Laboratorio 4.

Producción de etanol a partir de Sacharomyces

cerevisiae inmovilizada en alginato de calcio
Lorena Bello forero (leidybefo@unisabana.edu.co) Felipe Galvis Mora (felipegamo@unisabana.edu.co)
Presentado a: Luis Eduardo Díaz (luisdb@unisabana.edu.co)
Universidad de La Sabana 16 Septiembre de 2019

Abstract

Yeasts are a group of very small, unicellular fungi of various shapes. Human beings have used them
over time for the production of beer, wine and bread, due to its ability to decompose carbohydrates,
such as Saccharomyces cerevisiae a heterotropic yeast, which obtains energy from glucose and has
a high fermentation capacity (1). This document seeks to determine the amount of yeast per sphere
with the Neubauer chamber and as it allows the production of ethanol through reducing sugars such
as glucose by the DNS method, lo cual en la determinacion de levadura se obtuvo 22068,97 células/
esferas y finalmente en el proceso de fermentación del etanol un rendimiento del 4,32 %.

Key words

Levadura, Saccharomyces cerevisiae, cámara de Neubauer, DNS, fermentación.

Introducción

Los primeros microorganismos utilizados fermentación, los cuales son considerados a

como fuente de proteínas, fueron las
levaduras, principalmente la Saccharomyces
cerevisiae, que aún hoy día es la principal
fuente de proteína unicelular y por ende la
más comercializada (2). Las levaduras tienen
un papel muy importante en la producción y
deterioro de los alimentos es por esto que son
objeto de interés en el campo de los alimentos
por su aporte nutritivo y aromático, esto se
debe a su capacidad de descomposición de
carbohidratos. En la industria alimentaria se
clasifican en 7 grupos que son: Panadería,
cervecería, vinificación, destilación, alimentos,
derivados de las levaduras y etanol
industrial.En el proceso de fermentación la
levadura extrae energía del azúcar que está
presenta en la materia prima y debido a que
son anaerobias generan alcohol como
producto secundario. Para la producción de
vino, la levadura se alimenta del azúcar de las
uvas y lo reemplaza por alcohol y finalmente
para la producción de cerveza se realiza
mediante la fermentación de una levadura que
se alimenta del azúcar que está presente en
los granos de cebada que en este caso son
Saccharomyces cerevisiae (3). Existen
diferentes variables que afectan la hora de
la hora de la práctica para obtener un mayor
rendimiento de fermentación alcohólica, estos
son: Tipo de microorganismo, concentración
de sustrato y etanol, temperatura, pH y
aireación. También dentro de las variables es
importante la inmovilización de células, debido
a que normalmente dentro del proceso de
fermentación para la producción de alcohol se
pierde la biomasa cuando se ha finalizado el
proceso, es por esto que a través del alginato
de calcio un proceso de atrapamiento se
inmovilizaron las células de la levaduras, y
posteriormente se lleva a la cámara de
Neubauer para determinar la cantidad de
levadura por esfera obtenida. De igual
manera, para la determinación de azúcares
reductores se realiza por medio del método
DNS, se basa en la reacción con el ácido 3,5-
dinitrosalicilico para generar ácido 3-amino-5-
nitrosalicilico dando una coloración marrón.
Para el seguimiento del proceso de
fermentación, se deja fermentar por 20 horas
y se toma muestran cada dos horas para
medir la concentración de etanol.

