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Técnicas Analíticas
Capítulo 4: Técnicas Analíticas 62
4.1 INTRODUCCIÓN
Principios generales
Si un haz de energía radiante incide sobre una sustancia, puede suceder que:
Componentes básicos
5. Galvanómetro.
Cuando un haz de luz golpea una partícula en suspensión, una parte de la luz es
reflejada, otra absorbida, otra desviada y el resto es transmitida. La turbidimetría mide la
reducción de la intensidad de la luz en su paso a través de una suspensión, a causa de las
partículas presentes en ésta, y cuantifica la luz residual transmitida. La nefelometría
mide la luz desviada en diversos ángulos (entre 15º y 90º) por las partículas presentes en
esta suspensión.
4. Cubeta de medición.
5. Detector (fotomultiplicador).
6. Galvanómetro.
4.4 FLUORIMETRÍA
3. Rendija.
7. Fotomultiplicador.
8. Galvanómetro.
4.5 REFLECTOMETRÍA
Vinculado con la llamada química seca, este método analítico permite medir, por
reflexión de la luz en una determinada longitud de onda, los cambios en la intensidad de
coloración de una tira. La incorporación de un microprocesador al equipo, permite
simplificar en grado sumo e incluso omitir, muchos pasos en el procedimiento operativo
y en la calibración. La facilidad de operación de los instrumentos de este tipo, unida al
pequeño espacio requerido para el almacenamiento de las tiras reactivas, y al hecho de
que la calibración del equipo es estable por largo tiempo, hace que este método se
considere ideal en el laboratorio.
4.6 POTENCIOMETRÍA
Las principales aplicaciones al trabajo habitual del laboratorio clínico son los
equipos medidores de pH (para la preparación de soluciones tampón, por ejemplo), los
electrodos para la medición del pH y de la pCO2 de los equipos analizadores de gases en
sangre, y los electrodos ion-selectivo (ISE). En el caso de estos últimos, la respuesta de
la celda electroquímica se basa en la interacción entre una membrana selectiva, y el
analito que altera el potencial de esta. La selectividad, por lo tanto, depende de la
especificidad de la membrana.
Electroforesis
zona intermedia, y se separa en la zona de poro fino por la acción del tamiz molecular.
En la preparación de la solución tampón, se diferencian un ion rápido (con movilidad
mayor que la de cualquier proteína), y un ion de arrastre (con movilidad inferior a
cualquiera de estas). Con ello se logra un gradiente de voltaje y uno de pH (González,
2004).
4.9 CENTRIFUGACIÓN
Los parámetros que se deben tener en cuenta para centrifugar una muestra son la
velocidad y el tiempo de duración del proceso. Resulta más objetivo hablar de fuerza
centrífuga relativa, porque existen muchos modelos y tamaños distintos en el mercado.
4.10 FLUORESCENCIA
Ag-E Señal
Ag-E + 2 Ag o + Ag o Fluoróforo de
Ag o fluorescencia
Las aplicaciones son las mismas de los inmunoensayos mencionados hasta ahora,
es decir, para la medición de sustancias en pequeñas concentraciones. Es importante
notar que se han desarrollado numerosos fluoroinmunoensayos para la detección de
drogas, medicamentos y otras moléculas pequeñas.
4.11 LUMINISCENCIA
Los ensayos luminiscentes (LIA) han sido muy usados. La diferencia con los
métodos anteriores radica en que la señal es emitida por sustancias luminosas, las cuales
se miden fácilmente en un luminómetro. Al inicio de estos ensayos fueron usadas
sustancias naturales, que utilizaban células de insectos que poseían el sistema
luciferinaluciferasa, por eso se les denominó ensayos bioluminiscentes.
Fluoróforos Método
Quelatos de Europio DELFIA
Quelatos de Terbio SLFIA
Fluorescencia FIA
Ficoeritrinas FIA
Las variantes más extendidas son las quimiluminiscencias, en las que la señal
luminosa se emite por una reacción química. Las más usadas son:
Ag-L Señal
o o
Ag-L + 2 Ag + Ag Luminol de
o
Ag fluorescencia
desarrolladas en los últimos treinta años tuvieron como resultado la aparición de una
generación de sistemas analíticos en los cuales el instrumento, su funcionamiento, y los
reactivos constituyen una unidad funcional. Las operaciones realizadas por los analistas
pasaron a ser ejecutadas por el sistema. Este desarrollo tecnológico en el campo del
diagnóstico por parte del laboratorio clínico tiene en la actualidad más fuerza que nunca.
