PROTECCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DEL ATAQUE MICROBIANO RUMINAL MEDIANTE LA

REACCIÓN DE GLUCOSILACIÓN NO ENZIMATICA DE LAS PROTEÍNA O REACCIÓN DE

MAILLARD
Autores: Juana Galindo y René Stuart
Otros Autores: Rogelio González, Bertha Chongo, Orestes La O, Rafael Rodríguez, Niurca
González, Yoandra Marrero, Juan Cairo, Idania Scull, Onidia Moreira, Ibeth Orta y Lucía Sarduy.
Instituto de Ciencia Animal, Ministerio de Educación Superior

Carretera Central Km 47½, A. Postal 24, San José de las Lajas C. P. 32700, Mayabeque, Cuba,
Teléfono: 047) 599181-83

Introducción

Los rumiantes, al igual que los animales de las especies monogástricas presentan en las partes bajas
del tracto gastro intestinal, enzimas digestivas capaces de digerir las proteínas y los almidones y
utilizarlos con una eficiencia mayor. Estas son las razones que justifican el hecho de que en los
últimos años se trabaja intensamente en la búsqueda de métodos que atenúen en alguna magnitud la
degradabilidad ruminal de las proteínas y almidones, y con ello lograr que las mismas se digieran
más eficientemente en las partes bajas del TGI. Numerosos son los métodos empleados para éstos
fines.

El esquema siguiente muestra el procedimiento de fermentación ruminal y pasaje de la proteína a

través del tracto gastro intestinal de rumiantes.

Esquema 1. Fermentación ruminal de las proteínas en el rumen

La proteolisis ruminal provoca la pérdida de la proteína dietaria de buena calidad, la que puede ser
directamente digerida y absorbida en el intestino delgado del rumiante (Black y Tecke, 1973; Ulyatt et
al 1988; Hancock et al, 1994), lo que resulta poco económico cuando no se dispone de cantidades
suficientes de esta fuente.
Esto ha motivado que actualmente en nuestro país se encaminen investigaciones acerca de la
manipulación de la fermentación ruminal para incrementar la utilización de la proteína por los
rumiantes y disminuir su degradación en rumen.
Glucosilación no enzimática de las proteínas.

La glucosilación no enzimática de proteínas, denominada reacción de Maillard y más recientemente

llamada glicación se ha estudiado sistemáticamente desde hace años, a partir de su aplicación en la
industria alimentaria, especialmente en el mejoramiento del aspecto y el sabor de los alimentos.

Por más de 50 años, el avance en la comprensión química de esta reacción estuvo directamente
vinculado con la ciencia y la tecnología alimentarias. Su relevancia fisiológica se puso de manifiesto a
partir del descubrimiento de moléculas de hemoglobina glucosiladas en la sangre de individuos sanos
y del aumento en su proporción en personas que padecen diabetes (Koenig et al., 1976).

Desde el punto de vista químico, la glucosilación se define como la reacción de grupos amino
primario de aminoácidos, péptidos y proteínas con el grupo carbonilo de los azúcares reductores. A
lo largo de esta reacción se pueden distinguir tres etapas: inicialmente se produce la asociación del
azúcar con la proteína, formando un compuesto denominado base de Schiff; la estructura de este
compuesto se reordena hacia una forma más estable, denominada producto de Amadori. Éste,
posteriormente sufre una serie de complejas transformaciones que conducen a la formación de
compuestos generalmente coloreados y/o fluorescentes.

En condiciones fisiológicas la aparición de estos compuestos está determinada por la concentración

de azúcares reductores y por el tiempo de exposición de la proteína a los mismos (vida media de la
proteína). En proteínas de recambio rápido, el proceso de glucosilación no enzimática no supera, en
general, las etapas iniciales (formación de la base de Schiff y eventualmente del producto de
Amadori), mientras que las de vida media larga llegan a formar los productos de glucosilación
avanzada.

Tanto la reacción para la formación de la base de Schiff, como la de formación del producto de
Amadori, son reversibles. El hecho de que ambas reacciones sean reversibles y consecutivas
determina que de acuerdo al tiempo de evolución del sistema considerado, habrá predominio de uno
u otro producto. La interrupción del contacto de la glucosa con la proteína en cualquiera de estas
etapas produce la reversión completa del efecto.

Estos conocimientos sugieren la posibilidad técnica de que la proteína o los almidones que se
protegen del ataque enzimático ruminal, pueden liberarse en las partes bajas del tracto gastro
intestinal (TGI) como resultado de la acción de los jugos gástricos y entéricos.

Una muestra esquemática de la reacción de Maillard se presenta a continuación. En la misma se

observa la fase A (formación de la base de Schiff); fase B (formación del producto de Amadori); fase
C (pirrólica); fase D y otras diversas (aminas, furanos, piridinas, etc.). En la gráfica 2 se muestra de
manera sucinta el esquema de la reacción de Maillard.
Gráfica 2. Esquema de la Reacción de Maillard.

Para proteger las proteínas del ataque por las proteasas microbianas del rumen, se propone la
utilización de los principios de la reacción de glucosilación no enzimática de las proteínas. Ello
condujo a la necesidad de diseñar la correspondiente metodología. La misma se describe a
continuación.