1
Procedimiento
1. Preparación de la solución de
alginato.
1.1.Preparar una solución de 50 mL de
alginato de sodio al 3% mezclando el alginato
hasta completa solubilidad.
1.2.Agregar lentamente al agua sin generar
grumos.
1.3.Realizar una esterilización mediante baño
maría (92 ºC) por 20 min.
1.4.Dejar en reposo la solución a temperatura
ambiente hasta alcanzar una temperatura por
debajo de 40 ºC.
2.1.Pesar 1,5 g de levadura y suspenderlos en
25 mL de agua destilada y mezclar con la
solución de alginato preparada. Nota: Debe
realizarse en cabina o detrás de un mechero.
2.2.Agitar hasta alcanzar una mezcla
homogénea.
2.3.Colocar la suspensión en una jeringa y
descargar lentamente gota a gota en la
solución de cloruro de calcio 0,1 M en
constante agitación.
2.4.Depositar 10 gotas de alginato de sodio en
10 mL de solución salina.
2.5Transferir a un balón aforado de 25 mL y
llevar aforo con solución salina.Realizar
conteo celular en cámara de Neubauer.
2.6.Una vez formadas las esferas esperar 60
min hasta que endurezcan, luego retirarlas de
la solución de cloruro de calcio con un
colador.
2.7.Llevarlas a un erlenmeyer con
desprendimiento que contenga 100 mL de
medio de cultivo estéril.
2.8. El montaje consiste en incubar el
erlenmeyer bien tapado en una incubadora
con agitación, este se conecta con una
manguera que burbujea los gases producidos
a una solución de hidróxido de calcio.
2.9.Esperar una agitación a 200 rpm y una
temperatura de 30 ºC
2.10.Para el seguimiento al proceso de
fermentación tomar 1 mL de etanol cada dos
horas.Dejar fermentar 20 horas
2.11.Al finalizar este tiempo guardar la
solucion de hidroxido de calcio para luego
filtrar el precipitado y separar las esferas con
levadura inmovilizada del medio de
fermentación con un filtro.
2.12. Secarlas con una toalla, pesarlas y
contarlas.
2.13.Colocar en horno a 60 ºC el papel filtro
con precipitado.
3. Determinación de azúcares reductores por
medio de ácido dinitrosalicilico (DNS)
3.1.Preparación de la curva estándar.
Tabla 1.Volúmenes de reactivos utilizados en
la preparación de la curva estándar.
3.2.Paralelamente a la curva de calibración se
mide la concentración de azúcares reductores
a las muestras tomadas a diferentes tiempos.
3.3.Tomar 150 µl de la solución de las
muestras tomadas el mismo día de realizado y
colocar en tubos de ensayo.
3.4. Adicionar 350 µl de agua destilada. A
todos los tubos incluyendo la curva de
calibración se le adiciona 500µl de DNS.
3.5. Se llevan los tubos a ebullición por 5 min
y luego a hielo por 3 min.
3.6. A todos los tubos adicionar 5 mL de agua
destilada, agitar y dejar en reposo por 2 min.
Leer a 540 nm.
4. Curva de calibración de etanol mediante
determinación de índice de refracción
4.1. Preparar las siguientes soluciones
Tabla 2. Volúmenes de reactivos utilizados en
la preparación de la curva de calibración del
etanol.
2

Resultados
Tabla 1. Resultados obtenidos para la
construcción de curva de calibración etanol
Tabla 2. Resultados obtenidos para la
construcción de curva de calibración Glucosa
Tabla 3. Resultados obtenidos absorbancias
de las muestras para la determinación de
concentración de glucosa.
Tabla 4. Resultados obtenidos índices de
refracción de las muestras para la
determinación de concentración de etanol.
Análisis de resultados
Durante la fermentación de la
Saccharomyces cerevisiae se pudo
determinar que la producción de etanol fue de
muy baja concentración, esto se debe a que
en una fermentación de microorganismos la
presencia o ausencia de oxígeno es un factor
determinante a la hora de ocurrir la reacción
para la producción de alcohol, en este caso la
finalidad era obtener la mayor cantidad de
alcohol por ende se buscaba que la reacción
de fermentación estuviera en un medio
anaerobio ya que la presencia del oxígeno
puede disminuir la producción de alcohol,
debido a que lleva la producción de la
levadura favoreciendo el crecimiento celular.
Gráfica 1. Curva de calibración índices de
refracción para determinación de
concentración de etanol
Gráfica 2. Curva de calibración
absorbancias para determinación de
concentración de glucosa
Mediante la curvas de calibración de etanol y
glucosa se procede a utilizar los índices de
refracción y absorbancias obtenidas de las
diferentes muestras tomadas a diferentes
tiempos y construir la gráfica de concentración
de etanol y glucosa frente al tiempo de
3
incubación con la Sacharomyces cerevisiae
por lo cual se obtuvo:
Este valor se calcula según el valor obtenido a
través del valor inicial mediante índices de
refracción y omitiendo que el valor inicial
supuesto de etanol debería ser 0.
17,87 − 15,89 = 1,98

Rendimiento del etanol

Dentro de la producción de etanol se

encuentra la siguiente reacción:

