corrección.

Se redondea el resultado calculado a dos cifras significativas; para esto, si la última cifra
es inferior a 5, la unidad anterior no se modifica; si la cifra es 5 o mayor, la unidad
anterior se incrementa en una unidad. De esta forma se prosigue, hasta obtener dos
cifras significativas.

Los resultados se expresan en ufc por gr. o ml de producto, según la naturaleza del
mismo (sólido o liquido), expresado como un número entre 1,0 y 9,9 (dos cifras
significativas un entero y un decimal), multiplicado por 10x, donde X es la potencia
apropiada de 10.

EJEMPLO

A partir de un análisis de Aerobios mesófilos, para un jugo de durazno, se obtuvieron

los siguientes resultados.

10-2: 168 y 215 ufc

10-3: 14 y 25 ufc

N= 1 68 + 215 + 25__ N= 408__ N= 19428

1 (2 + (0,1x1)) 0,01 0,021

Al redondear la cifra como se especifico anteriormente se obtiene como resultado

19000, que expresado en dos cifras significativas es igual a 1,9 x 104 ufc/ml

• Resultado del recuento; 18567, se aproxima a un número par 19000 ufc.

• Resultado del recuento; 19420, se aproxima a un número par inferior 19000 ufc.
• Resultado del recuento; 19500, se aproxima a un número par 20000 ufc.
• Resultado del recuento; 20500, se aproxima a 20000 ufc.

METODO DE CALCULO PARA RECUENTO DE MICROORGANISMOS QUE

REQUIERAN CONFIRMACION POSTERIOR (S. aureus coagulasa positivos, B.
cereus, etc.)

Se debe calcular el número N de microorganismos presentes en la muestra a partir del

recuento de dos diluciones sucesivas. Se hace necesario que la menos una de las dos
cajas de cada una de las diluciones, esté dentro del rango. En este caso se deben
confirmar de cada una de las cajas un número representativo de colonias (generalmente
5 colonias). Antes de calcular el informe final, es necesario aplicar un factor de
corrección a cada una de las cajas retenidas mediante la siguiente fórmula:

a = b x C, donde;
A

b: Número de colonias identificadas como positivas de acuerdo al criterio

microbiológico.
A: Número de colonas examinadas.
C: Numero de colonias contadas en cada una de las cajas retenidas.
Luego aplicamos la siguiente formula;

N = ___________Σa______________
V (n1 + (0,1 x n2)) d

Ejemplo:

Se obtuvieron los siguientes conteos, a partir de un análisis de S. aureus, realizado a un

queso y en el cual se quiere determinar la presencia de S. aureus, coagulasa positivos:

10-3: 66 y 80
10-4: 4 y 22

Factor de corrección:

(C) Colonias típicas contadas en cada caja: 66 y 80 ufc 4 y 22 ufc

(A) Colonias examinadas: 6 y 8 4 y 5
(b) Colonias positivas: 4 y 5 4 y 4

a = _4 _ x 66 a = _5 _ x 80 a = _4 _ x 4 a = _4 _ x 22
6 8 4 5

a = 44 a = 50 a = 4 a = 17,6

Informe:

N = ___________Σa______________
V (n1 + (0,1 x n2)) d

N = _________44 + 50 + 18_________
0,1 (2 + (0,1 x 1)) 0.001

N = _____112_______
0,00021

N = 533333,33 = 5,3 x 105 ufc/gr.

CASOS ESPECIALES:

CASO 1: Cuando el número de ufc se encuentra por debajo del rango mínimo en ambas
cajas de una o las dos diluciones consecutivas, se informara así:

Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media aritmética

de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución, multiplicándose por el
inverso de la dilución y se informa el resultado como sigue: Conteo estimado de ufc por
gramo o mililitro, teniendo en cuenta que solo se informa en dos cifras significativas por
la potencia adecuada de 10.
Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos en una muestra de agua, se
obtuvo los siguientes resultados.

10-1: 45 y 10 ufc
10-2: 4 y 3 ufc

Se descarta el recuento obtenido en la dilución más alta (10-2), y se calcula la media la

media aritmética de la dilución más baja (10-1), y se multiplica por el inverso de la
dilución respectiva:

N = 45+10 x 10 N = 275 = 280

2

C.E. 2,8 x 102 ufc/ml

CASO 2: Ausencia de crecimiento: Si las dos cajas de la primera dilución sembrada no

presentan crecimiento, se informará el resultado como sigue, reportando el factor de
dilución de la más concentrada.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos en una muestra de jugo, se

obtuvo los siguientes resultados.

10-2: 0 y 0 ufc
10-3: 0 y 0 ufc

< 1 x 102 ufc/ml

NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda el máximo rango, re recomienda repetir el

análisis empleando diluciones mayores, con la finalidad de obtener resultados más
confiables.

RECUENTO EN PLACA DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

METODO DEL MINISTERIO DE SALUD

La presente guía de recuento de microorganismos en alimentos esta basada en las

recomendaciones del Ministerio de salud, el instituto Nacional de salud y el Instituto
Nacional de vigilancia de Medicamentos y Alimentos INVIMA.

CONSIDERACIONES GENERALES:

Para la correcta aplicación de esta norma, la preparación de la muestra es fundamental

por lo tanto se requiere que la siembra se realice a partir de dos diluciones consecutivas
y por duplicado, además de inocular correctamente los volúmenes, 0,1 para superficie y
bajo ciertas circunstancias 1 ml., como cuando se sospecha de baja carga microbiana y 1
ml en profundidad.