Descripción de la metodología para la protección de las proteínas del ataque microbiano

ruminal mediante la reacción de glucosilación no enzimática de las proteínas o reacción de
Maillard

Variante 1. Protección de la proteína con azúcares reductores y calor

 Seleccionar la fuente de proteína a proteger del ataque por las proteasas microbianas del
rumen
 Pesar la cantidad suficiente que se va a utilizar para ejecutar el procedimiento de protección
 Disponer de los azúcares reductores siguientes: glucosa, fructosa, xilosa
 Preparar una mezcla equimolar integrada por glucosa y fructosa.
 Con los azúcares reductores seleccionados, preparar sendas soluciones integradas por
azúcar/agua en proporción 1/10 (una parte de azúcar por cada diez partes de agua)
 Una vez preparadas las soluciones se procede a asperjar, con el auxilio de una asperjadora,
la fuente de proteína seleccionada.
  La cantidad de solución de la mezcla de azúcares/agua a emplear es el 10% de la fuente de
proteína a tratar
 La fuente de proteína tratada con agua y azúcares se coloca en estufa de aire forzado a
1500 C durante 60 minutos.
 Una vez culminado el tratamiento con calor, la fuente proteica tratada se deja enfriar al aire
libre hasta alcanzar la temperatura ambiente
 Se procede a realizar análisis bromatológico (AOAC, 1995).para ello, las muestras se
guardan en frascos ámbar con tapas de rosca hasta la determinación analítica.
 Una vez culminado el procesos de protección, las harinas, se tamizan hasta un tamaño de
partícula de 2.5 mm.
 Conservar hasta su utilización como suplemento proteico en la alimentación animal.
 Realizar estudios de calidad durante el almacenamiento en anaqueles

Variante 2. Protección de la proteína con melaza de caña de azúcar (Miel B) invertida y calor

 Seleccionar la fuente de proteína a proteger del ataque por las proteasas microbianas del
rumen
 Para los estudios fisiológicos y microbiológicos, se debe tamizar a través de un tamiz de 1
mm.
 Pesar la cantidad suficiente que se va a utilizar para ejecutar el procedimiento de protección
 Disponer de Miel B de caña de azúcar en cantidades suficientes para proceder a la protección
 Ejecutar el procedimiento para la inversión de la miel B, para ello se procede de la siguiente
manera:

a) Preparar una solución de HCL a concentración 6 N

b) Colocar en recipiente la cantidad suficiente de Miel B que se va a emplear en el procesos
de protección de la fuente proteica
c) Añadir a la Miel B la cantidad necesaria de HCl 6N capaz de producir un pH de
aproximadamente 3.17
d) Colocar en un baño de agua en ebullición durante 30 minutos.
e) Al finalizar, ya la miel B está lista para su uso
 Preparar solución de Ca (OH)2 al 0,5%
 Tratar la fuente proteica con Miel B invertida y solución al 0.5% de Ca (OH)2
 Verificar que el pH de la mezcla integrada por fuente de proteína, miel B invertida y Ca (OH) 2
al 0.5%, tengan pH de reacción comprendidos entre 7.97- 9.18
 Una vez culminado el tratamiento con Miel B invertida, la fuente proteica tratada se deja secar
al aire libre hasta alcanzar la temperatura ambiente
 Se procede a realizar análisis bromatológico (AOAC, 1995).para ello, las muestras se
guardan en frascos ámbar con tapas de rosca hasta la determinación analítica.
 Conservar hasta su utilización como suplemento proteico en la alimentación animal.
 Realizar estudios de calidad durante el almacenamiento en anaqueles
Variante 3. Utilización de la energía solar para producir la reacción de glucosilación no
enzimática de las proteínas

La energía eléctrica es un elemento del costo del tratamiento a la proteína mediante la reacción de
Maillard, que encarece el sistema. Por tal razón, se procedió al estudio de la influencia de la
temperatura solar constante durante diferentes tiempos en el grado de protección de la proteína de
harina de soya mediante las reacciones de Maillard.

Se procede de igual manera que la Variante 2, pero para realizar este procedimiento se coloca un
nylon negro sobre la fuente proteica tratada y se expone al sol. La fuente tratada de esa manera
alcanza una temperatura de 70 ° C. Se emplean diferentes tiempos de exposición al sol (0, 24, 48 y
72 horas), en dependencia de la época del año.

Descripción de las acciones técnicas y comprobatorias para determinar la veracidad de la

protección de las proteínas con el empleo de las metodologías propuestas

Estudios realizados

1. Efecto de azúcares reductores en la protección de la proteína

2. Efecto de la protección de la proteína con calor y miel B invertida en la dinámica de
degradación de la proteína y digestibilidad intestinal
3. Efecto de la protección de las proteínas en la población microbiana ruminal
4. Efecto del tratamiento a la harina de soya en la degradabilidad del nitrógeno y digestibilidad
intestinal in Vitro del N no degradado en rumen

5. Utilización de la energía solar para producir la reacción de glucosilación no enzimática de la

proteína

Variante 1. Protección de la proteína mediante azúcares reductores y calor

Para la ejecución del trabajo se utilizó como fuente de proteína la harina de soya comercial. Como
azúcares reductores se utilizaron: glucosa, fructosa, xilosa y una mezcla equimolar de glucosa y
fructosa.