C6H12O6 → 2 C2H5OH + 2 CO2 + Energía

Gráfica 3. Consumo de glucosa a través del
Reaccion 1
tiempo de reacción.
Principalmente para conocer cual fue el
rendimiento que obtuvo el etanol, se halló la
cantidad de etanol de manera teórica de la
siguiente manera:

g 1 mol C6H12O6
100 C6H12O6*
L 180,1559 g
mol C6H12O6
=0,5551 ∗0,1L = 0,0555 moles C6H12O6
L

2 moles de C2H5OH
0,0555 moles C6H12O6*
1 mol de C6H12O6
Gráfica 4. Consumo de glucosa a través del = 0,1110 moles C2H5OH
tiempo de reacción
Durante la práctica, se determinó la
A partir de esta gráfica se puede deducir que producción de Carbonato de Calcio y a partir
si hubo un consumo de glucosa referente al de la reacción 2, se puede determinar la
tiempo inicial y al tiempo final de reacción, sin cantidad de CO2 y de esta manera la de
embargo al ver la gráfica se analiza una etanol, lo cual el valor obtenido corresponde al
inconsistencia debido a que hay un valor real del Etanol:
incremento en la glucosa inicial lo cual sería
algo incoherente puesto que había una Tabla 5. Datos obtenidos para la
aparición de materia, junto con esto a partir de determinación de carbonato de calcio
la producción etanol se puede ver que si hay
una producción de etanol pero esta es muy
baja la cual pudo ser afectada por no realizar Datos Peso (g)
de manera correcta el aislamiento de la
Vidrio + papel + 48,6987
Saccharomyces cerevisiae y así mismo que el Carbonato de calcio
medio de reacción debe estar completamente
aislado del oxígeno para favorecer la reacción Vidrio + papel 48,2192
de fermentación en el sentido del etanol.
Además de esto podemos calcular la cantidad CaCO3 0,4795
de etanol producido y el consumo de glucosa
ignorando las fluctuaciones evidenciadas en CaCO3 → CO2 + CaO
las gráficas de producción y consumo. Reacción 2

Consumo de glucosa 1 mol CaCO3

0,4795g CaCO3* =0,004791 mol
100,0869 g de CaCO3
0,0568 − 0,0066 = 0,0514
1 mol CO2
CaCO3* =0,004791 moles de CO2
1 mol CaCO3
Producción de etanol 2 moles de C2H5OH
0,004791 moles CO2*
2 mol CO2

