Sesión N°1:MICROBIOLOGÍA DE

LAS AGUAS RESIDUALES

Blga. Erika Cadillo La Torre

alecadillo@gmail.com )
 INTRODUCCIÓN

• Microorganismo patógeno =
causante de enfermedad.
• Patógenos en agua residual →
vía de contaminación fecal
(transmisión de enfermedades
por ruta oral – heces).
• Algunos persisten luego del
tratamiento, contaminando
cuerpos receptores o productos
alimenticios (reúso).
• Parámetros microbiológicos a
medir dependerán del uso que
se le dé al agua tratada
(objetivos de tratamiento).
PRINCIPALES PATÓGENOS

BACTERIAS VIRUS

PROTOZOARIOS HELMINTOS
 BACTERIAS

• Persistencia en el agua: corto – moderado.

• Poco resistentes a desinfección por cloro.
• Patógenas: Salmonella, V. cholerae, E. coli, Yersinia
enterocolitica, Shigella.
• Interés clínico:
– Infecciones oportunistas en el tracto respiratorio.
– Bacteremia
– Infecciones de piel y tejidos blandos
– Enfermedad diarreica aguda.
 VIRUS
• Intracelulares, dependen de ello para su replicación.
• Evacuación en heces en el orden de 1012 virus/g
heces
• Altamente persistentes en agua y medianamente
resistentes a desinfección por cloro.
• Algunos no generan inmunidad (rotavirus, Norwalk).

Virus de Hepatitis A
Fam: Piconaviridae
 PROTOZOOS

• Unicelulares. Dos formas de vida: vegetativa

(trofozoito) y resistente (quiste).
• Quistes son resistentes a inactivación por sistemas
de tratamiento.
• Causantes de brotes infecciosos transmitidos por
agua.
• Giardia lamblia, Entamoeba histolitica, Balantidium
coli y Criptosporidium parvum.
 HELMINTOS

• Huevos altamente persistentes en el medio

ambiente.
• Indicador de comportamiento: Ascaris
lumbricoides.
– Persistente por meses, no se multiplica.
– Fácil de identificar.
– Índice de parasitismo mundial muy alto.
– Riesgo de transmisión alto.
 VÍAS DE TRANSMISIÓN Y EJEMPLOS DE
PATÓGENOS RELACIONADOS CON EL AGUA
Inhalación y
Ingestión Contacto
aspiración
(bebida) (baño)
(aerosoles)

Dérmica (sobre todo

si la piel está
Gastrointestinal Respiratoria
escoriada), mucosas,
heridas, ojos.

Virus Protozoos y
Bacterias Legionella
Acanthamoeba spp.
Campylobacter
Adenovirus helmintos Aeromonas spp.
Astrovirus Cryptosporidium pneumophila
spp. Burkholderia pseudomallei
Enterovirus parvum Micobacterias (no
E. Coli Micobacterias (no
V. Hep – A Entamoeba tuberculosas)
Salmonella spp. tuberculosas)
V. Hep – E histolytica Naegleria fowleri
Shigella spp. Leptospira spp.*
Norovirus Giardia lamblia Diversas
Vibrio cholerae Pseudomonas aeruginosa
Rotavirus Ascaris infecciones víricas
Yersinia spp. Schistosoma mansoni.*
Sapovirus lumbricoides
*Principalmente por contacto con aguas superficiales muy contaminadas
USO DE MICROORGANISMOS INDICADORES

• Número de patógenos relativamente pequeño.

• Muchos tipos de patógenos, técnicas de
aislamiento específicas.
• Indicador.- habitante del intestino en grandes
números, excretado en las heces.
• Presencia en elevado número:
– Evidencia contaminación fecal.
– Riesgo de que patógenos estén presentes.
– Contaminación reciente y/o severa.
CARACTERÍSTICAS DE UN INDICADOR FECAL

• Aplicable a cualquier tipo de agua.

• Estar siempre presente cuando hay una fuente
de contaminación fecal.
• Estar ausentes en aguas limpias y seguras.
• Debe existir un método de ensayo para su
cuantificación.
• Ser inocuo a humanos y otros animales.
 COLIFORMES Algunas son Indicadoras de
TOTALES intestinales calidad del agua

Indican posible
COLIFORMES La mayoría son presencia de
TERMOTOLERANTES intestinales contaminación
fecal

Evidencia
Estrictamente directa de
ESCHERICHIA COLI
intestinales contaminación
fecal
 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

• Procedimientos de laboratorio que se efectúan a

una muestra de agua para evaluar la presencia o
ausencia, tipo y cantidad de microorganismos.
• Coliformes:
– Filtración en membrana
– Número más probable
(Tubos múltiples)
 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO

• Microorganismos pueden
ser aislados y propagados
por diferentes métodos,
según el propósito y tipo
de microorganismo que
se deseen aislar.
• Se usan medios de cultivo adecuadamente
seleccionados, preparados y almacenados.
• El éxito de dicho trabajo dependerá de la adecuada
elección y buen uso de los métodos de esterilización y
técnicas asépticas.
JUSTIFICACIÓN DEL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
JUSTIFICACIÓN DEL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO
JUSTIFICACIÓN – RIESGOS ASOCIADOS A LA SALUD

Fuente: World Health Organization. Guidelines for the safe use of wastewater, excreta and
greywater. Vol 2. Wastewater use in agriculture. WHO, Ginebra: WHO; 2006b.
 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

• Leer las instrucciones de las etiquetas de los medios de cultivo

y seguir las instrucciones.
• Mezcla o hidratados en recipientes limpios, sin detergentes,
de volumen doble a la cantidad que se vaya a preparar.
• Usar agua destilada o desmineralizada.
• Calcular la cantidad total (determinar la cantidad de los
elementos individuales o pesar la cantidad del medio
deshidratado).
• Mezclar con una parte del volumen total de agua, agitar, luego
agregar el resto de agua para enjuagar de las paredes del
recipiente.
 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

• Esterilizar en autoclave
(instrucciones comerciales).
• Los recipientes debe tener
suficiente tamaño y los
cierres de rosca deben estar
flojos para permitir el flujo
de vapor durante el
calentamiento.
• Una vez estéril, debe ser
enfriados hasta 45º - 55ºC
para adicionarlo en los
recipientes finales teniendo
en cuenta la asepsia.
MODO DE PREPARAR LAS DILUCIONES

10 ml 10 ml 10 ml

90 ml 90 ml 90 ml
agua de agua de agua de
dilución dilución dilución

MUESTRA

10-1 10-2 10-3

(0.1 ml de muestra) (0.01 ml de muestra) (0.001 ml de muestra)
Método del número mas probable (NMP)

• Sembrar diferentes volúmenes de muestra (10, 1, 0.1, 0.01, ml etc.)

en tubos con caldo lauril triptosa con campana Durham. Es
necesario sembrar 5 tubos por cada volumen de muestra.
• Los volúmenes dependerán de la muestra. Ej: para aguas potables:
10, 1 y 0.1 ml; Aguas no muy contaminadas: 1, 0.1 y 0.01 ml.
• Agitar los tubos e incubar a 35 + 0.5ºC por 24h. Al cabo de 24 horas
de incubación, examinar la presencia de gas y turbiedad.
• En caso negativo, volver a incubar por 24 h. Reexaminar. Si no hay
cambios, reportar la prueba presuntiva como negativa.
• En caso contrario todos los tubos positivos de la prueba presuntiva
deben someterse a la prueba confirmativa.
Método del número mas probable (NMP)

Prueba presuntiva
• Sembrar diferentes volúmenes de muestra (10, 1, 0.1, 0.01, ml etc.)
en tubos con caldo lauril triptosa con campana Durham. Es
necesario sembrar 5 tubos por cada volumen de muestra.
• Los volúmenes dependerán de la muestra. Ej: para aguas potables:
10, 1 y 0.1 ml; Aguas no muy contaminadas: 1, 0.1 y 0.01 ml.
• Agitar los tubos e incubar a 35 + 0.5ºC por 24h. Al cabo de 24 horas
de incubación, examinar la presencia de gas y turbiedad.
• En caso negativo, volver a incubar por 24 h. Reexaminar. Si no hay
cambios, reportar la prueba presuntiva como negativa.
• En caso contrario todos los tubos positivos de la prueba presuntiva
deben someterse a la prueba confirmativa.
Método del número mas probable (NMP)

Prueba confirmativa – Coliformes totales

• Inocular, de cada uno de los tubos positivos, con asa
bacteriológica, un tubo con caldo lactosado bilis verde
brillante con campana Durham.
• Agitar cuidadosamente e incubar a 35 + 0.5ºC durante 24 h.
Examinar la presencia de gas y turbiedad.
• En caso negativo incubar de nuevo por 24 h. Reexaminar. Si no
hay cambio, la prueba confirmativa se reporta como negativa.
• Si hay gas y turbiedad (prueba positiva) se procederá a
efectuar la prueba completa con cada uno de los tubos.
• Análisis de rutina: hasta la prueba confirmativa. Pero los datos
deben verificarse llevando a cabo la prueba completa.
 1 2 3

5
4

MÉTODO DEL NÚMERO MÁS

PROBABLE POR TUBOS MÚLTIPLES
Método del número mas probable (NMP)

