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37.
Metodos de identificación
bacteriana en el laboratorio
de microbiología
2 0 1 0
I
ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO
1. Introducción
II
3. Métodos moleculares de identificación bacteriana
3.1. Introducción
3.2. Genes empleados como dianas moleculares para la identificación de bacterias
3.2.1. ARNr 16S (rrs)
3.2.2 ARNr 16S-23S y ARNr 23S
3.2.3. rpoB (subunidad β de la ARN polimerasa)
3.2.4. gyrB (subunidad β de la ADN girasa)
3.3. Fundamento de las técnicas de identificación molecular bacteriana
3.3.1. Extracción del ADN cromosómico
3.3.2. Amplificación
3.3.3. Secuenciación del amplicón
3.4. Análisis de secuencias
3.5. Criterios para la interpretación de resultados
3.6. Indicaciones de la identificación molecular
3.6.1. Identificación de cepas con escasa descripción, con baja frecuencia de aislamiento, o fenotípicamente
atípicas
3.6.2. Identificación de cepas de difícil identificación o de crecimiento fastidioso
3.6.3. Descripción de nuevos patógenos
3.6.4. Identificación de bacterias difíciles de cultivar
3.7. Desventajas de la identificación molecular
3.7.1. Calidad disminuida de las secuencias depositadas en la base de datos y errónea asignación de
especies
3.7.2. Ausencia o baja correlación entre la identificación genotípica y fenotípica
3.7.3. Baja resolución en la identificación mediante ARNr 16S
3.7.4. Presencia de electroferogramas o cromatogramas de ADN mixtos
3.8. Nuevas tecnologías en la identificación molecular microbiana
5. Bibliografía
5.1. Bibliografía. Métodos fenotípicos de identificación bacteriana.
5.2. Bibliografía. Métodos moleculares de identificación bacteriana
5.3. Bibliografía. Métodos de identificación bacteriana mediante espectrometría de masas
III
Procedimientos en Microbiología Clínica
2
DOCUMENTO CIENTÍFICO
Figura 1. Estructura secundaria del ARNr 16S. Las hélices, comunes a todos los seres vivos y denominadas
hélices universales, se numeran de la 1 a la 48 en orden de aparición a partir del extremo 5’. Las hélices
específicas de procariotas se indican con Pa-b, donde a es el número de la hélice universal precedente y b el
número de serie. Las regiones relativamente conservadas se presentan en negrilla. Las regiones variables, en
líneas finas, se designan V1-V9, teniendo en cuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se
muestran en líneas discontinuas sólo están presentes en un número limitado de estructuras
Tomado de Rodicio M, Mendoza MC. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004 Apr;22(4):238-45. Reproducido
con permiso de Elsevier España.
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El análisis de la secuencia del ARNr 16S Este elevado grado de diversidad en las ITS en
constituye una herramienta muy útil en el estudio de diferentes géneros, especies y cepas constituye la
la diversidad bacteriana en muestras clínicas y base para su utilización en identificación, filogenia
ambientales, por lo que se ha estudiado en un gran y/o tipificación.
número de especies bacterianas. Aunque las Aunque en muchos casos se considera que la
secuencias disponibles en las bases de datos secuenciación de la fracción 23S puede ser una
presentan un tamaño variable, suelen analizarse buena alternativa en los casos en los que la fracción
entre 500 y 1.500 pb. Actualmente, GenBank es la 16s no proporciona resultados concluyentes,
base de datos con mayor información ya que presenta una serie de inconvenientes que han sido
contiene más de 2 millones de secuencias evaluados por algunos autores. Además de
depositadas del gen ARNr 16S. Es también incrementarse el coste, existen dificultades para la
interesante considerar cuando es necesario analizar amplificación de fragmentos más grandes de forma
la secuencia completa o cuando una secuencia de rutinaria con propósitos taxonómicos. Un problema
menor tamaño va a proporcionar información añadido es la existencia de abundantes secuencias
suficiente. Para diferenciar taxones específicos, de inserción (IS), que sin embargo pueden ser
establecer diferencias entre cepas o para describir fácilmente localizadas y eliminadas mediante análisis
nuevas especies, es necesario el análisis de la comparativo, por lo que puede ser utilizado en la
secuencia completa del ARNr 16S. Por el contrario, actualidad como un método auxiliar útil con fines
para la mayoría de los aislamientos clínicos, la taxonómicos y filogenéticos.
secuencia de 500 pb proporciona una identificación 3.2.3. rpoB (subunidad β de la ARN polimerasa).
adecuada (a menor coste), aumentando la La ARN polimerasa (RNAP) es una enzima
posibilidad de encontrar diferencias cuanto mayor es imprescindible en el proceso de transcripción y
el fragmento secuenciado (más diversidad por constituye la diana final de las diferentes rutas que
kilobase secuenciada). Hay que tener en cuenta, que controlan la expresión génica en los organismos
las relaciones filogenéticas y los dendrogramas vivos. En bacterias es responsable de la síntesis del
generados pueden ser similares, pero no idénticos ARNm, ARNr y ARNt. La parte central de la RNAP
en función del tamaño del fragmento del 16S (400kDa) está compuesta de 5 subunidades: el
analizado. dímero α2, β, β´ y ω.
3.2.2. ARNr 16S-23S y ARNr 23S. También se han La subunidad β, codificada por el gen rpoB, es el
utilizado otras zonas del ARNr para la identificación y principal responsable de la actividad catalítica de la
estudio de relaciones filogenéticas. Entre ellas las RNAP. Debido a su distribución universal en las
regiones del espacio intergénico del ARNr 16S-23S bacterias se sugirió su aplicación como un
(ITS). Estas ITS se presentan en un número variable cronómetro molecular de alta potencia. En 1993 y
en función del número de operones ARNr o alelos rrn utilizando S. aureus se inició la secuenciación del
(10 en Bacillus subtilis, 10 en Clostridium gen rpoB con el objetivo de identificar
perfringens, 1 en Mycobacterium spp., 1-2 en molecularmente bacterias con repercusión clínica. Se
Mycoplasma spp., etc). Las ITS presentan un tamaño presenta en monocopia, con alguna excepción, y
variable entre diferentes especies (60-pb en tiene un tamaño variable según las especies desde
Thermoproteus tenax a 1529-pb en Bartonella 3.411 pb en S. aureus a 4.185 pb en N. meningitidis.
elizabethae). Este polimorfismo en el tamaño, Las secuencias del rpoB presentan en numerosas
también se presenta en cepas pertenecientes a una ocasiones mayor calidad que las del ARNr 16S al ser
misma especie, como sucede en S. aureus (303-551- secuencias que se han incluido más recientemente
pb) y Haemophilus influenzae (478-723-pb). en las bases de datos. Su traslado a secuencias de
Además, estas variaciones en el tamaño de las ITS aminoácidos, permiten detectar los errores de
se producen por el número y tipo de genes ARNt que secuenciación que producen los codones de
contienen, como sucede en la mayoría de bacterias finalización erróneos. Además, la secuencia de
Ala Ile
gramnegativas que contienen ARNt y ARNt , aminoácidos deducida permite establecer
Glu
mientras que otros contienen solo ARNt (H. agrupamientos de especies bacterianas.
