UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, CLASIFICACIÓN DE MEDIOS,

ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES

SEGUNDO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

CESAR CALLALLI TORRES- 20162189 F------- (firma)

IVON AGUILAR VEGA – 20151324 D--------- (firma)

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
06 de abril de 2017
 Preparación de Cultivos

ÍNDICE

RESUMEN………………………………………………………………………………. 3

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….…….. 4

OBJETIVOS……………………………………………………………………………… 5

MARCO
TEÓRICO………………………………………………………………………………… 6

PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL………………………………………………………………………… 10

METODOLOGÍA……………………………………………………………………..….. 11

DISCUSIONES DE
RESULTADOS…………………………………………………………………………… 13

RECOMENDACIONES………………………………………………………………….. 13

FUENTES DE
INFORMACIÓN…………………………………………………………………………… 14

ANEXO…………………………………………………………………………………….. 15

APÉNDICE………………………………………………………………………………… 16

II
 Preparación de Cultivos

RESUMEN

En condiciones de laboratorio se realizó la preparación de Agar Plate Count (22,5gr/l)

como medio de cultivo, teniendo en cuenta las indicaciones para la preparación dadas
por la etiqueta de los envases. Basados en esta información se realizaron los cálculos
adecuados para la preparación de 300ml de Agar Plate Count, al término se llevó a
esterilizar en autoclave durante15 minutos a 121ºC. Luego se procedió a preparar el
agua peptonada(0,1gr/l) con 150ml de AP. Como también la preparación del caldo
nutritivo(8gr/l) en 130ml y por último la preparación del caldo nutritivo BHI(37gr/l).
Finalmente se realizó la prueba de esterilidad, incubando los medios de cultivos
preparados durante 24 horas con una temperatura de 37ºC.

III
 Preparación de Cultivos

INTRODUCCION

Por su minúsculo tamaño, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos,

sino que es necesario manejarlos como poblaciones. Para ello es preciso cultivarlos,
es decir, favorecer su multiplicación in Vitro, en ambientes especiales que
proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hábitats naturales. En estos
ambientes se debe eliminar mediante la esterilización a todos aquello
microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo de interés. Estos
medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y
en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

Estos medios son realizados en el Laboratorio de Microbiología por lo que el control

de su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud, confiabilidad
y reproductibilidad de los resultados obtenidos. Pueden ser preparados en forma
líquida, sólida o semisólido.

Generalmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido luego se le

añade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la sílicagel.

El desarrollo de este laboratorio tuvo como finalidad adquirir conocimientos de cómo

se prepara un medio de cultivo y aplicación de técnicas de siembra para la distribución
de colonias de microorganismos.

IV
 Preparación de Cultivos

OBJETIVOS

Objetivo General:
 Conocer, preparar los diferentes tipos de medios de cultivo como soporte y
fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos en el laboratorio.
 Adquirir la idea de la importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las
técnicas más comunes para realizarlo.

Objetivos Específicos:
 Elaborar adecuadamente los medios de cultivo deshidratados y por
componentes.
 Envasar los medios de cultivo de manera adecuada en los diferentes recipientes
de acuerdo al uso que se les dará.
 Lavar, preparar y envolver correctamente el material que se someterá a
esterilización.
 Seleccionar los métodos de esterilización adecuados para las diversas
necesidades del laboratorio de microbiología.
 Comprobar la efectividad del proceso de esterilización

V
 Preparación de Cultivos

MARCO TEORICO

1. NUTRICION
La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman las sustancias químicas que
necesitan para crecer, del medio donde habitan. Dichas sustancias se denominan
nutrientes, y se requieren para dos objetivos:

Energéticos: Los microorganismos requieren energía del exterior.

Biosintéticos: Formar sustancia que constituyen la célula.

Los nutrientes pueden clasificarse en:

 Universales: Son aquellos nutrientes que todos, o bien la mayoría de los

microorganismos, requieren para su crecimiento. Los más importantes son: agua,
dióxido de carbono (CO2), fosfatos, sales minerales.
 Particulares: Se trata de elementos que pueden ser cubiertos de modo muy distinto,
dependiendo de las capacidades biosintéticas del microorganismo que se considere.
Concretamente consideraremos los elementos N y S (que requieren todos los seres
vivos).
 Factores de crecimiento: Son moléculas orgánicas específicas que algunas
bacterias necesitan, en muy pequeña cantidad, para crecer. Salvo excepciones no
tienen función plástica, ni sirven como fuente de energía. Suelen ser coenzimas o
sus precursores, vitaminas, que determinadas bacterias no pueden fabricar por sí
mismas, al carecer de parte (o toda) de una ruta biosintética. Consideraremos como
ejemplos, oligoelementos, vitaminas y minerales.

2. MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir,
en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus,
microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que
se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se
presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya
preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último

VI
 Preparación de Cultivos

del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas

más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento
en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento
de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.

SEGÚN SU NATURALEZA

 Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de

origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adición
de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes,
ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
 Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición
química definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en
trabajos de investigación.

DE ACUERDO AL USO DEL MEDIO DE CULTIVO:

 Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que favorecen el crecimiento

de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el número de
microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o más sustancias
inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepción de los que se
quieren cultivar.
 Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por
ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos
específicos.
 Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos
derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen
ningún tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar
características fisiológicas de los microorganismos.

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

 Solidos: corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar está

siempre por encima de 15%, la importancia es muy grande ya que nos permite
el aislamiento, purificación y visualización de su crecimiento en colonias, así
como su posible identificación a través de medios específicos y diferenciales de
carácter sólidos, elaboración de antibiogramas, etc.

VII
 Preparación de Cultivos

 Semisólidos: Corresponden a aquellos medios donde la proporción en agar

suele ser inferior al 5% pero siempre suelen presentar una cierta cantidad que le
proporcione una consistencia semisólida. Son útiles para ciertas pruebas
bioquímicas, por ejemplo la prueba de oxidación-fermentación, que permite
conocer el tipo de metabolismo oxidativo o fermentativo de la bacteria problema.
 Líquidos: Corresponden a los que también se denominan caldos, no contienen
agar y su composición, además de agua, suele contener al menos una fuente de
carbono, sales minerales, sales minerales y, en algunas ocasiones según las
características del medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, ciertos
aminoácidos, etc. Son de gran utilidad para la realización de múltiples pruebas
bioquímicas, para la identificación de bacterias, para la realización de recuentos
bacteriológicos por turbidimetria, etc.
 Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:

 Cambio de pH: por ejemplo, agregando ácido acético para favorecer el crecimiento
de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil para la mayoría de las especies que
crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6.
 Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece óptimamente entre 20º
C y 40º C. Los cultivos típicos de S. Faecalis requieren 60º C de temperatura y los
de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4º C.
 Alteraciones osmóticas: se acrecientan las propiedades osmóticas un medio con
el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la selección de bacterias
halófilas como Staphylococcus spp. (7,5%).
 Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de aerobios y
anaerobios.
 Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos importantes
pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión más allá de la atmosférica.

3. CONSTITUYENTES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los elementos citados a continuación, son los más frecuentemente usados en la
preparación de los medios de cultivo, aunque pueden no ser los únicos e incluso alguno
de ellos puede estar ausente de la preparación.

 Agua destilada o des ionizada: Libre de inhibidores del crecimiento.

 Agar: El agar se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios
de cultivo. El componente dominante en el agar es un polisacárido, al que
acompañan algunas impurezas y que se obtiene de ciertas algas marinas.

VIII
 Preparación de Cultivos

Existe en rama o en polvo, se solubiliza en agua a ebullición (funde hacia los

98°C) y al enfriarse forma un gel inodoro e insípido (se gelifica alrededor de los
42°C), dependiendo de su grado de pureza, por lo que tiene la ventaja de ser
sólido a la temperatura de incubación. Con la excepción de algunos
microorganismos marinos, el agar no es empleado como nutriente. Para
preparar un medio sólido se le agrega agar al 12-18 %. Si se desea visualizar
movilidad se usa agar blando se le agrega agar al 3 %.
 Extractos: Para su preparación, ciertos órganos o tejidos animales o
vegetales (por ejemplo carne, hígado, semillas, etc.) son extraídos con agua y
calor, y posteriormente concentrado hasta la forma final de pasta o polvo.
Estos preparados deshidratados son frecuentemente empleados en la
confección de medios de cultivo. Ejemplos: extracto de carne, de levadura, de
malta, etc. En el caso del extracto de carne en polvo o pasta, provee
sustancias nitrogenadas, minerales y vitaminas, mientras que el extracto de
levaduras provee vitaminas del grupo B, nitrógeno y carbono.
 Peptonas: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos nitrogenados y
sales minerales que carecen de identidad química definida; se obtienen por
digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja, carne,
gelatina, caseína, etc.). Las peptonas son muy ricas en péptidos y
aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales.
Proveen proteosas, peptonas, polipéptidos y aminoácidos.
 Fluidos Corporales: Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguíneo son frecuentemente añadidos a los medios empleados para el
cultivo de algunos patógenos. La sangre no puede ser esterilizada y debe, por
tanto, ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano.
Los fluidos corporales no solamente contribuyen con factores de crecimiento,
sino también con sustancias que neutralizan inhibidores del crecimiento de
algunas bacterias.
 Sistemas amortiguadores: Algunos componentes son incorporados al medio
de cultivo para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento
bacteriano. Los microorganismos más comunes son neutrófilos (el pH óptimo
para su crecimiento está próximo a la neutralidad), y sales como fosfatos
bisódicos o bipotásicos, o sustancias como las peptonas, previenen una
desviación del pH.
 Indicadores de pH: Indicadores ácido- base se añaden a menudo a los
medios de cultivo con objeto de detectar variaciones del pH.