Se diseñaron y compararon los siguientes Tratamientos:

(A) Harina de soya sin tratar

(B) Harina de soya tratada con agua

(C) Harina de soya tratada con una solución de glucosa

(D) Harina de soya tratada con una solución de fructosa

(E) Harina de soya tratada con una solución de xilosa

(F) Harina de soya tratada con una solución equimolar de glucosa-fructosa

Procedimiento experimental:

Para el tratamiento de las harinas con los diferentes azúcares se procedió a utilizar la proporción de
azúcar / agua de 1:10, tal y como se describió en la metodología descrita previamente. Una vez
preparadas las soluciones, se conservaron en frascos de color ámbar hasta su posterior utilización.

Las harinas de soya se colocaron en bandejas de plástico, (6 bandejas, una para cada uno de los
tratamientos), luego de su pesada en balanza técnica con el objetivo de calcular el volumen de
solución de azúcar reductor a emplear. La solución de azúcar se asperjó sobre la harina de soya,
según cada tratamiento descrito, de modo que se dispuso de 4 harinas tratadas.

Para la harina tratada con agua, se utilizó el mismo volumen de agua que en los tratamientos con
azúcares y se asperjó, igualmente, sobre la harina de soya.

Las harinas tratadas con agua y azúcares, así como la tratada con agua sin azúcares, se colocaron
en estufa de aire forzado a 1500 C durante 60 minutos.

Una vez culminado el tratamiento con calor, se dejaron enfriar al aire libre hasta alcanzar la
temperatura ambiente y se procedió a realizar análisis bromatológico (AOAC, 1995). Las muestras se
guardaron en frascos ámbar con tapas de rosca hasta su evaluación.

Las harinas, se tamizaron hasta un tamaño de partícula de 2.5 mm para los estudios fermentativos.

Para verificar la acción del tratamiento con azúcares reductores en la protección de las proteínas, se
organizó una secuencia investigativa, la que estuvo integrada por los siguientes experimentos:

Experimento 1. Determinación de la degradabilidad ruminal in vitro de la proteína contenida en

la harina de soya
Para la evaluación del efecto de la protección de las proteínas en la dinámica ruminal, se pesaron
1.5g de harina tratada o no. Se introdujeron en bolsas de nylon y se colocaron en tubos de
fermentación que contenían 150 ml de líquido de rumen fresco y viable. Los tubos que contenían las
bolsas se colocaron en una zaranda orbital a 390 C. Los muestreos se efectuaron a las 0, 2, 4, 6, 8,
12 y 24 horas de incubación. Se determinó pH, NH3, AGCC, degradabilidad de la MS y de la
Proteína, así como proteína soluble y actividad de las enzimas proteasas ruminales.

El diseño estadístico que se empleó fue bloques al azar con arreglo factorial 3 x 7para los indicadores
pH, NH3, AGCC, degradabilidad de la MS y la proteína, así como la proteína soluble. En el caso de la
actividad enzimática y actividad específica de las enzimas proteasas se empleó un arreglo factorial 3
x 5. Se replicó 5 veces en tiempo.

Resultados.

El tratamiento térmico y la adición de azúcares reductores disminuyeron la solubilidad de las

proteínas (Tabla 1).

Aunque en relación a la soya sin proteger en todos los casos hubo un efecto significativo en la
solubilidad de la proteína, el mayor efecto se encontró en el tratamiento con xilosa y con la mezcla
equimolar de glucosa y fructosa. Estos resultados conducen hacia la profundización de estos dos
tratamientos, para analizar la factibilidad de su uso a una mayor escala.

Tabla 1. Efecto del tratamiento con azúcares reductores y temperatura en la solubilidad de la proteína
de la soya
 Indicador

Proteína Solubilidad de la Degradabilidad

soluble (mg/ml) proteína, % de la proteína, %
Tratamientos

Soya 2.73a 65.94a 78.92a

Soya tratada con agua y calor 2.43b 62.14b 76.87a

Soya tratada con glucosa y calor 2.15c 55.41c 68.63b

Soya tratada con fructosa y calor 2.32bc 58.29d 62.76b

Soya tratada con xilosa y calor 1.59e 40.98e 53.01c

Soya tratada con glucosa-fructosa y calor 1.96d 49.8f 52.32c

EE ± 0.06*** 0.80*** 0.57***

a, b, c, d. medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren (Duncan 1955)

El tratamiento con xilosa y con la mezcla equimolar de glucosa y fructosa produjo un efecto depresivo
en la actividad de las enzimas proteasas así como en la actividad específica de las referidas enzimas.
Al hacer un análisis acerca del tiempo de fermentación en la actividad enzimática, se pudo observar
que la misma fue máxima a las 12 horas de fermentación, mientras que los mayores valores de
actividad específica se alcanzaron a las 24 horas (Tabla 2)
Tabla 2. Efecto de tratamiento con azúcares reductores y calor en la actividad de las enzimas
proteasas microbianas del rumen.