influenzae, Aeromonas hydrophila). Por el contrario, Otro factor importante, es que existe mayor
Ala Ile
bacterias grampositivas contienen ARNt o ARNt o correlación en la similitud de la secuencia del rpoB
ambos, o ningún gen ARNt. El análisis de las con el criterio de inclusión en la misma especie de la
secuencias de las ITS ha demostrado una estructura hibridación ADN-ADN (DDH <70%). Este criterio no
en mosaico en diferentes especies (H. se cumple fácilmente para valores de similitudes del
parainfluenzae, C. difficile, entre otros), con la ARNr 16S superiores al 99%. Otra circunstancia
presencia o ausencia de bloques de ~100-pb en las favorable del análisis del rpoB es su aplicación como
diferentes copias existentes en el genoma. En la instrumento de genotipificación y de filogenia. Este
identificación molecular de Bacillus anthracis, B. hecho es consecuencia de que las sustituciones
cereus y B. thuringiensis, la presencia de nucleotídicas que se producen son silentes (tercera
polimorfismos o SNPs (single nucleotide posición del codón) y que por su función de gen
polymorphisms) en las posiciones 75 y 121 del housekeeping probablemente no esté sometido a
Ile
ARNt incluido en la ITS completan la identificación transferencia horizontal genética. No obstante en
de estas especies tan estrechamente relacionadas. algunos casos, como en Pseudomonas stutzeri, se
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ha demostrado el intercambio horizontal intraespecie aminoacídicas acontecidas principalmente en la
de fragmentos génicos. subunidad α de la topoisomerasa II y su homóloga la
El gen rpoB contiene regiones conservadas y topoisomersa IV, conducen a fenotipos de
regiones alternas variables. Los cebadores de amplio resistencia a fluoroquinolonas.
espectro se diseñan sobre las regiones conservadas El gen gyrB es un buen cronómetro molecular
y suele incluirse una región interna variable. A para realizar estudios filogenéticos en numerosos
diferencia del ARNr 16S, no se pueden utilizar géneros, permitiendo establecer diferencias inter e
cebadores universales para su amplificación. Sin intraespecie. Actualmente, constituye un marcador
embargo, se puede realizar un diseño de cebadores molecular relevante en la investigación de especies
de amplio espectro que amplifique diferentes relacionadas, aventajando al ARNr 16S o a las
órdenes pertenecientes a un mismo phylum regiones espaciadoras del ADN.
bacteriano. Por último, existe una gran variedad de genes con
La comparación de las secuencias del gen fragmentos conservados y regiones variables que se
completo o de sus fragmentos del gen rpoB se utilizan en numerosos grupos de bacterias, hps65
realiza principalmente a través de las bases de datos (micobacterias), recA (genovariedades de B. cepacia
del GenBank o de BIBI. Una secuencia parcial (300- complex), hsp60 (codifica para la chaperonina 1, y se
750 pb) es suficiente para la identificación de encuentra altamente conservado en numerosas
aislamientos clínicos, mientras que para las nuevas bacterias, arqueas y eucariotas) y que constituyen
especies se secuencia el gen completo. Se ha una buena alternativa para estudios taxonómicos,
comprobado que el análisis del fragmento evolutivos, de ecología y filogenia.
hipervariable (posiciones 2300-3300 pb) se
correlaciona positivamente con el análisis del gen 3.3. FUNDAMENTO DE LAS TÉCNICAS DE
completo. IDENTIFICACIÓN MOLECULAR BACTERIANA.
El gen rpoB constituye uno de los pocos genes Las técnicas de identificación molecular en bacterias
candidatos útiles en la identificación bacteriana en mediante el análisis del ARNr 16S u otros genes
los análisis taxonómicos y filogenéticos de cepas de mencionados se basa en la amplificación genómica y
origen humano, animal y ambiental. El gen rpoB en la secuenciación de esos genes o sus
permite la identificación a nivel de género, especie y fragmentos. El medio de cultivo o las condiciones de
en ocasiones a nivel de subespecie. Aunque no incubación no serán factores determinantes, pero si
siempre, es también útil para diferenciar serán factores críticos la técnica de extracción del
serovariedades biovariedades como sucede en ADN cromosómico y la amplificación. A continuación
Salmonella enterica subsp. enterica). se describen las etapas metodológicas (Figura 2) a
3.2.4. gyrB (subunidad β de la ADN girasa). Es el considerar en la identificación molecular.
gen codificante de la subunidad β de la ADN girasa o 3.3.1. Extracción del ADN cromosómico.
topoisomerasa II y está implicado en la replicación Dependiendo de la rapidez en el diagnóstico y/o
del ADN bacteriano. De distribución universal, la dificultad en el crecimiento del patógeno (bajo
presencia en monocopia de gyrB permite la inóculo, lento crecimiento, requerimiento de medios
discriminación e identificación de especies sintéticos complejos, etc.), se podrán aplicar estas
fuertemente relacionadas pertenecientes a los técnicas directamente sobre muestras clínicas o
géneros Aeromonas, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, sobre el cultivo bacteriano. El ADN genómico se
y también enterobacterias, micobacterias y bacterias extraerá a partir de las células totales mediante
ácido-lácticas. Es un marcador de gran utilidad en la diferentes métodos estándar o sistemas comerciales
sistemática bacteriana al presentar una tasa de con versatilidad sobre el tipo de muestra clínica o de
sustituciones sinónimas o silentes que se estima en matrices, en el caso de tratarse de una muestra
al menos cuatro veces mayor que la del ARNr 16S. alimentaria o ambiental. Dependiendo del tipo de
La ADN girasa cataliza la interconversión de los bacteria se pueden aplicar modificaciones que
isómeros topológicos del ADN. Está formada por dos simplifiquen u optimicen la extracción cromosómica.
monómeros de cada subunidad GyrA y GyrB, 3.3.2. Amplificación. En un termociclador, este
codificados por los genes gyrA y gyrB, ADN se utilizará como molde para la amplificación
respectivamente. Interviene en el proceso de por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de
trascripción del ADN a través de su actividad de una secuencia del ARNr 16S con un rango de
superenrollamiento, durante el que la subunidad β tamaño entre 500-1.500 pb (o de otro tamaño si se
suministra la energía necesaria para la acción analizan otros genes). Con cebadores universales o
catalítica de la subunidad α por hidrólisis de ATP. de amplio espectro complementarios a las regiones
Las reacciones que catalizan incluyen la formación conservadas, se amplificaría teóricamente el gen del
de estructuras anudadas en ADN circular, en cadena ARNr 16S en todas las bacterias. Ninguno de los
sencilla y en doble cadena cerrada. La ADN girasa cebadores utilizados en la actualidad se considera
constituye la principal diana de las quinolonas, totalmente universal, por lo que no se puede realizar
antimicrobianos que se unen al complejo ADN/ADN- una recomendación específica de cebadores que
girasa, inhibiendo la etapa de superenrollamiento garantice la amplificación de todos los procariotas.
negativo previo a la replicación. Sustituciones
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Figura 2. Etapas del proceso de identificación bacteriana mediante secuenciación del ADNr 16S.
Tabla 1. Recomendaciones para la utilización del análisis del ARNr 16S y del gen rpoB en la identificación
bacteriana.
