EVALUACIÓN DE UN CONSORCIO MICROBIANO PARA LA PRODUCCIÓN DE

BIOMASA
K.V. Insuasty Martínez , Y.M. Muñoz Zúñiga b, A.F. Nuñez Yepesc, S. Rodriguez Diazd, D.F.
a

Yepez Velae.
a
kvinsuastym@unal.edu.co, bymmunozz@unal.edu.co, cafnunezy@unal.edu.co,
d
srodriguezd@unal.edu.co, edfyepezv@unal.edu.co
Versión 1.
Supervisor: Carlos Díaz Vargas. (caadiazva@unal.edu.co)
Laboratorio de Bioquimica, Programa de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería y
Arquitectura, Universidad Nacional de Colombia
Manizales, 8 de Marzo-11 de Marzo de 2019
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Resumen
Actualmente el estudio de los consorcios microbianos se ha convertido en una tendencia de
investigación debido a que pueden realizar funciones más complicadas y soportar entornos más
fluctuantes aventajando a sus contrapartes individuales. Debido a esto se decidió realizar el
estudio del Consorcio microbiano CT1 enfocado a la producción de biomasa usando glucosa
como sustrato; se realizó seguimiento al crecimiento del consorcio así como al consumo de los
azúcares reductores totales (ART) durante 14 hrs para determinar parámetros como la velocidad
de crecimiento (𝜇max =0,164 ℎ−1 ) y rendimiento biomasa-sustrato (Yx/s= 0,1343 gB/gS).
Palabras claves: Producción de biomasa, Consorcio microbiano, Parámetros cinéticos.
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1. Introducción. energético y de recursos (Navarrete et al,
Los microorganismos en su gran variedad son 2007).
usados comúnmente como sistemas En este estudio se evaluó el crecimiento del
biológicos, que llevan a cabo diversas Consorcio microbiano C1T por fermentación
reacciones bioquímicas que proveen de glucosa, se determinaron los parámetros
productos de interés industrial. Los cinéticos que describen la producción de
Consorcios microbianos, son una comunidad biomasa, realizando un seguimiento de la
de cepas que interactúan entre sí, y presentan concentración celular del cultivo a través de
mejores resultados en comparación a las diferentes métodos de cuantificación de
cepas individuales, pues una de sus biomasa.
características, es que presentan mayor 2. Materiales y métodos.
resistencia al medio, y gracias a que es una Para el desarrollo de la práctica se dispuso de
comunidad pueden repartirse las tareas de las siguientes materiales y reactivos:
sintetizar enzimas para transformar un 2.1 Medio de cultivo.
producto S a un producto P con menor gasto El medio de cultivo contenía: (NH4)2SO4[1
g/L], KH2PO4 [1.5 g/L], MgSO4. 7H2O [0.2

1
g/L], Na2HPO4 [9 g/L]. Como sustrato se usó
glucosa [20 g/L].
El medio fue autoclavado sin glucosa, ya que
la glucosa fue filtrada con una membrana de
0.2𝜇, para evitar su degradación.
2.2 Biorreactor.
Se usó un biorreactor instrumentado Biotron
Liflus GX 1L a condiciones de operación T
(31ºC - 32°C), pH entre 6.4 y 6.8, agitación
de 150 rpm, y aireación. Se mantuvieron
estas condiciones de operación durante todo
el experimento.
2.3 Caracterización de las muestras.
Para el seguimiento del crecimiento del
consorcio y su correspondiente consumo de
sustrato , se tomó 10 mL de muestra del
biorreactor en un tubo falcon cada 2 horas, y
se procedió a realizar análisis del contenido
por el método de densidad óptica, método de
DNS y peso seco.
2.4 Método de densidad óptica.
Se usó un espectrofotómetro Thermo
Scientific GENESYS™ 20, Para esto se tomó una
muestra cada 2 horas del medio de cultivo y
se midió la absorbancia a una longitud de
onda de 600 nm.
2.5 Método peso seco.
Cada muestra fue analizada por triplicado. Se
usaron tubos eppendorf de 2ml, a cada uno se
le agregó 1mL de muestra. Posteriormente
fueron centrifugados a 14800 rpm durante 10
minutos. El sobrenadante fue retirado con
ayuda de una micropipeta de 1000 𝜇L,
siempre teniendo cuidado de no generar
corrientes que pudieran hacer que la biomasa
sedimentada se vuelva a difundir en el
sobrenadante.
El tubo con la biomasa sedimentada fue
llevado a un horno a 60°C durante 60 hrs.
Pasado este tiempo las muestras se dejaron
enfriar durante dos horas en un desecador
para luego ser pesadas.
2.6 Método DNS.
Los sobrenadantes obtenidos posterior a la
centrifugación de cada muestra en el método
de peso seco, fueron dispuestos para la
prueba de consumo de sustrato (Azúcares
reductores totales ART) por
espectrofotometría, mediante el método del
DNS, siguiendo las indicaciones propuestas
por (Durango, 2007) y con la ayuda del
espectrofotómetro GENESYS™ 20.
Previo a la caracterización de cada muestra,
se realizó una curva de calibración que
relaciona la absorbancia con la concentración
de una serie de muestras patrón de glucosa.
La curva se realizó partiendo de una solución
madre de glucosa de 20 g/L, que fue utilizada
para obtener diluciones de 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 y
3 [g/L], a las cuales se les registró la
absorbancia a una longitud de onda de 540
nm. Para la cuantificación de azúcares
residuales se trabajó con muestras de 1mL,
que fueron diluidas (1:10, muestra:agua),
debido a que las concentraciones de ART en
2
las muestras eran muy altas con respecto al
rango de lectura permitido por el equipo.
3. Resultados y discusión.
A continuación se presentan los resultados
obtenidos en el desarrollo de la práctica, para
los diferentes métodos utilizados.
3.1 Consumo de azúcares reductores
totales (ART).
Se reportan los valores obtenidos para la Figura 1. Curva de calibración obtenida.
Los valores de la concentración de glucosa
construcción de la curva de calibración a
residual obtenidos para los diferentes tiempos
partir del patrón de glucosa anhidra en la
de cultivo se reportan en la Tabla 2.
Tabla 1, mediante regresión lineal se obtuvo
la siguiente ecuación:
𝑦 = 0,6123 𝑦 − 0,1001 (1)