Indicador

Tratamientos Actividad Actividad específica de

proteolítica, U las proteasas, U/mg
proteína

Soya 0.31a 0.27ab

Soya tratada con agua y calor 0.32a 0.29a

Soya tratada con glucosa y calor 0.31a 0.28ab

Soya tratada con fructosa y calor 0.30ab 0.27ab

Soya tratada con xilosa y calor 0.26bc 0.24bc

Soya tratada con glucosa-fructosa y calor 0.25c 0.23c

EE ± SIG. 0.01*** 0.02*

a, b, c. medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren (Duncan 1955)

La concentración de amoníaco en el líquido ruminal se redujo en todos los casos cuando se efectuó
el tratamiento a las proteínas. Se debe destacar que este efecto fue significativamente superior
cuando la proteína se trató con xilosa y con la mezcla de glucosa y fructosa (Tabla 3). El tratamiento
con agua y calor, así como con glucosa produjo valores de amoníaco que no difirieron del control sin
tratar ni de las demás variantes de tratamientos, excepto para el caso del tratamiento con xilosa, el
que resultó inferior. Esto demuestra que los tratamientos con azúcares reductores a la proteína de la
soya reduce la degradación de la proteína en rumen, determinado por la liberación de amoníaco al
nivel del órgano.
 Tabla 3. Efecto de tratamiento con azúcares reductores y calor en la concentración de amoníaco y
AGCC en el rumen

Tratamientos NH3, meq/l

Soya 9.92a

Soya tratada con agua y calor 9.43ab

Soya tratada con glucosa y calor 8.93bc

Soya tratada con fructosa y calor 8.85bc

Soya tratada con xilosa y calor 8.17c

Soya tratada con glucosa-fructosa y calor 8.96bc

EE ± 0.27***

a,b,c. medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren (Duncan 1955)

La concentración de amoníaco en el líquido ruminal se incrementó en relación con el tiempo de

fermentación (Tabla 4), lo cual es un indicador de la fermentación que se produce de la proteína y de
la acumulación de este metabolito como resultado de las condiciones experimentales bajo
condiciones in Vitro que propiciaron la acumulación del NH3 debido a la no absorción y pasaje.

Tabla 4. Efecto del tiempo de fermentación en la actividad de las enzimas proteasas microbianas del
rumen
Tiempo de fermentación, horas

Indicador 0 2 4 8 12 24 EE ±

Actividad proteolítica, U 0.27b 0.30b 0.28b 0.33a 0.29b - 0.01**

Actividad específica de las 0.24b 0.26ab 0.24b 0.27ab 0.30a - 0.01*
proteasas, U/mg

NH3 meq/l 7.07d 7.40d 7.74cd 9.92b 10.64b 12.18a 0.03***

a, b,c,d. medias con letras diferentes dentro de la misma fila, difieren (Duncan 1955)

Variante 2. Protección de la proteína con melaza de caña de azúcar (Miel B) invertida y calor

Experimento # 2. Efecto de la protección de las proteínas con calor y miel B invertida en la dinámica
de degradación de la proteína en el rumen y digestibilidad intestinal

En el experimento anterior quedó evidenciado que el tratamiento a la soya con una proporción
equimolar de glucosa y fructosa y calor fue efectiva para reducir el ataque microbiano ruminal a la
proteína. Una fuente económicamente viable que contiene ambos azúcares reductores, es la melaza
de caña de azúcar.

Por tal razón, el objetivo del presente experimento fue proteger la proteína del ataque por las
proteasas ruminales mediante el tratamiento con miel B invertida y calor.

Para la inversión de la miel se utilizaron 100mL de miel B y HCl 6N hasta completar un pH de

aproximadamente 3.17. Se colocó en un baño de agua en ebullición durante 30 minutos.

Para desarrollar el estudio se utilizó harina de soya comercial, la que se tamizó a través de un tamiz
de 1 mm. La fracción tamizada se trató con diferentes proporciones miel B invertida/ solución al 0.5%
de Ca (OH)2, hasta lograr pH de reacción de 7.97; 8.45 y 9.18.

Como resultado de los tratamientos se obtuvieron las siguientes harinas, las que equivalen a los
tratamientos experimentales:

1. HSM0 Harina de soya sin tratar

2. HSM1 Harina de soya tratada con 100% de miel invertida a pH 7.97
3. HSM2 Harina de soya tratada con 75% de miel invertida a pH 8.45
4. HSM3 Harina de soya tratada con 50% de miel invertida a pH 9.18
Las harinas tratadas o no se colocaron en una estufa de aire forzado a 1500 C durante 60 minutos. Al
finalizar, se dejaron enfriar en la habitación hasta temperatura ambiente.

La composición química de las harinas se muestra en la tabla 4.

Tabla 4. Composición bromatológica de las harinas de soya tratadas con miel B invertida

Tratamiento MS (%) PB (%) PS Solubilidad de

la proteína, %
(% PB)

Harina de soya 90.57 47.46 6.76 14.24

Harina de soya con 100% MI 86.26 45.71 5.08 11.10

Harina de soya con 75% MI 87.25 48.52 5.58 11.50

Harina de soya con 50% MI 89.22 48.69 5.41 11.11

MI. miel invertida MS. Materia seca PB. Proteína bruta PS. Proteína soluble

La miel invertida tenía la siguiente composición por cada 100g: Sólidos solubles, 72.5; Glucosa, 35.6;
Fructosa, 35.6; Sacarosa, 1.3 y pH de 5.35

Digestibilidad intestinal “in vitro” de N dietario no degradado en rumen:

Para evaluar la efectividad del tratamiento térmico con miel invertida en la protección de las proteínas
se empleó el método de Calsamiglia y Stern (1955).