Categoría Recomendaciones
Mínimo:>98,5% similitud
Análisis del ARNr 16S Ideal: 1.300 a 1.500 pb secuenciadas
<1% posiciones ambiguas
Mínimo:>98,5% similitud
Ideal: :>99% similitud
Comparación con la secuencia tipo o cepa de referencia
Criterio para la identificación de especie
que posee estudios de homología de ADN. Para
diferencias <0,5% a la especie más cercana, considerar
otras propiedades (fenotipo)
Morfología de la colonia
Tinción Gram
Análisis retrospectivo de la
Catalasa/Oxidasa
identificación fenotípica
Perfil bioquímico
Requerimientos nutricionales
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Frecuentemente, las comparaciones entre las utilidad en la identificación de especies
diferentes secuencias se muestran mediante los pertenecientes a grupos muy homogéneos.
alineamientos lineales y dendrogramas. Esta opción 3.6.3. Descripción de nuevos patógenos . La
es proporcionada por BLAST, BIBI y otros programas hibridación ADN-ADN se considera el gold standard
como PAUP (http://paup.csit.fsu.edu/) o Phylip en la propuesta de nuevas especies y la definitiva
(http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htm). asignación taxonómica de una cepa. En base a la
En la realización de los dendrogramas se utilizan cinética de reasociación del ADN-ADN se cuantifica
diferentes algoritmos: el método NJ (neighbor- la definición genética de especies cuando existe
O
joining), el método UPGMA (unweighted pair group ≥70% de homología ADN-ADN y ≤ 5 C en la ∆Tm
method with arithmetic averages) y en ocasiones el para la estabilidad de las moléculas del
WPGMA (weighted pair group method with arithmetic heteroduplex. Sin embargo, el elevado tiempo
averages). Los principales agrupamientos se necesario para la realización de la técnica, el trabajo
mantienen si las cepas se hallan muy relacionadas. invertido y su elevado coste hace que cada vez
Si la relación es más débil, la apariencia del menos laboratorios realicen esta técnica. Y así la
dendrograma se modifica según el programa mayoría de los estudios que describen las nuevas
utilizado. Otro factor que afecta a la comparación en especies se basan en las secuencias SSU y otros
el dendrograma es la selección del outgroup (será datos polifásicos.
una cepa relacionada pero fuera del grupo Ningún otro gen como el ARNr 16S ha mostrado
comparado, frente a la cual se realiza la primera su amplia aplicabilidad en todos los grupos
comparación). Si el outgroup no es adecuado, las taxonómicos. Si el objetivo a alcanzar es la
diferencias entre los grupos del dendrograma se identificación de una bacteria desconocida sin existir
pueden minimizar. conocimiento previo, el ARNr 16S es la mejor
En muchos de los análisis filogenéticos elección. El análisis del ARNr 16S constituye el eje
realizados se observa, que los árboles realizados principal sobre el que se estructuran las últimas
con las secuencias del rpoB son más robustos que ediciones del libro de referencia en taxonomía
los obtenidos con las secuencias del ARNr 16S bacteriana Bergey´s Manual of Systematic
(menores valores de bootstraps), permitiendo Bacteriology. Muchas de las nuevas especies de
identificar diferentes clusters en los géneros micobacterias (>60) de las 148 existentes han sido
Mycobacterium, Acinetobacter y otros. descritas gracias a la utilización de este gen y otros
adicionales, y ha reasignado en nuevos grupos a las
3.6. INDICACIONES DE LA IDENTIFICACIÓN micobacterias de crecimiento lento y rápido.
MOLECULAR Para la descripción de una nueva especie, se
En la práctica de la microbiología clínica se producen recomienda la presencia de diferencias fenotípicas
una serie de circunstancias en las que es útil la claras y en la secuencia diferencias de >1 pb/100
identificación bacteriana mediante métodos bases. Si estas diferencias son >5%, se podría
moleculares. Entre ellas están la dificultad en el considerar la existencia de un nuevo género. Se
aislamiento, el crecimiento lento, la baja actividad en estima que entre un 10%-20% de los aislamientos no
las pruebas bioquímicas, ausencia o baja efectividad coinciden con los microorganismos descritos y que
de técnicas serológicas, etc. Estas situaciones y la puede tratarse de un género o especie nueva, pero
necesidad de obtener resultados reproducibles e en cepas obtenidas en la práctica clínica esta
intercambiables entre laboratorios confieren a las frecuencia es muy inferior.
técnicas moleculares, y en especial al ARNr 16S y al La creciente relevancia del análisis del rpoB se
rpoB, un gran protagonismo. manifiesta en dos situaciones: 1) el contenido
3.6.1. Identificación de cepas con escasa bacteriano GC puede estimarse matemáticamente
descripción, con baja frecuencia de aislamiento, por el contenido GC del gen rpoB y 2) la similitud que
o fenotípicamente atípicas. En estas circunstancias presentan las secuencias rpoB de dos especies
la práctica clínica se ve beneficiada por la bacterianas se correlaciona de forma muy
identificación mediante ARNr 16S, aventajando en significativa con sus correspondientes valores de
rapidez y exactitud a una amplia variedad de hibridación ADN-ADN (DDH) y con su identidad
sistemas como los perfiles de ácidos grasos media en nucleótidos (ANI).
celulares, la utilización de fuentes de carbono y otras 3.6.4. Identificación de bacterias difíciles de
identificaciones convencionales. cultivar. La utilización de cebadores universales
3.6.2. Identificación de cepas de difícil para el ARNr 16S en la muestra clínica es un paso
identificación fenotípica o de crecimiento que permite aumentar la concentración de ADN en
fastidioso. Tal es el caso de la dificultad para bacterias difíciles de cultivar o con complejos
diferenciar fenotípicamente las especies de Nocardia requerimientos de cultivo, secuenciando después el
y de Mycobacterium. Sin embargo, esta identificación amplicón, y constituye una estrategia eficiente si se
no es completa para algunas especies de detecta un solo microorganismo. De esta forma se ha
micobacterias (Mycobacterium tuberculosis y otras podido constatar la presencia de Bartonella quintana
micobacterias del grupo tuberculosis; M. chelonae y y Coxiella burnetii como principales agentes
M. abcessus; M. avium y M. paratuberculosis), por lo etiológicos en endocarditis con cultivo negativo. En el
que entre otros genes se recurre al rpoB de gran caso de que la muestra posea un origen no estéril o
proceda del medio ambiente, esta estrategia no es
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eficiente. También es útil cuando existe tratamiento algunas subespecies de Streptococcus y mucho
antimicrobiano y su cultivo es negativo. En menores que para muchas especies de Clostridium.
situaciones de adherencia, diversidad o En el caso de discrepancias entre el fenotipo y el
microorganismos desconocidos, el análisis del ARNr genotipo de una cepa, ambos se deben estudiar de
16S, continúa siendo útil, como sucede en nuevo. Confirmados los resultados, se considera que
infecciones periodontales y biofilms, donde se el genotipo se impone sobre el fenotipo.
