Eficiencia de Pseudomona putida en la biodegradación de combustibles

usados

Eficiencia de Pseudomona putida en la biodegradación de

Commented [1]: Creo que deberíamos cambiar el
combustibles usados nombre, finalmente lo que medimos no es la eficiencia

Efficiency of Pseudomona putida in the biodegradation of

spent fuels

Sánchez Rengifo P.1, Reyes Linares W.2, Zárate Vera J.3

Resumen:
El presente trabajo tiene como objetivo mostrar la capacidad degradadora de la
pseudomona putida frente a un contaminante de hidrocarburo más específicamente de
aceite de motor usado, la pseudomona putida fue adaptada a un medio de sales mínimas
con AMU (Aceite de Motor Usado) como única fuente de carbono y enriquecido con
peptona como fuente de nitrógeno, el microorganismo se sometió a diferentes
concentraciones de sustrato AMU, glucosa, peptona, PH y temperatura para poder
determinar las condiciones óptimas de crecimiento del microorganismo, se realizó el
montaje de dos biorreactores con capacidad para 1 litro, el sistema de control (Biorreactor
1 BK) contenia medio de cultivo pero sin inoculo, el segundo reactor (Biorreactor 2) fue
inoculado con 10 ml de pre cultivo fresco, se tomaron un muestra por día a la misma hora a
lo largo de 6 días para determinar la cinética de crecimiento del organismo.
Palabras Clave: Biosulfactantes, tensión superficial, micelas, regresión lineal, capacidad
de alojamiento.

Abstract:
The present work has as objective to show the degrading capacity of the pseudomonas
putida against a hydrocarbon pollutant, more specifically of used motor oil, the
pseudomona putida was adapted to a medium of minimum salts with AMU (Used Motor
Oil) as the only source of carbon and enriched with peptone as a source of nitrogen, the
microorganism was subjected to different concentrations of substrate AMU, glucose,
peptone, pH and temperature to determine the optimal growth conditions of the
microorganism, the assembly of two bioreactors with capacity for 1 liter, the control system
(Bioreactor 1 BK) contained culture medium but without inoculum, the second reactor
(Bioreactor 2) was inoculated with XX ml of fresh pre-culture, one sample was taken per
day at the same time throughout of 6 days to determine the kinetics of growth of the
organism,

Key Words: biosulfactants, surface tension, micelles, linear regression, accommodation capacity.

1
Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá – Colombia. Estudiante de Ingeniería Sanitaria. Contacto: pasanchezr@correo.udistrital.edu.co
2
Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá – Colombia. Estudiante de Ingeniería Sanitaria. Contacto: @correo.udistrital.edu.co
3
Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá – Colombia. Estudiante de Ingeniería Sanitaria. Contacto: @correo.udistrital.edu.co
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INTRODUCCIÓN: Commented [2]: Simplificar introducción
Los combustibles residuales de motor son un material altamente contaminante, que
requieren de un tratamiento adecuado, pues estos pueden causar daños al medioambiente
por contener hidrocarburos.
Para tratar problemas de contaminación ambiental con hidrocarburos existen varias
tecnologías, de las cuales se destaca el bioaumento, utilizada para transformar
contaminantes usando microorganismos que cuentan con la maquinaria enzimática para
transformar los compuestos.
Pseudomonas putida, es una de las especies de mayor interés industrial entre las bacterias
del género Pseudomonas, ya que unido a su potencial de degradación de compuestos
aromáticos y xenobióticos, forman biopelículas por medio de biosurfactantes (Lacal,
2008). Lo que les otorga reconocimiento por su capacidad para degradar las fracciones
aromáticas de los derivados del petróleo, presentan las condiciones necesarias para la
degradación de contaminantes como combustibles fósiles, presentes en los aceites
combustibles.
La aplicación fundamental de los biosurfactantes producidos por Pseudomona p. es
disminuir la tensión superficial e incrementar la solubilidad de los hidrocarburos, es decir,
son moléculas anfifílicas de origen biológico que llegan a formar estructuras agregadas
denominadas micelas.
Este grupo de bacterias tienen la capacidad de sintetizar diferentes tipos de biosurfactantes,
los más producidos por este género son los glicolípidos (mono y ramnolípidos) y los
lipopéptidos cíclicos (CLP´s) (Toribio et al., 2014).
La degradación del aceite, es evidenciada además de la producción de biosurfactantes, por
el crecimiento de la bacteria, que se describe usando una ecuación la cual muestra la
variación del tamaño de la población bacteriana en la que el crecimiento per cápita es
dependiente de la densidad. Por medio de regresiones lineal, cuadrática, logarítmica y
potencial, se puede analizar y comparar qué ecuación aplica con mayor eficacia para
encontrar la tasa de crecimiento de la bacteria estudiada.