Para ello se utilizaron 3 toros Holstein con cánula simple en rumen. En el rumen de cada animal se
introdujeron 4 bolsas. Cada una de las bolsas contenía 1.5g de muestra correspondiente a cada una
de las harinas. Las bolsas se mantuvieron en el rumen durante 12 horas, después de las cuales se
retiraron y se lavaron con agua corriente, se enjuagaron con agua destilada y se secaron en estufa a
600 C durante 48 horas. Este procedimiento se replicó 5 veces.
Se determinó la degradabilidad de la MS y la PB. Con el residuo sólido correspondiente a cada
tratamiento se determinó la digestión intestinal.

El procedimiento consistió en una pre- incubación en rumen (FASE I) por 48 horas; el residuo
después de la fermentación ruminal, se incubó durante 1 hora en solución 1 N de HCl (FASE II) a pH
2.9 que contenía 1g/l de pepsina (Sigma P-7012, Sigma). Después de la incubación el pH se
neutralizó con NaOH 1N hasta pH 7.8 con buffer fosfato y 3 g/l de pancreatina (Sigma P-7545,
Sigma), con la correspondiente incubación a 38 ºC durante 24 horas (FASE III).

Después de la incubación se adicionó ácido tricloroacético (TCA) para precipitar proteínas no

digestibles y la digestibilidad del N no degradado se calculó mediante una proporción establecida
entre el N soluble producto de la acción de las enzimas y el N inicial después de la incubación
ruminal.

Digestión en pepsina pancreática de la proteína = Nitrógeno soluble en TCA/ cantidad de nitrógeno

en la muestra (residuo de la incubación ruminal) usadas en la prueba X 100.

Resultados:

En la figura 1 se muestra la dinámica de degradación in situ de la proteína de la soya sin tratar y

cuando se trató con 100, 75 y 50% de miel B invertida y calor. Como se puede apreciar en todos los
casos donde se utilizó la miel B invertida se produjo una reducción en la degradación de la proteína a
las 12 horas de incubación, siendo más efectivo el tratamiento con 50% de miel B invertida. En este
indicador no se encontró diferencias significativas entre la miel B al 100% y aquélla en la cual se
diluyó al 70% con Ca (OH)2.
 90
80
Degradabilidad de la PB, %

70
60
50
40
30
20
10
0
2 4 6 8 12

Horas de fermentación
_____ Control _____ 100% MI _____75% MI ____ 50% MI

Figura 1. Efecto del tratamiento a la proteína con miel B invertida en la degradabilidad ruminal de la
proteína in situ, (%).

Los parámetros que indican la degradabilidad in situ de la proteína para una tasa de recambio de k =
0.05, se muestran en la tabla 6. Se indica en la misma que la fracción soluble a es menor en el
tratamiento a la proteína con miel B invertida y diluida al 50%. La fracción insoluble pero degradable
en el tiempo, b es, igualmente, menor cuando se trata a la proteína por el método seleccionado para
este experimento. Como resultado, la degradabilidad total y la degradabilidad efectiva para la tasa de
recambio seleccionada (k = 0.05), son menores.
Tabla 6. Parámetros de la degradabilidad ruminal in situ de la proteína tratada con miel B invertida y
calor

Indicador control 100% miel 70% miel 50% miel

invertida y calor invertida y calor invertida y calor

a, % 42.90 46.10 42.40 39.85

b,% 57.10 30.96 35.05 30.75

a + b, % 93.80 77.06 77.45 70.60

DE a k = 0.05 94.50 85.40 81.10 75.10

a, fracción solubles; b fracción insoluble pero degradable en le tiempo; a + b, degradabilidad total y

DE. Degradabilidad efectiva calculada para una tasa de recambio (k = 0.05)

La tabla 7 indica la solubilidad de la proteína y la degradabilidad de la MS bajo condiciones in Vitro. El

tratamiento con miel B redujo significativamente la solubilidad de la proteína. La degradabilidad de la
MS del forraje que se utilizó como dieta base se incrementó en todos los casos, siendo superior en
el tratamiento donde se protegió la proteína con miel B invertida diluida al 50%.

Tabla 7. Efecto del tratamiento a la proteína con miel B invertida en la solubilidad de la proteína y
degradabilidad in Vitro de la MS

Tratamiento Solubilidad de la Digestibilidad de la

Proteína, % MS, %

control 14.24b 36.50a

100% miel invertida 11.10a 40.95b

75% miel invertida 11.50a 43.77c

50% miel invertida 11.11a 46.75d

EE ± 0.40* 0.54*

a, b,c,d medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren a p<0.05 (Duncan, 1955)
La digestibilidad intestinal de las harinas de soya tratadas con las diferentes mezclas de miel B
invertida se presenta en la en la tabla 8. Como se puede apreciar, a pesar de la protección de la
proteína a nivel ruminal que se produjo con este procedimiento tecnológico, la digestión intestinal no
se afecta, razones por las cuales es factible su uso debido a que no se produce una sobreprotección
en el intestino. De manera que esta técnica de protección posibilita una proteína de sobrepaso o de
by pass, que se libera en las partes bajas del TGI para su digestión.