𝑦2 = 0,9841
Donde 𝑦 corresponde a la absorbancia [nm]
y 𝑦 a la concentración de glucosa en [g/L].

Tabla 2. Datos de la evaluación de consumo de

glucosa por espectrofotometría a una longitud de
onda de 540 nm.

Tabla 1. Datos de absorbancia obtenidos para la

construcción de la curva de calibración.

Figura 2. Consumo de azúcares reductores y

crecimiento de biomasa en el tiempo.
De la figura 2 se puede evidenciar la
disminución de la concentración de sustrato a

3
medida que se da el crecimiento celular. Se
puede observar que entre las 6-8 horas, se
presenta el mayor consumo de sustrato, esto
se da en la etapa de mayor crecimiento
celular. El consumo total de sustrato (en 64
horas) fue de 7.6g/L. Lin C. y Hung W.
trabajaron con microorganismos anaeróbicos
para producción de etanol e hidrógeno,
obteniendo un consumo aproximado de
azúcares de 1.5g/L, lo que por comparación
indicaría que el consorcio estudiado consume
gran cantidad de sustrato para su crecimiento.
3.2 Crecimiento del consorcio.
El crecimiento del consorcio microbiano se
midió mediante densidad óptica del medio de
cultivo y determinación de peso seco. En la
tabla 3 se muestran los datos obtenidos por
ambos métodos. Dado que el método se hizo
por triplicado para cada muestra los datos
corresponden al promedio entre los tres datos
de cada muestra, a excepción del primer dato,
que corresponde al promedio de sólo dos
datos debido a un error de procedimiento
durante la práctica.
Tabla 3. Datos de peso seco y absorbancia para
determinación de biomasa durante 12h.
Figura 3. Curvas de crecimiento del consorcio
microbiano. (a) mediante densidad óptica del
cultivo, (b) mediante determinación de peso
seco.
Ambos resultados se muestran en la figura 3.
A pesar de que en ambas gráficas se aprecia
el mismo comportamiento, también se
observan ciertas diferencias. Lo anterior se
puede explicar teniendo en cuenta que, si bien
el método de densidad óptica presenta ciertas
desventajas al momento de determinar la
cantidad de biomasa en una muestra
(problemas de calibración o interferencia con
gases o partículas) (Sonnleitner et al, 1992),
se puede considerar que este tipo de
inconvenientes no se presentaron en la
práctica o el error asociado a esto fue mínimo,
lo que hace que estos datos de absorbancia
sean confiables. Por otro lado, entre las
desventajas del método de peso seco se
encuentra el requerimiento de personal
experimentado para prevenir remover
biomasa al momento de retirar el
sobrenadante de la muestra centrifugada
además (Sonnleitner et al, 1992). Teniendo
4
en cuenta lo anterior se puede considerar que
la curva de crecimiento obtenida por el
método de peso seco presenta un error mayor
con respecto a la otra curva, lo que podría
explicar la diferencia entre estas.
En ambas curvas se observa que el consorcio
no presentó fase de latencia durante la
práctica, lo que podría deberse a que los
microorganismos se adaptaron al medio en el
pre-inoculo e inoculo preparados antes del
experimento (Shida et al, 1977).
Los datos de absorbancia (figura 2.(a))
muestran que durante la fase exponencial, el
intervalo de tiempo donde se da un mayor
crecimiento es el de 6 a 8 horas, lo que indica
que probablemente en este intervalo se
presente la velocidad específica de
crecimiento máxima. Otro intervalo de
tiempo importante en los resultados es el de 8
a 10 horas, en el cual se logra apreciar
mediante los datos de peso seco un cambio en
el signo de la pendiente de la curva de
crecimiento (de positivo a negativo), lo que
indicaría que el consorcio durante este
intervalo estaría entrando a fase estacionaria.
Esto se podría confirmar con la curva de
crecimiento por absorbancia, la cual muestra
una disminución en la velocidad de
crecimiento en el mismo intervalo de tiempo.
No obstante, para determinar adecuadamente
si el cultivo entró a fase estacionaría se
necesitarían datos de concentración de
biomasa o absorbancia después de 12 horas.
Es importante aclarar que durante la