Rangos para el recuento:

Bacterias (Recuentos generales): Después del periodo especificado de incubación, se

cuentan las unidades formadoras de colonias presentes en la cajas que contengan entre
30 a 300 ufc; los análisis que aplican a dicho rango son: Aerobios mesófilos,
Coliformes, Bacterias termófilas y en general para el análisis de microorganismos donde
no se observan reacciones enzimáticas ni de crecimiento sobre la superficie del agar.

Bacterias (Patógenos o identificación enzimática posterior al recuento): Para el

recuento de estos últimos microorganismos se emplea el rango de 20 a 200 ufc, como
para el análisis de S. aureus, B. cereus.

Mohos y Levaduras: Para el recuento de mohos y levaduras y Levaduras osmofílicas

se debe utilizar el rango comprendido entre 10 a 100 ufc.

RECUENTO Y EXPRESION DE LOS RESULTADOS

CASO GENERAL

Se calcula el promedio de colonias para cada una de las diluciones a examinar,

multiplicando el resultado por el factor inverso de la dilución respectiva a partir del
recuento de dos diluciones consecutivas. A continuación se divide el resultado obtenido
en la mayor dilución por el obtenido en la menor dilución (dividir la menos concentrada
por la más concentrada).

Si el cociente de esta división es mayor a 2, se reporta el resultado obtenido en la

dilución más concentrada, pero, si el cociente es menor o igual a 2, se reporta la media
aritmética de los recuentos de las dos diluciones utilizadas para el calculo.

Este resultado obtenido se redondea a dos cifras significativas. Para esto, si la ultima
cifra es inferior a 5, la cifra anterior no se modifica, pero, si la ultima cifra es mayor o
igual a 5, la cifra anterior se incrementa en una unidad y se prosigue así hasta obtener
las dos cifras significativas.

Los resultados se expresan en ufc/gr. ml., de producto, según la naturaleza del mismo y
expresado como un número entre 10 y 99 (dos cifras significativas enteras),
multiplicado por 10x, donde X es la potencia apropiada de 10.

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos, para un agua embotellada, se

obtuvieron los siguientes resultados:

10-2: 168 y 215 ufc

10-3: 35 y 45 ufc

10-2: N= 168 + 215 x 100 10-3: N= 35 + 45 x 1000

2 2

10-2: N= 19150 10-3: N= 40000

10-3 = 40000 = 2,087 > 2

10-2 19150
Como el cociente es mayor a 2, se reporta el resultado de la menor dilución 10-2:
19150 ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especifico anteriormente, se
obtiene 19000, que expresado con dos cifras significativas es 19 x 103 ufc/ml.

CASO 1: Cuando el número de ufc se encuentran por debajo del rango mínimo en
ambas cajas de una o de las dos diluciones consecutivas, se informara de la siguiente
manera: Se descarta el recuento obtenido en la mayor dilución y se calcula la media
aritmética de las colonias presentes en las dos cajas de la menor dilución,
multiplicándose por el inverso de la dilución e informando el resultado así:
Conteo estimado de ufc/gr. O ml., expresado con dos cifras significativas enteras.

CASO 2: Ausencia de crecimiento, si las dos cajas correspondientes a la primera

dilución no presentan crecimiento, se reportará como negativo y se informa el resultado
como sigue, utilizando para el reporte el factor de dilución más concentrado:

Conteo estimado < 1 x 10x ufc/gr. O ml., Según corresponda.

CASO 3: Crecimiento abundante; si las dos cajas correspondientes a la primera

dilución presentan crecimiento mayor de 300, 200 ó 100, según sea el análisis, se divide
la caja en 4, 6 ú 8 Cuadrantes, se cuenta el número de colonias presentes en un
cuadrante y se multiplica por el total de cuadrantes hechos en la caja. Se realiza el
mismo procedimiento con la otra caja correspondiente a la misma dilución y posterior a
ello se saca la media aritmética de cada dilución, multiplicando por el inverso de la
dilución respectiva; se continúa el recuento como en el caso general, pero se informa el
resultado como conteo estimado de ufc/gr. o ml., (es decir, dividir el resultado de la
mayor dilución por el de la menor y ver si el resultado es menor o igual o mayor a 2 y
proseguir como los casos generales).

Ejemplo: A partir de un análisis de aerobios mesófilos se obtuvieron los siguientes

resultados, para una leche pasteurizada:

10-2: > 300 ufc

10-3: > 300 ufc

Al dividir las cajas de 10-2: en 4, se contó en un solo cuadrante 180 y 150 colonias
respectivamente. Y al dividir las cajas de 10-3: en 4, se contó en un solo cuadrante 100 y
120 colonias respectivamente.

10-2(caja 1): ((180x4) x 100) 10-2(caja 2): ((150x4) x 100)

10-3(caja 1): ((100x4) x 100) 10-3(caja 2): ((120x4) x 100)

10-2: N= 720 + 600 x 100 10-3: N= 400 + 480 x 1000

2 2

10-2: N= 66000 10-3: N= 440000

10-3 = 440000 = 6,66 > 2

10-2 66000
Como el cociente es mayor a 2, se reporta el resultado de la menor dilución 10-2:
66000 ufc/ml. Al redondear la cifra a dos enteros, como se especifico anteriormente, se
obtiene 66000, que expresado con dos cifras significativas es 66 x 103 ufc/ml.

NOTA: Cuando el conteo de colonias exceda de 200 en 1/8 de la caja, se reportara

como conteo estimado > 1600 ufc/gr. o ml., multiplicado por el inverso de la mayor
dilución.