IX
 Preparación de Cultivos

 Agentes reductores: Cisteína, tioglicolato y otros son agentes reductores

que se añaden a los medios de cultivo para crear condiciones que permitan el
desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios.
 Agentes selectivos: La adición de determinadas sustancias al medio de
cultivo puede convertirlo en selectivo (ver más adelante, clasificación de los
medios de cultivo). Por ejemplo, cristal violeta, sales biliares, acida sódica,
telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada, actúan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

MATERIALES

o Probetas o Pabilo
o Erlenmeyer o Tijeras
o Tubos de ensayo o Gradilla
o Espátulas o Mechero bunsen
o Algodón o Encendedor
o Alcohol 70° o Bombillas
o Guantes asbesto o Pipetas
o Papel kraft o NaOH 0.1N y KCl .1N

MEDIOS DE CULTIVOS DESHIDRATADOS

o Caldo nutritivo
o Caldo BHI
o Agar plate count (APC)
o Agua peptonada (AP)

EQUIPOS
o Refrigeradora
o Autoclave
o Balanza analítica

X
 Preparación de Cultivos

o Hornilla eléctrica

Preparación y esterilización de material de vidrio

 Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave
y al final con agua destilada.
 Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
 Introducir los hisopos en un tubo de y tapar con algodón.
 En el papel de la envoltura identificar con nombre y marcar el volumen de las
pipetas.
 Introducir el material en un horno previamente calentado a 180ºC, esperar a que
la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento contar el
tiempo de esterilización (1 hora).

METODOLOGIA

PREPARACION DE MEDIOS DDE CULTIVO

Agar plate count (APC). (22.5 gr/l)

 Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

 Pesar 6.75 gr de APC y en un Erlenmeyer disolver con 300ml de agua destilada.
 Tapar el matraz con algodón y calentar en un Erlenmeyer de 500ml hasta
disolver totalmente, para ello agitar repetidamente y evitar que el medio de
cultivo hierva y se derrame.
 Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego taparlo
con papel Kraft, ajustar bien con pabilo.
 Llevar a la autoclave (121° por 15’).
 Dejar enfriar y cuando este a temperatura ambiente colocar a la refrigeradora
(4°).

XI
 Preparación de Cultivos

Agua peptonada (AP). (1gr/l)

 Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

 Pesar 0.15gr de AP y en un Erlenmeyer de 250 ml disolver con 150ml de agua
destilada, si es necesario calentar. Medir pH.
 Tapar el matraz con algodón y calentar hasta disolución total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
 Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego repartir
a los tubos de ensayo y a un Erlenmeyer de 250ml

- 90ml de AP en un matraz de 250ml

- 9ml de AP en 5 tubos de ensayo

 Tapar matraz y tubos con tapón o algodón.

 Colocar el material en una canastilla y llevar a autoclavar (121° por 15’) luego
enfriar y conservar en la refrigeradora a (4°).

Caldo nutritivo (CN). (8gr/l)

 Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

 Pesar 1.04gr del CN y disolverlo en un Erlenmeyer con 130ml agua destilada.
Medir pH.
 Tapar el matraz con algodón y calentar hasta disolución total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
 Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego repartir
a los tubos de ensayo.

- 10ml de CN en 12 tubos de ensayo.

 Colocar el material en una canastilla y autoclavar (121° por 15’) enfriar y

conservar en la refrigeradora a (4°).

Caldo BHI. (37gr/l)

 Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo deshidratado.

 Pesar 4.81gr del medio BHI y disolverlo en un Erlenmeyer con 130ml agua
destilada. Medir pH.
 Tapar el matraz con algodón y calentar hasta disolución total, para ello agitar
repetidamente y evitar que el medio de cultivo hierva y se derrame.
 Luego de diluir completamente dejar que baje la temperatura para luego repartir
a los tubos de ensayo.

XII
 Preparación de Cultivos

- 10ml del caldo BHI en 12 tubos de ensayo.

 Colocar el material en una canastilla y autoclavar (121° por 15’) enfriar y

conservar en la refrigeradora a (4°).