4
 =0,004791 moles C2H5OH
Rendimiento real
% Rendimiento= *100
Rendimiento teórico
0,004791 moles C2H5OH
% Rendimiento= *100=4,32%
0,1110 moles C2H5OH
De acuerdo a los datos obtenidos en la
producción de etanol a partir de
Sacharomyces cerevisiae se obtuvo un
rendimiento del 4,32 %
Conteo celular por medio de la cámara de
Neuabauer
Con el objetivo de determinar la cantidad de
levadura que se encontraba por esfera
(células/esferas) y la cantidad de levadura por
g de soporte de inmovilización (células/g de
soporte de inmovilización) se procede a
realizar los siguientes cálculos conociendo
que el número de células contadas en la
cámara de Neubauer es de 16 células
16*10000= 160.000 células/mL
De acuerdo a la solución que se realizó que
fueron 10 gotas de alginato de sodio en 20 mL
de solución salina se procede a hallar la
cantidad de células:
160.000 células/mL * 20 mL =
3.200.000 células
Así mismo también se puede conocer la
cantidad de células que había por gota de la
siguiente manera:
3.200.000 células / 10 gotas =
320.000 células / gota
Posteriormente se procedió a pesar todas las
esferas y luego únicamente 10 esferas esto
con el propósito de conocer la cantidad de
esferas que se tenían:
10 esferas → 44.0305 g
X → 63,8513 g
X= 14,50 esferas
Conociendo el número de células y el número
de esferas, ya se puede conocer la cantidad
de levadura que hay por esfera:
3.200.000 células / 14,50 esferas =
22068,97 células / esferas
Finalmente conociendo ya el número de
células y los g de soporte de inmovilización
que son 1,5 g de alginato de sodio se
determina la cantidad de levadura por g de
soporte:
3.200.000 células / 1,5 g de soporte =
2133333,333 células / g de soporte
Conclusiones
En este laboratorio no se logró de manera
adecuada la producción de etanol a partir de
Sacharomyces cerevisiae dado que en el
proceso de fermentación no se produjo en
grandes cantidades etanol, sin embargo esto
se puede explicar en fallos experimentales a
la hora de realizar el aislamiento de la
Sacharomyces cerevisiae y el aislamiento de
oxígeno de la reacción de fermentación,
además de esto se pudo evidenciar falencias
a la hora de realizar la toma de las muestras
para determinar la producción de forma
correcta, asimismo se pudo encontrar que el
consumo de glucosa fue casi en su totalidad y
aun así produciendo una mínima cantidad de
etanol como es comprobado en el rendimiento
final de etanol, por lo cual se podría concluir a
partir de este laboratorio que la producción de
etanol a partir de la Sacharomyces cerevisiae
no es un método efectivo. De igual manera se
logro determinar la cantidad de levadura
respecto a esferas y g de soporte obteniendo
valores de 22068,97 células/esferas y
2133333,333 células/g de soporte.
Referencias
1.Querol, A. (2003) Molecular evolution in
yeast of biotechnological interest. Extraído de:
DOI 10.1007/s10123-003-0134-z
2.Machin, S.; Carralero, G.; Norge, A;
Rodríguez, G. & Amarilys, C. (2016) Levadura
Saccharomyces cerevisiae y la producción de
alcohol. Disponible en :
5
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=2231484 Cuestionario
20004 1.Para la fermentaciomn alcholica de manera
3.González, M. (2014) Caracterizacion industrial comienza despues de que la glucosa
bioquimica y biotecnologia de la levadura entra en la celda, la glucosa se degrada en un
“Saccharomyces cerevisiae” Gl15. Disponible acido pyruvi. Este acido piruvic se convierte
en: luego en CO2 y estanol.
https://biblioteca.unirioja.es/tfe_e/TFE000802. 2.Si existe una relacioon y esto se debe a que
pdf en presencia de oxígeno se determina tanto la
4. Uribe, L. (2007) Caracterización fisiológica selección del microorganismo como el
de levaduras aisladas de la filosfera de mora. producto que se obtenga en la fermentación
Disponible en: 3. Para que en un proceso de fermentacion
https://javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/te haya produccion de lactato en vez de etanol
sis276.pdf se debe favorecer con condiciones
5. Viñas, I. & Usall, J. (1998) Optimización de anerobicas.
la producción del agente de biocontrol 4.El ácido poliláctico (PLA), es un
Candida sake (CPA-1). Disponible en: biopolímero termoplástico cuya molécula
https://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/83 precursora es el ácido láctico. Debido a su
89/TSMAC1de3.pdf?sequence=1&isAllowed= biodegradabilidad, propiedades de barrera y
6. Galvis, M. (2009) Estudio del proceso de biocompatibilidad éste biopolímero ha
fermentación de glucosa para la producción encontrado numerosas aplicaciones por sus
de bioetanol a partir de levaduras nativas. propiedades desde el estado amorfo hasta el
Extraído de: estado cristalino.En la producción por
http://tangara.uis.edu.co/biblioweb/tesis/2009/ fermentación, se busca que fermenten rápida
131929.pdf y completamente sustratos baratos, con
7. Peña, C. (2008) Evaluación de la adición mínima de nutrientes nitrogenados,
producción de etanol utilizando cepas que crezcan en condiciones de valores
recombinantes de Saccharomyces cerevisiaea reducidos de pH, presenten poca producción
partir de melaza de caña de azúcar. Extraído de biomasa y una despreciable cantidad de
de:http://www.scielo.org.co/pdf/dyna/v76n159/ subproductos.
a16v76n159.pdf
8. Argote, F.; Cuervo, R.; Osorio, E.; Delgado,
J. & Villada, H. (2015) Evaluación de la
producción de etanol a partir de melaza con
cepas nativas saccharomyces cerevisiae.
Extraído de: DOI:10.18684/BSAA(13)40-48
9. Estela, W.; Rychtera, M.; Melzoch, K.;
Torres, F.; Calixto, R.; Bravo, N.; Memenza,
M. & Chavéz, Y. (2014) Efecto de la aireación
en la producción de compuestos volátiles por
cultivo mixto de Brettanomyces
intermedius y Saccharomyces
cerevisiae durante la fermentación de sidra.
Extraído de: https://doi.org/10.1016/S1405-
888X(14)70316-X
10. Ariel, C.; Sanchez, O.; Montoya, M. &
Quintero, J. (2005) Simulación de los
procesos de obtención de etanol a partir de
caña de azúcar y maíz. Extraído de:
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/483
4405.pdf