combina el cebador directo universal y el reverso 3.7.3. Baja resolución en la identificación
especifico para espiroquetas. En el estudio de estas mediante ARNr 16S
comunidades bacterianas, el rpoB también puede En ocasiones el ARNr 16S presenta una baja
desempeñar un importante papel al presentarse en capacidad de discriminación para algunos géneros y
monocopia frente a la heterogeneidad en las copias especies debido a una reciente divergencia, y es
del ARNr 16S, obteniéndose menor ambigüedad en necesario complementar la identificación con el
la secuencia del rpoB. estudio de otros genes o con pruebas fenotípicas
(Tabla 2). Así sucede con diferentes especies de los
3.7. DESVENTAJAS DE LA IDENTIFICACIÓN géneros Bacillus (B. cereus y B. thuringiensis; B.
MOLECULAR globisporus y B. psychrophilus), en los géneros
Distintas causas originan una incorrecta asignación Brucella, Achromobacter, Strenotrophomonas y
de género y especie cuando se realiza una Actinomyces, en el complejo Acinetobacter
identificación mediante el análisis de la secuencia y baumannii-A. calcoaceticus, en las micobacterias de
su alineamiento con otras secuencias. crecimiento rápido, y en la familia
3.7.1. Calidad disminuida de las secuencias Enterobacteriaceae (especialmente en Enterobacter
depositadas en la base de datos y errónea y Pantoea). Situación opuesta se produce por la
asignación de especies. En la identificación heterogeneidad intragenómica en el ARNr 16S en el
molecular existe una fuerte dependencia con la género Aeromonas. En A. veronii existen más de 6
precisión de las secuencias depositadas y la copias de ARNr 16S que difieren en >1,5% entre
idoneidad en la asignación de especie de esas ellas.
cepas. Se produce cuando cepas tipos o de Es necesario recordar que muchas especies o
colecciones certificadas están incorrectamente subespecies que no pueden identificarse mediante el
identificadas. En otras ocasiones, la nomenclatura ARNr 16S, lo son mediante el análisis del rpoB
no ha sido actualizada como en el caso de los 3.7.4. Presencia de electroferogramas o
géneros polifiléticos. También puede suceder que cromatogramas de ADN mixtos. La utilización del
cepas genéticamente diferentes (>2% de ARNr 16S como herramienta de diagnóstico está
variabilidad) estén incluidas en la misma especie, o limitada a infecciones monobacterianas ya que en
que haya una presencia elevada de un número de las polimicrobianas se obtendría un electroferograma
indeterminaciones, o la incorrecta asignación de mixto. En estas situaciones, con frecuencia, se haya
especie por falta de pruebas fenotípicas o errores. implicada una bacteria anaerobia y la concordancia
Gran parte de estos errores podrían minimizarse entre cultivo y secuenciación es baja. Se han
utilizando sistemas de revisión, tal como realizan descrito diferentes estrategias para resolver esta
bases de datos como el RINDOM o el MicroSeq. circunstancia:
3.7.2. Ausencia o baja correlación entre la - electroforesis en gel en gradiente
identificación genotípica y fenotípica. En desnaturalizante ó “denaturing gradient gel
ocasiones surgen dudas respecto a la correlación electrophoresis” (DGGE);
entre las identificaciones fenotípicas y genotípicas, - amplificaciones independientes para
dificultando la asignación de especie mediante el grampositivos y para gramnegativos;
ARNr 16S. Esto sucede cuando se encuentran - pirosecuenciación;
genotipos idénticos o similares y diferentes fenotipos. - utilización de un algoritmo en el programa
Así ha sucedido con M. tuberculosis y M. bovis o M. informático RipSeq (iSentio) que separa las
africanum; Bordetella pertussis con B. parapertussis señales ambiguas de los cromatogramas mixtos.
y B. bronchiseptica; con las diferentes especies de La identificación bacteriana proporcionada por el
Brucella, etc. análisis del ARNr 16S es más certera, sólida y
En otras situaciones, existen especies distintas reproducible que los análisis fenotípicos, resolviendo
con diferencias fenotípicas pero una gran homología aproximadamente el 90% de las identificaciones. Sin
en las secuencias del ARNr 16S como ocurre con embargo, no constituye una herramienta infalible. La
Escherichia coli y Shigella dysenteriae o S. elaboración de recomendaciones en su análisis
pneumoniae y S. mitis. Por el contrario, se dan casos según los géneros y especies a identificar, las bases
en los que los microorganismos presentan de datos con mayor calidad de las secuencias
secuencias con un elevado número de diferencias y depositadas, la aplicación complementaria o en
sin embargo, pertenecen a la misma especie o sustitución de otros genes housekeeping como
genotipo (Clostridium tetani y C. innocuum). dianas, proporcionará en un futuro inmediato
Estas distintas consideraciones se ponen plataformas más eficientes en la identificación
claramente de manifiesto cuando se observa que las molecular bacteriana.
diferencias genéticas en el ARNr 16S de los géneros
de Enterobacteriaceae son menores que para
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Tabla 2. Ejemplos de géneros y especies bacterianas con menor resolución en la identificación por ARNr 16S y
propuestas de genes alternativos
Especialmente el análisis del rpoB va a contribuir interfiere sólo ligeramente en la detección del
a una identificación bacteriana más eficiente (género, patógeno.
especie, subespecie), detectando y reclasificando De forma adicional han surgido plataformas de
nuevos organismos, y mejorando la resolución identificación de patógenos que modifican o
filogenética del ARNr 16S. sustituyen la secuenciación tradicional, como sucede
con la pirosecuenciación o la espectrofotometría de
3.8. NUEVAS TECNOLOGÍAS EN LA masas, respectivamente. Mediante plataformas de
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR MICROBIANA amplificación-pirosecuenciación se realiza la
Recientemente, la aparición de la técnica de PCR en identificación bacteriana o fúngica mediante PCR de
multiplex acoplada a un análisis de la temperatura de 3 regiones variables del ARNr 16S (V1-V3, o V1, V2
melting (SeptiFast, Roche Diagnostics, Manheim, y V6) y del ARNr 18S, respectivamente, en
Germany) identifica de forma temprana a algunos hemocultivos (BlackLight Sepsis Kit, BlackBio,
agentes etiológicos bacterianos y fúngicos de la Madrid, Spain; Pyromark ID, Quiagen GmbH, Hilden,
sepsis a partir de muestra directa. La región Germany). Se obtienen 3 amplicones con un tamaño
amplificada es el espacio intergénico del 16S-23S inferior a 500 pb, susceptibles de determinar su
ARNr bacteriano o del 18S-5,8S fúngico. La no composición en nucleótidos mediante la emisión de
detección de todos los potenciales patógenos y la luz por la liberación de pirofosfatos (subproductos de
necesidad de cultivo para la determinación del perfil la extensión por polimerización de la cadena de
de sensibilidad a antimicrobianos, no permite a esta ADN). Sucesivas innovaciones de este método en la
técnica sustituir la realización de los hemocultivos. amplificación respecto al tipo de muestra clínica y a
Otras desventajas añadidas al restringido espectro la determinación de diferentes fragmentos génicos
de especies detectadas son: falsos positivos con correspondientes a los distintos factores de
bacteremias o fungemias transitorias, fuerte patogenicidad, resistencia, etc., aumentan las
dependencia de la concentración bacteriana, alto posibilidades de esta plataforma.