Analizadores químicos
Después de algunos años de intenso trabajo, Skeggs logró alcanzar la meta que se
había propuesto y presentó su protocolo a varias compañías. La producción comenzó en
el año 1954. Había surgido el primer analizador y tenía el mérito de ser un producto de
origen químico-clínico, no había sido tomado de ninguna otra disciplina. Sin estos
equipos no hubiera sido posible, ni imaginarse siquiera, enfrentar la carga de trabajo de
los laboratorios actuales, obligados a prestar servicio en hospitales de 1000 camas o más,
y a atender también a los pacientes ambulatorios de territorios extensos.
también era posible la incubación, al pasar las mangueras por un baño María con la
temperatura requerida. Los analizadores continuos alcanzaron una gran capacidad de
procesamiento de muestras (750 muestras/h), y eran capaces de realizar en cada muestra
más de 15 determinaciones. A pesar de haber constituido un importante paso de avance,
este tipo de analizador tenía algunos inconvenientes que condujeron a que no se
continuara su fabricación. Entre ellos destacaban:
Años más tarde (1975), apareció en el mercado una versión más depurada de los
analizadores químicos. Conocidos como analizadores discontinuos, desde el punto de
vista metodológico imitan las etapas de los análisis que eran realizados de forma manual.
Por ejemplo, la pipeta de muestras aspira la cantidad de muestra requerida tantas veces
como determinaciones tenga indicadas el paciente, y la deposita en cubetas de reacción
independientes. Ninguna muestra entra en contacto con la siguiente y esto los identifica
como analizadores discretos. Son discontinuos porque las muestras y reactivos no viajan
uno detrás de otros por el interior de las mangueras. A estas características se suman las
siguientes:
Figura 19: Representación del soporte para una muestra en analizador de química seca.
• Uso de los sensores que responden a los estímulos físicos con un impulso
y que pueden ser electroquímicos y ópticos.
Figura 20: Movimiento del brazo que sostiene la pipeta de muestra de un analizador
químico.
Analizadores hematológicos
En los años 50 del siglo XX, las limitaciones del microscopio de luz y de las
determinaciones bioquímicas, obligaron a emprender la búsqueda de otras técnicas que
permitieran obtener información sobre células aisladas y subpoblaciones celulares. Dos
décadas después, la citometría de flujo era una realidad y comenzaron a aparecer los
primeros analizadores hematológicos que utilizaban este principio. Su
perfeccionamiento les añadió a estos equipos la posibilidad de realizar un recuento
diferencial de seis poblaciones, un recuento absoluto para cada una de ellas, y detectar
las desviaciones a la izquierda (presencia de leucocitos con núcleos no segmentados).
Para realizar los recuentos, los eritrocitos son lisados. A continuación, los leucocitos son
estabilizados y coloreados, para evidenciar su actividad peroxidásica y de esta forma
identificarlos (absorbancia de la luz) y conocer su tamaño (dispersión de la luz), cuando
son registrados al pasar las células independientes, una tras otra entre dos detectores. Las
poblaciones celulares se muestran en una pantalla, el eje vertical indica el tamaño
celular, y el horizontal la intensidad de la coloración peroxidásica. Los linfocitos y las
células grandes no coloreadas (blastos) no se desplazan horizontalmente y, por lo tanto,
son medidas solo por su tamaño y a lo largo del eje vertical (izquierda). Los monocitos
tienen una actividad peroxidásica discreta y un tamaño moderado, por lo que aparecen
en el centro de la pantalla. Los neutrófilos, algo menores, pero con una actividad
peroxidásica intensa, aparecen a la derecha y ocupan la parte media y superior de la
pantalla. Los eosinófilos, menores que los monocitos y los neutrófilos, pero con la
actividad peroxidásica más elevada, aparecen a la derecha y en el extremo inferior. Los
basófilos son detectados como grandes células, en un canal separado, después que el
resto de los leucocitos han sido despojados de su citoplasma. Una idea de todo esto se
refleja en la siguiente figura.
A estos analizadores, igual que ocurre con los químicos, se les ha incorporado la
robótica. Como ejemplo se puede mencionar la posibilidad de realizar de forma
automática las extensiones de sangre sobre portaobjetos y efectuar las coloraciones. La
ayuda ofrecida por estos equipos es primordial, pues los profesionales del laboratorio
solo tienen que examinar las extensiones en las que el analizador ha señalado, mediante
la alarma sonora, la presencia de alguna anormalidad en la cantidad o en el tipo de
alguno de los elementos celulares.
Automatización en hemostasia
En la década del 60 del siglo XX, los análisis para el estudio de la coagulación se
encontraban limitados a la observación visual de la formación del coágulo o a su
disolución, con el uso de pruebas como: el tiempo de sangrado, el tiempo de
coagulación, el tiempo de protrombina, el tiempo parcial de tromboplastina (activado
con caolín) y el tiempo de trombina. En los años 70 del mismo siglo, la automatización
de las llamadas pruebas de coagulación fue impulsada, entre otras razones, por la
necesidad de estudiar, de forma masiva, aquellos pacientes sometidos a terapia
anticoagulante, y de estudiar las alteraciones de la coagulación que acompañan a
múltiples enfermedades humanas.
Inmunoquímica
g mg μg ng pg fg
l 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15