Prueba completa – Coliformes totales

• Sembrar por estría, cada tubo positivo en una placa Petri con
agar EMB (eosina azul de metileno) e incubar durante 24 h a
35 + 0.5ºC.
• Colonias típicas: nucleadas, con o sin brillo metálico. Atípicas:
pocas, no nucleadas, mucoides, rosadas. Negativas:
transparentes.
• Escoger tres colonias (dos típicas y una atípica) y sembrar c/u
en un tubo con caldo lauril triptosa y otra con agar nutritivo
(inclinado). Incubar durante 24-48 + 3h y 24 + 2h
respectivamente a a 35 + 0.5ºC. Observar la producción de
gas y turbiedad.
Método del número mas probable (NMP)

Típica

Negativa

Atípica

Agar EMB - Coliformes totales

Método del número mas probable (NMP)

Coliformes
Prueba Coliformes totales E. coli
termotolerantes

Caldo lauril triptosa

Presuntiva
24 h/48h – 35 ± 0,5°C, incubadora.

Caldo lactosado bilis Caldo EC Caldo EC MUG

verde brillante 24h/48h – 24h/48h – 44,5 ±
Confirmativa
24 h/48h – 35 C, 44,5 ± 0,2°C, 0,2°C,
incubadora. baño maría. baño maría.
Tubos con presencia
Agar EMB de gas.
Colonias típicas: Irradiar los tubos
nucleadas, con o sin brillo con una fuente de
Completa
metálico. Atípicas: pocas, luz UV, observar
no nucleadas, mucoides, cuantos tubos
rosadas. presentan
fluorescencia.
Método del número mas probable (NMP)
Método del número mas probable (NMP)
Método del número mas probable (NMP)

Caldo EC – Coliformes Caldo EC MUG – E. coli

termotolerantes
Método del número mas probable (NMP)
• El cálculo en la combinación de los resultados de los tubos positivos y
negativos obtenidos de cada dilución o volumen sembrado.
• Esta densidad se expresa como NMP (número más probable) de
Coliformes totales por 100 ml.
• El NMP se obtiene de la comparación de los resultados obtenidos de la
muestra, con las tablas especialmente diseñadas las cuales tienen límites
de confianza del 95%.
• Ej: Siembra de 5 x 10 ml, 5 x 1 ml, y 5 x 0.1 ml, de los cuales fueron
positivos 5 x 10 ml, 2 x 1 ml y 1 x 0.1 ml, el código resultante será 5-2-1,
cuyo NMP es 70, entonces el resultado es 70 NMP/100ml.
• Siembra de volúmenes menores, se aplica:

• Todos positivos: seleccionar para componer el código las tres mayores

diluciones. Todos negativos: las tres menores diluciones.
 # de Tubos Positivos # de Tubos Positivos # de Tubos Positivos # de Tubos Positivos # de Tubos Positivos # de Tubos Positivos
10 ml 1 ml 0.1 ml NMP 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP 10 ml 1 ml 0.1 ml NMP
0 0 0 ˂ 1.8 1 0 0 2 2 0 0 4.5 3 0 0 7.8 4 0 0 13 5 0 0 23
0 0 1 1.8 1 0 1 4 2 0 1 6.8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31
0 0 2 3.6 1 0 2 6 2 0 2 9.1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43
0 0 3 5.4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58
0 0 4 7.2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76
0 0 5 9 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95
0 1 0 1.8 1 1 0 4 2 1 0 6.8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33
0 1 1 3.6 1 1 1 6.1 2 1 1 9.2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46
0 1 2 5.5 1 1 2 8.1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64
0 1 3 7.3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84
0 1 4 9.1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130
0 2 0 3.7 1 2 0 6.1 2 2 0 9.3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49
0 2 1 5.5 1 2 1 8.2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70
0 2 2 7.4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95
0 2 3 9.2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180
0 3 0 5.6 1 3 0 8.3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79
0 3 1 7.4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110
0 3 2 9.3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250
0 4 0 7.5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130
0 4 1 9.4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430
0 5 0 9.4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81 5 5 5 ˃1600
 1 2 3 4

8
5 6 7

MÉTODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA

 CÁLCULOS

• Cuando la suma total de colonias es superior a 200,

no se utiliza esa dilución: crecimiento perjudicado.
• Cuando haya crecimiento en toda el área de filtración
de membrana, sin colonias definidas: crecimiento
confluente (C. Cf.).
 EJERCICIO
Se filtro 100 ml de la última dilución de una muestra de agua residual tratada,
la membrana fue colocada en medio FC con ácido rosólicoe incubadas a 45 ±
0.5 ⁰C en baño maría. Calcular: Coliformes Termotolerantes, si la ultima dilución
fue 10-6:
 Análisis de Huevos de helmintos

• Existen varias técnicas para la enumeración de

huevos de helmintos, c/u presenta ventajas e
inconvenientes.
• Todos los métodos están basados en uno de
dos principios fundamentales: separación de
los huevos por flotación o sedimentación.
• Métodos más usados:
– Bailenger modificado
– Metodologías validadas.