coste y carga de trabajo. En el caso de existir Las plataformas de amplificación-
discrepancias entre la detección por ambos métodos espectrofotometría de masas (PCR/ESI-MS)
diagnósticos, se proponen algoritmos de decisión permiten la detección universal de uno o varios
útiles. Una ventaja importante de esta técnica es que patógenos (bacterias, virus, hongos y protozoos)
la administración de antimicrobianos al paciente presentes en una amplia variedad de muestras
(ambientales, clínicas, alimentarias o en cultivos) del
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siguiente modo. Tras extracción y una PCR de utilice para fragmentar la proteína se obtienen
amplificación con parejas de cebadores de amplio diferentes huellas peptídicas. Estas son
espectro, se obtienen uno o varios productos de características de cada proteína. Actualmente
PCR que corresponden a regiones genómicas de hay numerosas bases de datos que recogen las
identificación de los distintos dominios microbianos huellas peptídicas de multitud de proteínas
en relación con la complejidad de la muestra conocidas. Estas bases de datos se pueden
problema. Estos productos se desalan y son rastrear usando programas bioinformáticos para
ionizados y aerosolizados hacia un buscar la huella peptídica que corresponda con
espectrofotómetro de masas. Se generan señales la de aquella proteína que se esté estudiando y
espectrales que son procesadas para determinar su por tanto poder identificarla.
masa y su composición en bases. Estos resultados - Técnicas que se usan para estudiar interacciones
son considerados con los iniciadores de entre proteínas, como los sistemas “yeast two
amplificación utilizados en la estrategia T.I.G.E.R hybrids” de alto rendimiento o la técnica “Phage
“Triangulation Identification for the Genetic Display”. Esta última permite averiguar con qué
Evaluation of Risks” (Ibis T5000, Alcimed, Paris, proteínas interacciona una proteína problema o
France) entrando la información en una base de sonda. Esta técnica consiste en la expresión en
datos genómica que asigna la determinación de la superficie de un fago de las proteínas que se
especie. Ventajas indicadas son: no requieren cultivo quieren analizar.
o conocer con anticipación el producto analizado; es En la actualidad el reto principal de la proteómica
eficiente en muestras polimicrobianas; en el caso de es su automatización y la integración de las
nuevos patógenos no caracterizados permite la tecnologías mencionadas. Este es un reto cuya
asignación a géneros o familias bacterianas o víricas; respuesta saldrá, principalmente de la bioinformática.
y también permite realizar la detección de genes de De entre todas las herramientas que se emplean en
virulencia, de resistencia y la tipificación. la proteómica, en este documento se va a abordar
Recientemente ha aparecido una nueva únicamente la espectrometría de masas, con
plataforma comercial, conocida como PLEX-ID especial mención a las técnicas empleadas para la
(Abbott), basada en esta metodología, que permite el identificación de microorganismos.
análisis directo e identificación de microorganismos
sobre muestras, incluidos los hemocultivos (BAC 4.2. FUNDAMENTO Y VARIANTES TÉCNICAS
Spectrum Assay). Ha demostrado buenos resultados 4.2.1. Espectrometría de masas. La espectrometría
incluso en bacteriemias polimicrobianas, con de masas es una técnica analítica que permite
independencia de que sean microorganismos analizar con gran precisión la composición de
aerobios, anaerobios, cultivables, lentos crecedores diferentes elementos químicos al permitir la medición
o incultivables. Destaca como aspecto importante de iones derivados de moléculas separándolos en
que podría incluso utilizarse como un método función de su relación masa/carga (m/z). Un ión es
cuantitativo. un átomo o molécula cargada eléctricamente debido
al exceso o falta de electrones. Dado que la mayoría
4. MÉTODOS PROTEÓMICOS DE de los iones formados poseen una sola carga, la
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA relación “m/z” es equivalente a “m”.
4.1. INTRODUCCIÓN En el espectrómetro de masas se produce la
La proteómica es el estudio y caracterización del separación de las especies iónicas de la muestra, en
conjunto de proteínas expresadas por un genoma función de su masa. El espectro de masas de cada
(proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el compuesto se denomina “huella química” y es una
estudio de este conjunto de proteínas y las más representación gráfica de los fragmentos obtenidos,
usadas se basan en la electroforesis y en la por orden creciente de masa frente a su abundancia
espectrometría de masas. Dependiendo del objetivo relativa.
del estudio se pueden agrupar las técnicas de 4.2.2. Componentes del espectrómetro de masas.
proteómica en los siguientes grupos: Los tres componentes básicos de un espectrómetro
- Técnicas empleadas para analizar globalmente el de masas son los siguientes:
proteoma y separar sus proteínas. Entre ellas - Fuente de ionización. Es el elemento del
destacan la electroforesis bidimensional, DIGE espectrómetro que ioniza el material que va ser
(electroforesis diferencial en gel), ICAT (marcaje analizado. Las técnicas para la ionización, el
isotópico diferencial) y MudPIT (tecnología de proceso físico o químico mediante el cual se
identificación de proteínas multidimensional). producen iones, han sido determinantes para
- Técnicas usadas para analizar individualmente establecer qué tipos de muestras se pueden
las proteínas. Con este objetivo se utilizan analizar por espectrometría de masas. La
distintos tipos de espectrometría de masas. Con ionización del electrón (EI) y la ionización
ellas se obtiene la huella peptídica que es el molecular se utilizan para los gases y los vapores.
conjunto de fragmentos peptídicos que se Dos técnicas, usadas a menudo con líquidos y
obtienen tras tratar una proteína concreta con muestras biológicas sólidas, incluyen la ionización
una proteasa determinada. Las proteasas son por electroespray (ESI desarrollado por Fenn) y la
enzimas que rompen los enlaces peptídicos de desorción/ionización por láser asistida por matriz
las proteínas. Dependiendo del enzima que se (MALDI desarrollado por Karas y Hillenkamp).
19
- Analizador de masas. Utiliza un campo eléctrico carbono, compuestos glicoconjugados, etc.) y
o magnético para acelerar los iones y separarlos polímeros sintéticos.
en función de su relación masa/carga (m/z). También existen actualmente otros métodos
Actualmente existen diferentes métodos para como ESI (ElectroSpray Ionization Mass
"filtrar" los iones respecto a su relación Spectrometry), SELDI (Surface Enhanced Laser
masa/carga, como el cuadrupolo o como el Desorption Ionization), DIOS (Direct Ionisation on
analizador de tiempo-de-vuelo (time of flight, Silicon) y además acoplamiento MS/MS (Mass
TOF) mediante el cual la determinación de la Spectrometry/ Mass Spectrometry).
masa en una región de alto vacío se realiza 4.2.4. Espectrometría de masas MALDI-TOF. La
mediante una medida muy precisa del período de espectrometría de masas MALDI-TOF se denomina
tiempo desde la aceleración de los iones en la MALDI por sus siglas en inglés matrix-assisted laser
fuente hasta que impactan con el detector. desorption/ionization (desorción/ionización por láser
- Detector. Los iones que llegan al detector asistida por matriz) y TOF por el analizador time of
producen una señal eléctrica que es procesada, flight (tiempo de vuelo) que se integra típicamente
ampliada y enviada a un ordenador. El registro con fuentes de ionización maldi.
obtenido es el espectro de masas o “huella Destacan como más importantes las siguientes
química”. Típicamente, se utiliza un cierto tipo de características:
multiplicador de electrones (electromultiplicador). - Para obtener iones de forma adecuada es
4.2.3. Variantes de la espectrometría de masas. necesario que la muestra este embebida en
La espectrometría de masas es una técnica analítica una matriz orgánica
ideada a principios del siglo XX. Durante muchos - Como fuente de ionización emplea un laser. Se
años, las aplicaciones de esta técnica se vieron generan iones tras bombardear con fotones
limitadas a compuestos (analitos) de bajo peso (laser) la muestra. Se producen rayos UV de
molecular, termoestables y fácilmente volatilizables. 337nm.