Tabla 8. Efecto del tratamiento a la proteína con diferentes proporciones de miel B invertida y calor
en la digestibilidad intestinal de la proteína

Tratamiento Digestibilidad intestinal de la EE ±

proteína, %

control 69.78

100% miel invertida 69.96 0.60

75% miel invertida 70.20

50% miel invertida 70.24

Experimento # 3. Efecto de la protección de las proteínas con calor y miel B invertida en la

población de bacterias ruminales

Para realizar el estudio, se utilizó la harina de soya comercial, la que se pasó a través de un tamiz de
1 mm. Una muestra de 100g de la fracción tamizada se asperjó uniformemente con una solución que
contenía miel B invertida (15g) y 30 ml de una solución de Ca (OH)2 al 0.5% a un pH comprendido
entre 8.45-9.18. La harina asperjada se colocó en una estufa a 1500 C durante 60 minutos. Se
determinó la composición química de la soya tratada y la soya sin tratar.

Se evaluaron 2 tratamientos experimentales (1) Soya sin tratar y (2) Soya tratada con miel invertida

Procedimiento experimental
 Se utilizó la técnica de cultivo sumergido con agitación mecánica, para lo cual se empleó un baño
regulado a 390C.
Las unidades experimentales consistieron en 8 tubos de cristal de 250 mL de capacidad, dentro de
los cuales se introdujeron 1.5g de alimento a evaluar (soya tratada o no) y 150 mL de una mezcla
integrada por líquido de rumen que contenía microorganismos viables, que procedía de un toro
Holstein con cánula simple en rumen, y una solución buffer. La solución buffer se formuló de la
siguiente forma: (5,7 g de Na2 HPO4 ; 6,2 g de KH2PO4 ; 0,6 g de MgSO4 . 7 H2O; 13,2g CaCl2 . 2H2O
; 10g de MnCl2 . 4 H2O ; 1 g de CaCl2 . 6H2O ; 0.8g FeCl2 . 0 H2O 35 g de NaHCO3 y 4 g de NH4
HCO3 ).

Los tubos de fermentación se colocaron dentro del baño y se incubaron durante 24 horas. Los
muestreos se efectuaron antes de incubar y a las 2, 4 y 24 horas. El diseño experimental que se
empleó fué completamente aleatorizado en arreglo factorial 2x 4( 2 tratamientos, 4 tiempos de
muestreo).

Se determinó la población de bacterias totales viables, hongos, protozoos, pH, AGCC, así como la
población de bacterias proteolíticas y el NH3 como medidas principales que indican el efecto protector
de la proteína contenida en la harina del grano de soya. Las técnicas que se utilizaron para la siembra
de microorganismos se describió en el capítulo de Materiales y Métodos Generales
Los resultados que se obtuvieron se analizaron según el diseño experimental seleccionado, para lo
cual se efectuó trasformación LnX a las medidas de bacterias, hongos y protozoos.
Resultados
El tratamiento a la proteína con miel B invertida y calor, no produjo modificaciones significativas en la
población de bacterias viables totales del rumen, sin embargo, redujo hasta el 75% la población de
bacterias proteolíticas. Esto demuestra la efectividad del tratamiento a la proteína, lo que hace
inaccesible la misma al ataque por las proteasas microbianas. Efectos sinérgicos entre las bacterias
proteolíticas y los hongos celulolíticos se han podido observar en el presente trabajo, al quedar
evidenciado el efecto beneficioso de este tratamiento en la población de hongos celulolíticos. No se
encontró efectos de la protección de la proteína con el presente método, en el pH de líquido ruminal.
La tabla 9 muestra los efectos que se observaron.

Tabla 9. Efecto del tratamiento a la proteína de la soya con miel invertida en la población microbiana
ruminal

Tratamiento bacterias viables bacterias Hongos, pH

totales, proteolíticas,
10-6 uft/mL
-11 -6
10 ufc/mL 10 ufc/mL
Harina de soya 1.04 (8.22) 2.29(19.70) 0.47(3.22) 7.70

Harina de soya tratada 1.69 (12.52) 1.49(6.30) 1.28(5.33) 7.74

EE± sig. 0.30 0.25* 0.24* 0.07
a, b medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren a p<0.05 (Duncan, 1955)

No hubo efectos del tiempo de fermentación en las poblaciones de bacterias viables totales,
proteolíticas y hongos ruminales. Sin embargo, el pH del rumen se incrementó a partir de las 2 horas
de fermentación, al parecer debido a la acumulación de amoníaco que se produjo motivado por las
condiciones in vitro en que se condujo la investigación, la que no propicia la absorción de amoníaco a
través de las paredes ruminales ni el pasaje de proteína no digerida hacia las partes bajas del TGI.
(tabla10)

Tabla 10. Efecto del tiempo de fermentación en la población microbiana en el rumen de animales que
consumen soya tratada o no con miel B invertida y calor.