fermentación se tuvo la precaución de no
extraer en muestras más del 10% de volumen
de la mezcla fermentativa. Sin embargo, se
presentó un problema de presurización del
reactor que ocasionó una pérdida de
aproximadamente 80 mL de la mezcla
excediendo el porcentaje máximo indicado.
Debido a que la concentración es una
propiedad que depende del volumen, este
inconveniente podría aumentar el error en los
datos obtenidos después de haber ocurrido.
La presurización ocurrió a las 6 horas de
crecimiento.
El rendimiento biomasa sustrato (Yx/s) fue
de 0,1343 g Biomasa/g Sustrato;
investigaciones como la de (Bernstein et al.,
2012) llevadas a cabo en reactores batch
enfocados a la producción de biomasa,
muestran las ventajas de los consorcios
microbianos a través de la comparación de un
consorcio sintético de Escherichia coli que
combina una cepa de E. coli positiva a la
glucosa, que sirvió como productor primario
del sistema, con una cepa de E. coli negativa
a la glucosa que consumió subproductos
metabólicos del productor primario y su
respectivo monocultivo; utilizando glucosa
como sustrato. Los experimentos fueron
llevados aproximadamente durante 30 hrs
obteniendo rendimientos de Yx/s de 0,32 y
0,22 g Biomasa/ g Sustrato respectivamente.
5
Estos resultados nos permiten evidenciar microorganismos en un menor lapso de
ventajas y desventajas del Consorcio tiempo.
microbiano CT1 estudiado, frente a otros 4. Conclusiones
consorcios, en este caso se tiene una La determinación de la velocidad específica
desventaja debido a que se debe gastar de crecimiento máxima (𝜇max = 0,0.164
aproximadamente el doble de sustrato para ℎ−1 ) para el Consorcio microbiano CT1,
obtener la misma cantidad de biomasa indica que hay una rápida capacidad de
obtenida en los estudios. generación de biomasa en comparación con
Para el cálculo de la velocidad específica de otros consorcios y monocultivos (Bernstein
crecimiento se hace uso del modelo de et al., 2012; Trinh et al., 2016). Por otra parte
crecimiento exponencial de biomasa: el rendimiento Biomasa-Sustrato obtenido
(Yx/s= 0,1343 gB/gS) es bajo comparado con
𝑦𝑦
= 𝑦𝑦 (2) los obtenidos por (Bernstein et al., 2012;
𝑦𝑦
Trinh et al., 2016), lo que indica que se debe
(𝑦𝑦 − 𝑦𝑦)𝑦 + 𝑦𝑦(𝑦𝑦) =
invertir una mayor cantidad de sustrato para
𝑦𝑦(𝑦𝑦) (3) la formación de biomasa. Esto nos indica que
Siendo X la concentración de Biomasa y t el CT1 puede incurrir en un mayor gasto en
tiempo. términos de sustrato utilizado , pero logra
La ecuación (3) presenta la forma de una producir una mayor cantidad de biomasa en
línea recta con pendiente umax (asumiendo un menor tiempo, esto en términos
que hubo un crecimiento balanceado) y como industriales podría representar procesos más
intercepto ln(Xf). Al hacer la regresión lineal rápidos que conlleven a menores gastos
definiendo la fase exponencial desde 0 a las económicos.
10h de crecimiento se obtiene que 𝜇max = 5. Referencias
−1 2
0.164ℎ con un 𝑦 de 0.9641. Bernstein H. C., Paulson S. D. and Carlson R.
Nuevamente se realiza la comparación con P. (2012) Synthetic Escherichia coli consortia
(Bernstein et al., 2012) el cual obtuvo valores engineered for syntrophy demonstrate
de 𝜇max de 0,152 ℎ−1 para el consorcio de enhanced biomass productivity. J.
E. coli y 0,116ℎ−1 para el monocultivo. En Biotechnol, 157, (p. 159–166).
este caso tenemos una ventaja del Consorcio
microbiano CT1 el cual logra obtener un Durango, L.P. (2007) Evaluación y
mayor cambio en la concentración de los escalamiento de la producción de levaduras
nativas tipo Saccharomyces spp. a nivel de

6
laboratorio. Trabajo de grado, Fac. Ing, Dpto.
Ing. de proces. Prog. Ing. Proces. Univ.
EAFIT.
Lin, C. Y., & Hung, W. C. (2008).
Enhancement of fermentative
hydrogen/ethanol production from cellulose
using mixed anaerobic cultures. International
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Jiménez H., Cárdenas M., Conde E. & Rico
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