Cámara Mc Master para conteo de

huevos de helmintos
 Bailenger modificado

• Para aguas residuales crudas el

metodo es muy eficiente. Pero
para efluentes de aguas
residuales tratadas debe
aumentarse el tamaiio de la
muestra hasta por lo menos 10
litros, ya que en este caso el
numero de huevos es muy
inferior.
1. Recojase una muestra de
agua residual de volumen
conocido (V litros).
2. Dejar sedimentar durante 1-
2/24horas, segun el tamaño
del recipiente
 Bailenger modificado

3. Elimine el 90% de la materia sobrenadante utilizando una bomba

de succión o un sifón.
4. Transfiera el sedimento a uno o mas tubos de centrifuga, según
sea el volumen, y centrifugue a 1000g durante 15 minutos. Hay
que enjuagar el recipiente y añadir el líquido de enjuague al
sedimento.
5. Elimine la materia sobrenadante y transfiera todos los sedimentos
a un solo tubo (enjuagando bien para evitar que se pierda
sedimento), y vuelva a centrifugar a 1000g durante 15 minutos.
6. Suspenda el sedimento en volumen igual de tampón de
acetoacético, pH 4,5. Si el sedimento menor a 2 ml, añada tampón
hasta 4 ml para asegurar que, tras la extracción con acetato etílico
quedará tampón suficiente por encima del sedimento para poder
verter la capa de acetato etílico sin que se produzca una nueva
suspensión del sedimento.
 Bailenger modificado

7. Añada dos volúmenes de acetato etílico o

de éter y mezcle bien la solución en un
vortex.
8. Centrifugue a 1000g por 15 minutos. La
muestra se separará en tres fases.
Residuos no grasos (mas pesados),
incluidos los huevos de helminto, en la
capa inferior. Encima se encontrará el
tampón (transparente). Las materias
grasas y otras se unen al acetato etílico o
el éter y forman un tapón grueso y oscuro
en la parte superior.
9. Anotar el volumen de sedimento no
graso, y retirar el resto del sobrenadante.
 Bailenger modificado

10. Vuelva a suspender el sedimento en cinco volúmenes de solución de

sulfato de zinc. Anote el volumen del producto final (X ml). Mezcle bien
con un vortex.
11. Retire una alícuota con una pipeta Pasteur y transfiera a una placa
McMaster para su examen final. Deje reposar la placa llena por 5
minutos antes de examinar (los huevos flotarán en la superficie).
12. Observar al microscopio (10X ó 40X). Contar todos los huevos en la
parrilla de las dos cámaras. Registre el promedio de dos placas.
13. Calcule el número de huevos mediante la ecuación: N = AX/PV en la que:
– N = numero de huevos por litro de la muestra
– A = numero de huevos contados en el portaobjetos de McMaster o promedio
del recuento en dos o tres portaobjetos
– X = volumen del producto final (ml)
– P = volumen del portaobjetos de McMaster (0,3 ml - 0.15 en cada cámara)
– V = volumen de la muestra original (litros)
Bailenger modificado
 Ventajas y desventajas –
Bailenger modificado

• Toma y preparación de muestra sencilla.

• El tiempo necesario para examinar cada portaobjetos de
McMaster suele ser de tan solo 1-2 minutos, con lo que se
reduce la posibilidad de errores del operador.
• Se examina en busca de huevos una submuestra de cada
muestra procesada (muestras replicadas).

• No se conoce el porcentaje de observación de huevos, se

ha comprobado que puede compararse ventajosamente
con el de todas las demás técnicas (Ayres et al., 1991;
Bouhoum y Schwartzbrod, 1989).
• El método no es adecuado para muchos tipos de huevos.
• En nuestro país, utiliza reactivos químicos controlados.
MÉTODO VALIDADO PARA DETERMINAR HUEVOS DE
HELMINTOS
6
Lectura en Cámara Mac Master
 CÁLCULOS

N = AX / PV

Donde:
N = número de huevos por litro de la muestra
A = número de huevos contados en la cámara de McMaster
o la media de los recuentos realizados en el número de
cámaras observadas.
X = Volumen del producto final (sedimento resuspendido en
la solución salina sobresaturada)
P = Volumen de la cámara de McMaster (0.15ml)
V = Volumen de la muestra original (en litros)
 MICROBIOLOGÍA
DE LAS AGUAS
RESIDUALES

Blga. Erika Cadillo La Torre

alecadillo@gmail.com