Tiempo de fermentación, hrs.

Medidas 0 2 4 24 EE ± SIG

bacterias viables totales, 10-11 ufc/ml 1.23(5.22) 1.17(6.67) 1.69(19.22) - 0.37

bacterias proteolíticas, 10-11 ufc/ml 1.82(12.67) 1.83(12.11) 2.01(14.22) - 0.30

Hongos, 10-5 uft/ml 0.91(4.44) 0.39(2.78) 1.32(5.61) - 0.29

pH 7.43A 7.75b 7.95b 7.84b 0.1**

a, b medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren a p<0.05 (Duncan, 1955)

Los resultados que se obtuvieron en la población de protozoos y la concentración de AGCC fueron

muy complejos, al presentar interacción significativa entre los referidos indicadores y el tiempo de
fermentación en el rumen. En la tabla 11 se muestra a información.

Como se aprecia, las mayores poblaciones de protozoos se encontraron a las 2 horas después de
iniciada la fermentación en el tratamiento donde la soya no se trató (tratamiento control) y a las 4
horas en aquél en el cual proteína de la soya se trató con miel B invertida y calor. Los más bajos
estuvieron en el tratamiento con miel a la soya a las 2 horas de fermentación. Igual efecto se observó
a las 24 horas para ambos tratamientos. Al parecer, no parece que exista un efecto del tratamiento a
la proteína en la población de protozoos del rumen.
 La dinámica de los AGCC fue, igualmente compleja y la concentración fue mayor a las 24 horas en
ambos tratamientos (soya protegida y soya sin proteger).

Tabla 11. Efecto del tratamiento a la proteína con miel B invertida y calor y el tiempo de
fermentación en el número total de protozoos y la concentración de AGCC y el rumen

Medida Horas 0 2 4 24 EE ±
Tratamiento SIG
AGCC, Harina de soya
mmol/L 95.18a 143.23bcd 117.19abc 177.71d
Harina de soya 0.24*
cd ab bcd d
tratada 161.53 112.08 148.99 179.51

Harina de soya 1.84bc 1.95c 1.76bc 1.02ab

Protozoos (6.25) (11.75) (6.25) (3.25) 0.30**
10-5 Cel/ml Harina de soya 1.94bc 0.35a 2.37c 0.72a
tratada (7.00 (1.50) (10.75) (2.25)
a, b medias con letras diferentes dentro de la misma columna, difieren a p<0.05 (Duncan, 1955)

Experimento # 4. Efecto del tratamiento a la harina de soya en la degradabilidad del nitrógeno

en rumen y digestibilidad intestinal in vitro del nitrógeno no degradado en rumen.

Tratamientos: Se evaluaron dos tratamientos: Soya sin tratar (SST) y Soya tratada (ST)

Estudio de degradación:

a) degradabilidad in vitro

Se pesó 1g de muestra de cada tratamiento (tratamiento control y Harina tratada) y se introdujeron en

bolsas se dacrón con 6 cm. x 5 cm de tamaño y una porosidad de 42.5 con 9 µm de tamaño de
poros. Las bolsas se introdujeron en tubos de incubación con una mezcla buffer: líquido de rumen
(70:30) por 0, 2, 4 y 24 horas de incubación.

Como animales donantes se utilizaron 3 toros mestizos de Holstein con cánulas en el saco dorsal del
rumen. Los animales se encontraban, previamente, sometidos a un régimen constante de
alimentación, basado en pasto elefante (Pennisetum purpureum), cortado verde, 5 kg de forraje de
caña (Saccharum officinarum) y 2 kg de harina de soya en dos raciones al día (08.00a.m. y 03.00
p.m.) con agua y sales minerales a voluntad.

La degradabilidad de MS y Nt se calcularon por la formula siguiente:

%MS desaparecida: ((MS inicial- MS residuo después de la incubación)/ MS inicial) x 100.

% Nt desaparecido: ((Nt inicial-Nt residuo después de la incubación)/Nt inicial) x 100

b) Degradabilidad in situ

Animales y dieta: Se utilizaron 3 toros mestizos Holstein x Cebú con un peso promedio de 415 ± 22
kg de peso vivo (PV), con cánulas en el saco dorsal del rumen. Los animales se alojaron en cubículos
individuales y recibieron la misma dieta que se utilizó en el experimento anterior.

Digestibilidad intestinal “in vitro” de N dietario no degradado en rumen:

Se utilizaron muestras de bolsas con 16 horas de incubación ruminal. La digestibilidad del nitrógeno
no degradado en rumen se determinó según el procedimiento de los tres pasos con pepsina
pancreatina utilizado por Calsamiglia y Stern (1995), para suplementos proteicos, el que se describió
en el experimento anterior.

Resultados.