En la década de los 70 se describen los primeros - La separación de los iones se produce según el
experimentos con éxito donde las moléculas “tiempo de vuelo”.
termolábiles eran transformadas sin descomposición - El espectro se genera mayoritariamente por
alguna y en un único paso a iones gaseosos. Estas iones univalentes.
técnicas de volatilización/ionización se denominan - El tiempo de obtención del espectro es aprox. de
-12
“técnicas de desorción”. En estos casos al analito no un minuto para 10 g de un compuesto de
volátil convenientemente depositado sobre una masa/carga (m/z) de 1.000 Daltons (Figura 3).
superficie metálica en alto vacío, es bombardeado
con un haz de átomos neutros acelerados (FAB), o Figura 3. Representación de un sistema MALDI-TOF
con un haz de átomos iónicos acelerados (LSIMS), o
es expuesto a la acción de un fuerte campo eléctrico
que induce su volatilización/ionización por efecto
túnel (FD), o es expuesto a la acción de un plasma
(PD) o a la acción de un láser (LD). Si bien estos
métodos de ionización ampliaron el uso de la técnica
a moléculas termolábiles y a macromoléculas,
prácticamente su límite de aplicación es para analitos
de peso molecular por debajo de 700-800 Da.
La introducción de nuevos métodos de ionización,
que no requieren de la volatilización previa de la
muestra, fue el elemento principal que permitió la
extensión de la espectrometría de masas al campo El proceso se puede resumir en los siguientes pasos:
de las biomoléculas. Fue a finales de la década de - La muestra se mezcla con una matriz en exceso
los 80 tras el éxito conseguido por Tanaka (Premio sobre una superficie de metal (tarjeta metálica),
Nobel de Química 2002), mediante el uso de de tal forma que ambas cocristalizan cuando se
matrices metálicas (soft laser desorption, SLD) evapora el solvente.
cuando Karas y Hillenkamp simultáneamente - Se irradia esta preparación con un láser, en
describen la detección del ion gaseoso intacto de condiciones de alto vacío. La matriz absorbe
proteínas con el uso de las matrices orgánicas esta energía y la transfiere a la muestra,
fotosensibles. Dio lugar al desarrollo del método de provocando su ionización.
volatilización/ionización suave, que hoy se conoce - El área irradiada, de unas pocas micras, se
como “matrix assisted laser desorption/ionization calienta dando lugar a la desorción de los iones
mass spectrometry” MALDI. de fase sólida a fase gaseosa.
Desde su implementación práctica, el método de - La muestra ionizada y vaporizada crea una
ionización MALDI se ha usado con éxito para el densa nube de gas entre dos electrodos. El
análisis por espectrometría de masas de campo eléctrico formado se emplea para
biomacromoléculas (ácidos nucleicos, nucleótidos, acelerar la muestra hasta el detector.
nucleósidos, proteínas, péptidos, lípidos, hidratos de
20
- Los iones más ligeros experimentan una mayor - Es importante emplear el mismo protocolo
aceleración, viajan más rápido y llegan primero estandarizado para obtener los perfiles y
al detector. poderlos comparar con una base de datos
- En el detector se genera el perfil o huella previa.
química específico de esa muestra. A continuación se describen con más detalle tres
En este tipo de espectrometría es de suma ejemplos de sistemas comerciales que emplean
importancia la matriz ya que funciona como un espectrometría de masas MALDI-TOF para
transmisor, transfiriendo la energía necesaria para la identificación microbiana: MicrobeLynx™ de Waters
ionización, del láser a las moléculas de la muestra. Corporation, MALDI Biotyper™ de Bruker Daltonics y
La mezcla muestra-matriz debe cristalizar de forma AXIMA@SARAMIS™ de Schimadzu & Anagnostec
homogénea para garantizar una resolución óptima (Tabla 3). Cada técnica recomienda sus propios
del espectro. protocolos para la preparación de la muestra y tiene
4.2.5. Aplicaciones de la espectrometria de asociada una base de datos distinta, junto con un
msas. Las técnicas de espectrometría de masas se software para la adquisición de los espectros y
han utilizado y se siguen utilizando para un gran comparación con la base de datos.
número de aplicaciones, como puede ser la medida El primer sistema desarrollado para la
exacta de pesos moleculares, monitorización de identificación bacteriana fue MicrobeLynx System.
reacciones bioquímicas (reacciones enzimáticas, Participaron en su creación la Universidad de
modificaciones químicas, digestión de proteínas), Manchester, la Unidad de la Agencia de Protección
secuenciación de aminoácidos, secuenciación de de la Salud con Servicio de Identificación Molecular y
oligonucleótidos, o determinación de estructura de la empresa Waters Corporation. Apareció como una
proteínas. técnica que precisaba pruebas preliminares ya que
Una aplicación de la espectrometría de masas requería una matriz diferente para microorganismos
MALDI-TOF de gran interés en microbiología es la grampositivos y gramnegativos, conllevaba una
identificación de microorganismos. La identificación mínima preparación de la muestra y un tiempo de
bacteriana basada en el perfil de proteínas obtenido secado (1 h) antes de añadir matriz. Precisaba una
mediante la espectrometría de masas MALDI-TOF lectura mínima de 4 pocillos de la tarjeta por
fue ya propuesta hace varias décadas. Sin embargo, muestra a identificar. La versión comercial empleada
sólo recientemente ha empezado a usarse como un proporcionaba escasa reproducibilidad de la técnica
método rápido y fiable para la identificación ya que existían diferencias bajo distintas condiciones
bacteriana. En un principio se realizaron estudios de cultivo.
parciales sobre su eficacia para la identificación de Los sistemas más extendidos en la actualidad son
determinados microorganismos en condiciones MALDI Biotyper y AXIMA@SARAMIS (Tabla 3).
controladas. Actualmente, cada vez aparecen más Utilizan una técnica rápida y sencilla que no precisa
trabajos que han estudiado su eficacia en la pruebas preliminares, con mínima preparación de la
identificación de aislamientos clínicos de bacterias muestra y lectura e interpretación inmediata. Las
grampositivas y gramnegativas de diversos orígenes bases de datos están en constante actualización con
directamente desde los medios de cultivo habituales más de 3.500 entradas. Realizan la identificación de
y sin condiciones especiales, como método de rutina. bacterias (grampositivas, gramnegativas, anaerobios,
4.2.6. Plataformas comerciales de espectrometría no-fermentadores, micobacterias), levaduras y
de masas MALDI-TOF para identificación hongos. Ambas tienen la posibilidad de incluir
microbiana. Desde la descripción original del nuevas referencias de cepas por el usuario. Permite
sistema, se han desarrollado varios sistemas que el análisis simultáneo de 48 ó 96 muestras en una
son capaces de realizar la identificación de bacterias hora dando los primeros resultados en minutos.
enteras, sin necesidad de largos procedimientos Destaca la reproducibilidad de la técnica. Al basarse
previos (extracción proteínas, digestión, purificación, en la medida de proteínas ribosómicas presentes de
etc.). forma abundante no presenta diferencias en el
Se basan en la detección de proteínas espectro obtenido bajo distintas condiciones de
ribosómicas S y L (2.000 a 20.000 Da). Se asume cultivo. Se pueden usar para diagnóstico clínico por
que el 80-90% de las señales del espectro de la su marcado IVD y CE.
bacteria son proteínas ribosómicas. Las Los dos sistemas presentan un procedimiento
características principales de estos sistemas son las diferente en el análisis del espectro. En el sistema
siguientes: MALDI Biotyper, la base de datos está formada por
- Sin procedimiento previo de extracción. Se utiliza entradas que corresponden al espectro promedio (de
directamente una colonia bacteriana. al menos 24 espectros de alta calidad) de un
- Comparan perfil o huella espectral desconocida microorganismo concreto (genero, especie y cepa).
frente a las de bacterias conocidas. Figuran cepas de varias colecciones ya que la
- Comparación de espectros generados con bases compañía tiene colaboraciones por todo el mundo.
de datos previas. Por el contrario, en el sistema SARAMIS, para la
- Rapidez de la técnica (aprox. 90 generación de un superespectro se necesitan al
microorganismos / hora) menos de 15 a 20 aislados diferentes
- Identificación a nivel de género y especie, en representativos de una especie de diferentes
ocasiones subespecies.