DISCUSIONES DE RESULTADOS

CONCLUSIONES
 Por medio de esta práctica se aprendió la técnica empleada para la preparación
de medios de cultivo, así como la selección apropiada para el uso que se les
dará posteriormente.
 De la misma manera se observó que de acuerdo al tipo de bacteria que se
requiera sembrar, será el tipo de medio de cultivo.
 Se aplicó la técnica de esterilización de vapor a presión (autoclave), para medios
de cultivo en agar y caldo nutritivo.
 Se conoció el método de prueba de esterilidad para verificar viabilidad de los
medios de cultivo.

RECOMENDACIONES

 Observar cuidadosamente los materiales, no usar materiales rajados porque se

puede romper al momento de calentar.
 Enfriar a 50ºC-60ºC, ya que el agar hirviendo es peligroso de manejar, puede
rajar el vidrio frío y dar lugar a condensaciones excesivas.
 El agua que se utiliza para su mezclado o reconstitución debe ser destilada o
desmineralizada.
 Al calentar los medios de cultivo con agar-agar es muy importante procurar agitar
repetidamente el medio para evitar que el agar-agar se pegue en el fondo del
matraz y que se queme. Asimismo, evitar que hierva para evitar su derrame.
 Etiqueta debidamente tu material de vidrio (tubos d ensayo, matraces) antes de
verter los medios de cultivo en ellos.
 Los cestos o las latas metálicas deben estar debidamente forradas con papel
kraft.

XIII
 Preparación de Cultivos

 Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento de

contaminantes.

 Al momento de manipular las muestras de bacterias se debe realizar con mucho

cuidado ya que en algunas podría existir bacterias patógenas.

FUENTES DE INFORMACION

Manual de laboratorio Microbiología. Universidad del Valle. Facultad de Ingeniería.

Laboratorio de Microbiologia.2001.
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
Preparación de medios de cultivo. Universidad Tecnológica Nacional. Facultad de
Ingeniería Química. Catedra de Biotecnología. 2009
Diagnostico Microbiológico. Forbes. Sahm. Weissfeld. Editorial Medica Panamericana.

XIV
 Preparación de Cultivos

ANEXO

XV
 Preparación de Cultivos

APENDICE
Diagrama de flujo
Disolver la cantidad
adecuada de medio
con 100 ml de agua
destilada en un
matraz.

Dos tipos de medio.

Si el medio es
Si el medio es sólido
líquido solo se
al momento de
mezcla con agua y
calentar no se olvide
se vierte en tubos.
de agitar hasta que
se disuelva.

Se sella con tapa o

algodón los tubos y
matraces, luego se
procederá a colocar en
la autoclave por 15
minutos a una Retirar de la
temperatura de 121°c. autoclave y
dejar enfriar.

En el caso del medio

solido se tiene que
verter a las placas
Petri antes de que
solidifique con todas
las condiciones de
asepsia para que no
se contamine.

Las placas y los

tubos están listos
para sembrar.

XVI
 Preparación de Cultivos

Procedimiento calculo

Agar plate count (APC): (22.5 gr/l)

Suspender 6.75 g del polvo en 0.3 l de agua purificada. Mezcla a fondo.

Calentar con agitación frecuente y hervir durante hasta disolver completamente el polvo.
Llevar a la autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.

Agua peptonada (AP): (1gr/l)

Suspender 0.15g de polvo en 0.15 litro de agua purificada. Mezclar calentando hasta la
ebullición. Distribuir en recipientes apropiados. Esterilizar en autoclave a 121°C durante
15 minutos.

Caldo nutritivo (CN): (8gr/l)

Emplear 1.04 g de polvo por 0.13 litro de agua destilada. Si es necesario, calentar hasta
disolver. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121°C durante 15 minutos.

Caldo BHI: (37gr/l)

Mezclar 4.8 g del polvo en 0.13 L de agua purificada. Mezcla bien.
Caliente agitando frecuentemente hasta disolver completamente el polvo.
Autoclave a 121 ºC durante 15 minutos.

Datos calculados

 Pesar 6.75 gr de APC

22,5 g del polvo en 1 l de agua purificada
6.75 g ---------------0.3 l de agua purificada <> 300 ml de agua purificada

 Pesar 0.15gr de AP
15g de polvo en 1 litro de agua purificada
0.15g ---------- 0.01litro de agua purificada <> 10 ml de agua purificada.

 Pesar 1.04gr del CN

8 g de polvo por 1 litro de agua destilada.

XVII
 Preparación de Cultivos

1.04gr------------- 0.13 litro de agua destilada <> 130ml de agua destilada.

 Pesar 4.81gr del medio BHI

37 g del polvo de BHI en 1 L de agua purificada
4.81gr ------------------- 0.13 litro de agua destilada <> 130ml de agua destilada.

XVIII