En las figuras 2 y 3 se presenta la dinámica de desaparición in vitro de la materia seca (MS) y el

nitrógeno total (N) en los tratamientos. Se pudo demostrar que el tratamiento a la harina de soya
posibilitó la protección de la misma en más del 15 % con respecto a aquélla que no fue tratada.
Sobre este aspecto para el caso de algunas fuentes proteicas vegetales dentro de las que se incluyó
la soya, Faldet y Satter (1991) encontraron que la proporción de proteína indegradable variaba desde
el 36 al 58% de la proteína resultados superiores a los encontrados en este trabajo. Otros factores,
como el nivel de alimentación (Owens y Goetch, 1986) o la proporción de forraje en el caso de dietas
mixtas (Colucci et al., 1982), pueden también hacer variar el tiempo de retención y por consiguiente la
digestibilidad ruminal (Galyean et al., 1979). No obstante, es de notar que la influencia del tiempo de
retención varía dependiendo del ritmo de fermentación.

80
70
60
Desaparición (%)

50
40
30
SST
20
ST
10
0
0 10 20 30
Tiempo (horas)
Figura 2 Dinámica de desaparición "in vitro" de MS en los
tratamientos de soya y soya tratada, % ,
 90
80
Degradabilidad(%)

70
60
50
40
30
20
SST ST
10
0
0 5 10 15 20 25 30

Tiempo (horas)

Figura 3. Degradabilidad ruminal in vitro del nitrógeno (%) en soya tratada y

sin tratar.

En las figuras 5 y 5 A se presenta la dinámica de desaparición in situ de MS y el Nt en los

tratamientos en la soya tratada (ST) y en la que no se trató (SST). Se pudo demostrar que el
tratamiento a la proteína de la soya también posibilito la protección en más del 15 % con respecto al
no tratado. Estos resultados que se realizaron bajo condiciones in situ, coincidieron con aquéllos que
se realizaron in vitro y coinciden con lo informado por la literatura acerca de la influencia del calor en
la protección de alimentos de la degradación ruminal.

90
80
Desaparición (%)

70
60
50
40 SST
30
ST
20
10
0
0 10 20 30
Tiempo (horas)

Figura 5. Dinámica de desaparición in situ de MS en los

tratamientos

90
80
70
desaparición (%)

60
50
40
30
20 SST ST
10
La tabla 12 presenta la digestibilidad intestinal del nitrógeno no degradado en el rumen de las
muestras de soya y soya tratada con azúcares reductores y calor.

Los valores de digestibilidad fueron de 80.33 para el tratamiento donde se trató la soya (ST) y 82.56
en la soya sin tratar (SST). Estos resultados demuestran que ambas formas de suministrar la soya a
los rumiantes tienen el mismo aprovechamiento en el intestino.

Tabla 12. Efecto del tratamiento a la soya con calor y miel B invertida en la digestibilidad intestinal,
(%)

Tratamiento Digestibilidad intestinal EE ±

Soya 82.56 2.46
Soya tratada con calor y miel B invertida 80.33

Consideraciones finales

Durante la ejecución de la investigación quedó demostrado que es posible manipular la fermentación

microbiana ruminal, para obtener un ecosistema capaz de proporcionar ventajas biológicamente
viables y que contribuyen en gran medida a una mayor eficiencia productiva en los animales
rumiantes.
La estrategia de proteger a la proteína alimenticia del ataque por las proteasas microbianas ruminales
es una técnica factible.

El tratamiento de las proteínas mediante la utilización de azúcares reductores: xilosa, fructosa,

glucosa y la mezcla equimolar de glucosa/fructosa redujo la degradabilidad efectiva de la proteína en
rumen, la población de bacterias proteolíticas y la actividad de sus enzimas. Estos resultados
condujeron a la búsqueda de soluciones más baratas para lo cual se diseñó la metodología de
protección de las proteínas mediante la inversión de la miel B de caña de azúcar, producto nacional
que provee de los azúcares reductores glucosa y fructosa necesarias para que se produzca la
reacción prevista. Otra dificultad a la cual el colectivo de autores dio solución fue a la temperatura de
reacción, para lo que se utilizó la energía solar en sustitución de la eléctrica. De manera similar al
obtenido con el complejo tanino- proteína a nivel intestinal, la proteína protegida mediante éste
procedimiento, se libera en las partes bajas del tracto gastro intestinal con la consiguiente utilización
digestiva, tal y como quedó demostrado mediante la técnica de digestibilidad intestinal.

Conclusiones

 El tratamiento con xilosa y la mezcla equimolar de glucosa / fructosa protegen a la proteína del
ataque por las enzimas microbianas del rumen
 La miel B invertida, en sustitución de la mezcla de azúcares reductores redujo de forma
significativa la degradabilidad de la proteína en el rumen y es efectiva si se utiliza sin diluir o diluida
al 75 o 50% debido a que no compromete la degradabilidad de la MS.
 La miel B invertida es un producto nacional, y su empleo para proteger la proteína en sustitución de
una mezcla equimolar de glucosa y fructosa presenta ventajas económicas
 La protección de la proteína de la soya con miel B invertida y calor reduce la población de
bacterias proteolíticas en un 75%, con incrementos en la representación de hongos celulolíticos
 El tratamiento a la soya con miel B invertida y calor es efectivo para proteger la proteína, al reducir
la degradabilidad de la proteína a nivel ruminal en 15%
 La proteína que se protege mediante la reacción de glucosilación no enzimática de proteínas se
digiere a nivel intestinal, lo que es indicativo de que no se produjo una sobreprotección de la fuente
con el tratamiento

Referencias bibliográficas