21
localizaciones (hospitales, centros de referencia y
cultivos de cepas de colecciones).
Casa comercial
Waters Corporation Bruker Shimadzu
Software y base de Microbe Lynx System -MMU Maldi Biotyper SARAMIS
datos (Manchester Metropolitan (Bruker Daltonics ) (AnagnosTec GmbH)
University)
Espectrómetro de Micro MX Microflex Bruker Axima
masas
Identificación Bacterias aerobias Bacterias, levaduras Bacterias, levaduras y
/anaerobias y hongos hongos filamentosos
filamentosos
Análisis de espectro Espectro promedio Superespectro
Preparación de la Si No No
muestra Secado de 1 h Secado inmediato Secado inmediato
Matriz Gram(+): solución saturada 3 Solución saturada de 2,5 ácido dihidroxi-
mg/ml de 5-Cl-2-mercapto- ácido α-ciano-4- benzoico disuelto en
benzotizol (CMBT) disuelto hidroxi-cinnamico en una mezcla de
en agua:metanol: acetonitrilo 50% acetonitrilo- agua:etanol:acetonitrilo
(1:1:1) con 0,1% ácido 2,5% ácido (1:1:1) mix o de agua:
fórmico y 0,01M 18-crown-6- trifluoroacético acetonitrilo (1:1) con
éter 0,03% de ácido
Gram(-): el CMBT se trifluoroacético
sustituye por 14 mg/ml de α- Añadir 1 µl
ciano-4-hidroxi-cinnamico Añadir 0,3- 1 µl
(αCHCA)
Rapidez 96 muestras / 1,5 h 96 muestras / 1 h 380 / 5 h
26
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28
DOCUMENTO TÉCNICO
PNT-ID-01
MÉTODOS FENOTÍPICOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Asas desechables
Portas
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
a) Depositar una colonia en un porta, preferiblemente
de un medio sin sangre ( si el medio es agar sangre
no debe tocarse el agar). Para bacterias anaerobias
exponer las colonias al aire 30’ antes de realizar la
prueba.
b) Añadir una gota del reactivo.
c) Lectura en 10-20 segundos (si es necesario, usar
lupa)
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manual de bioseguridad
- Manual de instrucciones del producto
4. MUESTRAS
Colonias bacterianas crecidas en medio de cultivo
sólido
5. REACTIVOS Y MATERIALES
Tiras de papel absorbente con una zona reactiva que
contiene dicloruro de N,N-dimetil-1,4-
fenilendiamonio 0,1µmol;1-naftol 1,0 µmol.
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
Depositar una colonia en la zona reactiva de la tira y
frotar con el asa.
Interpretar el resultado al cabo de 10-30”.
8. RESPONSABILIDADES
Personal técnico: realización de la técnica, control y
conservación de las muestras y reactivos.
Personal facultativo: supervisión de la técnica,
resolución de problemas y consultas. Validación de
resultados.
4. MUESTRAS
Colonias de estreptococos beta-hemolíticas crecidas
en medio de agar sangre o en medio CNA en cultivo
reciente (18-24 h).
Muestra de hemocultivo en el que se observan cocos
grampositivos en cadenas.
5. REACTIVOS Y MATERIALES
Disco de 0,04 U de bacitracina
Pinzas estériles
Asas de plástico desechables
Placas de agar con 5% de sangre de carnero
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
Sembrar en agar con 5% de sangre de carnero y
colocar el disco en el centro con pinzas estériles
presionando para que el disco quede adherido al
agar.
Incubar a 35 ± 2ºC, 5% CO2 18-24h.
PNT-ID-02
MÉTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
2+
1. PROPÓSITO Y ALCANCE - Taq polimerasa (comprobar que el Mg esté
Descripción de la metodología necesaria para el incorporado a la solución tampón). Pueden
2+
análisis del ARNr 16S y de otros genes utilizados como sustituirse los ddNTPs, la taq, el Mg , y el buffer por
diana en la identificación molecular bacteriana. reactivos comerciales que incluyen a todos estos
TM
Este procedimiento, basado en la reacción en cadena reactivos, como por ejemplo, el PureTaq Ready-
de la polimerasa (PCR) y secuenciación, es aplicable a la To-Go PCR Beads (Amersham BioSciences)
mayoría de aislamientos bacterianos de origen clínico. - Cebadores (directo y reverso)
Sin embargo, puede suceder que según la especie - Agarosa
bacteriana o el aislamiento en cuestión, sea necesario - Bromuro de etidio, concentración 0,5 mg/L.
TM
realizar modificaciones. Alternativas menos tóxicas [GelRed Nucleic Acid
Gel Stain, a concentración 0,3ml/L (Biotium)]
2. FUNDAMENTO - Marcador de peso molecular X (0,07-12,2 kpb) y/o de
La técnica de identificación mediante el ARNr 16S se 100 bp
basa en la utilización de cebadores universales - EDTA
diseñados en diferentes zonas conservadas en - Azul de bromofenol (necesario para el aumento de la
bacterias, que permiten amplificar regiones variables densidad en la carga del producto de PCR en el gel
características de género y de especie. En ocasiones de electroforesis e indicador de la posición del frente)
para el estudio del ARNr 16S o de otros genes útiles en - Lisozima
la identificación a nivel de género, especie, subespecie, - Proteinasa K
genovariedades, serotipos, etc, es necesaria la - ARNasa
utilización de cebadores específicos. Tras la obtención - SDS
de un único producto de PCR (amplicón) se realizará la - Cloruro de magnesio
secuenciación con idénticos o distintos cebadores de la - Cloruro de potasio
amplificación. - Ácido acético glacial
La comparación de las secuencias obtenidas con las - Fenol
disponibles en diferentes bases de datos y su - Cloroformo
interpretación, permite la identificar el microorganismo. - Cloroformo-alcohol isoamilíco
- Acetato amónico
El procedimiento consta de las siguientes etapas: - Etanol absoluto
- Extracción del ADN cromosómico - Sistema comercializado de extracción de ADN
- Amplificación del ARNr 16S (rrs) u otros genes diana cromosómico. [QIAamp DNA Mini Kit, (Quiagen)] o
- Reacción de secuenciación similares
- Análisis de las secuencias - Sistema comercializado de purificación del producto
de PCR o de la banda de agarosa. [GFX PCR DNA
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA and gel band purification kit (Amersham
- Manual de bioseguridad. Biosciences)], [ExoSAP-IT (usb, Affymetrix)] o
- Manuales de funcionamiento correspondientes a los similares
aparatos utilizados en este procedimiento. - Reactivos de secuenciación, BigDye Terminator
- Bibliografía correspondiente a cada gen diana para la (Applied Biosystems), o el correspondiente al
identificación molecular y al género/especie bacteriano/a secuenciador utilizado.
a estudiar.
6. APARATOS Y MATERIALES
4. MUESTRAS 6.1. APARATOS
Cultivo bacteriano puro crecido en medios de agar - Termociclador de tubos eppendorf de 0,5 o 0,2 ml
sangre, en medios generales o en medios - Vortex
enriquecidos. Es necesaria la ausencia de - Microcentrífuga para tubos eppendorf
contaminación. - Balanza electrónica
En las ocasiones que se requiera, esta técnica puede - Fuente y cubeta de electroforesis. Molde, peine
aplicarse sobre muestra directa sin realizar cultivo - Analizador de imágenes o en su defecto,
previo. Según la universalidad o especificidad de los transiluminador de luz ultravioleta y cámara de
cebadores utilizados, será necesario o no proceder a fotos
partir de muestra clínica con origen estéril o con la - Termobloque o baño de ebullición
presencia de una infección monomicrobiana. - Secuenciador ABI Prism 377(Perkin-Elmer, Applied
Biosystems Division, Foster City, CA) o similar
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS 6.2. MATERIALES
- Medio de cultivo de agar sangre o medios sintéticos - Asas bacteriológicas
de crecimiento - Tubos eppendorf de 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml
- Medio de cultivo líquido Luria-Bertani (LB) - Pipetas de volumen variable y puntas estériles
- Agua destilada estéril - Gradillas o soporte de tubos eppendorf
- Dinucleótidos (ddNTPs) - Guantes de nitrilo
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Concentración
Cantidad para 25 µL de
Reactivos comercial más Concentración final
reacción
frecuente
Agua destilada o –
(16,5 – X) µL
1
–
desionizada estéril
Buffer estándar de PCR 10 mM Tris-HCl + 50 mM
10X 2,5 µL
KCl
MgCl2 15 mM 2,5 µL 1,5 mM
Mezcla de dNTPs (dATP, 200 µM de cada dNTP
10 mM 0,5 µL
dCTP, dGTP, dTTP)
2
Cebador 5 µM 1 µL 100 nM
3
ADN Taq polimerasa 5 u/µL 1 µL 5 unidades
Volumen Final – (25 – X) µL –
X = µL de ADN molde; Secuencias en las tablas 2 y 3; Una unidad se define como la cantidad de
1 2 3
enzima que es capaz de incorporar 10 nmol de dNTP en un material acido-insoluble en 30 minutos a 75°C.
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Gen / Código
Secuencia 5’-3’ Referencia
cebador
ARNr 16S
536F (A,S) CAGCAGCCGCGGTAATAC
Fenollar y cols,
Rp2 (A,S) ACGGCTACCTTGTTACGACTT
2006
M13d (A, S) GTAAAACGACGGCCAG
M13r (A, s) CAGGAAACAGCTATGAC
ARNr 16S
5F(A,S) TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTC Simmon y cols,
1194R (A,S) ACGTCATCCCCACCTTCCTC 2006
810R (A, S) GGCGTGGACTTCCAGGGTATCT
ARNr 16S
Bosshard y cols,
BAK11w (A,S) AGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG
2004
BAK2 (A) GGACTAC(C/T/A)AGGGTATCTAAT
ARNr 16S
16SFa (A,S) GCTCAGATTGAACGCTGG Harris y cols,
16SFb (A,S) GCTCAGGAYGAACGCTGG 2003
16SR (A,S) TACTGCTGCCTCCCGTA
ARNr 16S
E8F (A,S) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
E9F (A,S) GAGTTTGATCCTGGCTCAG
E334F (A,S) CCAGACTCCTACGGGAGGCAGC
E341F (A, S) CCTACGGGIGGCIGCA
Baker y cols,
E786F (A, S) GATTAGATACCCTGGTAG
2003
E533R (A, S) TIACCGIIICTICTGGCAC
E926R (A, S) CCGICIATTIITTTIAGTTT
E939R (A, S) CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC
E1115R (A, S) AGGGTTGCGCTCGTTG
E1541R (A, S) AAGGAGGTGATCCANCCRCA
ARNr 16S
Bosshard y cols,
8s_20 (A,S) AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
2002
536a_18 (A,S) GTATTCCGCGGCTGCTG
ARN 16S
Drancourt y
fD1 (A,S) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
cols, 2000
Rp2 (A,S) ACGGCTACCTTGTTACGACTT
F:iniciador; R: inverso; (A,S): amplificación, secuenciación;
R=A/G; W=A/T; S=C/G; Y=C/T; K=G/T; N=A/G/C/T.
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7.2.2. Purificación de los productos amplificados: Tabla 5. Secuenciación del producto de PCR
Aplicación de sistemas comercializados de purificación
del producto de PCR o de la banda de agarosa [GFX Temperatura Tiempo Nº de
PCR DNA and gel band purification kit (Amersham ciclos
Biosciences)], [ExoSAP-IT (usb, Affymetrix)] o similares. Desnaturalización 94ºC 3 min. 1
inicial
7.3. SECUENCIACIÓN DEL ARNr 16S (rrs) Y OTROS Desnaturalización 96ºC 10 seg.
GENES DIANA Secuenciación 55ºC 4min 5 25
Las condiciones de secuenciación y amplificación se seg
optimizarán en cada laboratorio para cada juego de Conservación 4ºC indefinido 1
cebadores. Para la secuenciación de cada gen diana, se
prepara la pre-mezcla de secuenciación con el primer Finalizada la reacción de secuenciación se procederá
directo y se prepara la pre-mezcla de secuenciación con según las indicaciones correspondientes del fabricante
el primer reverso. Los componentes de la pre-mezcla de del secuenciador automático.
la PCR de secuenciación se indican en tabla 4.
7.4. ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS
Tabla 4. Pre-mezcla de componentes de la PCR de Se edita el electroferograma o cromatograma de la
secuenciación secuencia obtenida, y se analiza visualmente la
presencia de ruido, ambigüedades, y limpieza de las
Concentración Cantidad para señales. Optimizada la secuencia, a continuación se
Reactivos comercial más 10µµL de alinea con otras secuencias depositadas en bases de
frecuente reacción datos de acceso público: GenBank
Agua destilada o – (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), le BIBI
(6,5 – X) µL
1
desionizada estéril (http://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/), Ribosomal Database
Buffer mix de Project European Molecular Biology Laboratory
1 µL (http://www.ebi.ac.uk/embl/), Smart Gene IDNS (http:
secuenciación
Mix de //www. smartgene.ch), Ribosomal Differentiation of
1,5 µL Medical Microorganisms (RIDOM) (http://www.
secuenciación
2
Cebador 5 µM 1 µL ridom.com/), Ribosomal Data-base Project (RDP-II)
Volumen Final – 10 µL (http://rdp.cme.msu.edu/html/); o privado como el
MicroSeq.
X = µL de PCR molde, 2-3 µL según intensidad de
1
2
ADN. Secuencias en la tabla 2.
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MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE
MASAS