MATERIALES Y MÉTODOS:
1. Aislamiento y cultivo de microorganismo:
Se realizó el aislamiento de Pseudomona p. suministrada por el laboratorio de
biotecnología de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, aislada con anterioridad
en caldo nutritivo por parte del laboratorista.
La caracterización de la cepa de Pseudomona p., se dió por medio de una tinción de gram y
observación en microscopio.
El medio de aislamiento inicial compuesto por sales mínimas, peptona al 0,1% y
concentraciones del 1% de aceite de motor usado (como única fuente de carbono), entre
otros, con el fin de evidenciar el comportamiento de la bacteria en presencia del aceite y
verificar si la bacteria crece tomando como fuente de carbono los compuestos del aceite.
Tabla No. 1. Componentes del medio de cultivo para aislamiento de Pseudomona p. Commented [3]: Esta tabla se debe modificar de
acuerdo a los componentes utilizados en el laboratorio
(Martinez, 2011).
AGREGAR COMPOCICION AGAR LABORATORIO
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2. Determinación de Condiciones óptimas de crecimiento: Commented [4]: Adicionar caudal de aire y tamaño de
la burbuja. Tipo de motor (marca).
La cepa bacteriana se sembró en agar nutritivo y se incubó por 7 días a temperatura
ambiente, seguidamente se realizó siembras en diferentes medios para determinar sus
condiciones óptimas de crecimiento las cuales fueron pH 7, temperatura 37ºC y
concentración al 1% de aceite.

Todas las siembras anteriores fueron realizadas con un pre cultivo fresco que no superó las
48 horas de sembrado.

3. Siembra final para proceso de fermentación.

Una vez determinada las condiciones óptimas de crecimiento del organismo estas fueron
recreadas en dos reactores de vidrio los cuales fueron esterilizados en auto clave, estos
también contaban con fuente de oxígeno y mezclado, las cuales eran suministradas por una
bomba de pecera que estaba conectada a una manguera previamente esterilizada con
hipoclorito de sodio, estos fermentadores cuentan con capacidad para 1L y el montaje se
realizó tomando 750 ml de medio citado en tabla No. 1, el cual contenía agua peptonada al
0,1% y aceite de motor usado al 1%, el reactor 1 se inoculó inicialmente con una
concentración de 106µg/L , este inóculo fue tomado de un precultivo en tubo con 10 ml de
medio de cultivo con microorganismo, peptona al 0,1% y aceite de motor usado al 1 %, se
realizó un conteo inicial en cámara de Neubauer y se dejó en un horno a 37 centígrados
para el crecimiento bacteriano.

El reactor 2 fue tomado como blanco el cual sufrió el mismo procedimiento solo que este
no contaba con un inóculo bacteriano, de manera que sirva como testigo comparativo del
comportamiento del fermentador en función del tiempo en ausencia del microorganismo
estudiado.

RESULTADOS:
Elección de condiciones óptimas de crecimiento.
Se llevaron a cabo pruebas preliminares, donde se evaluaron diferentes variables y la
respuesta de crecimiento del microorganismo: pH, concentración aceite de motor usado y
temperatura.
Una vez seleccionados los tubos donde se presenció mayor crecimiento de Pseudomona p.*,
se establecieron las condiciones del medio que se mantuvieron para el biorreactor. El
recipiente contenedor del medio y el blanco, se ubicaron dentro de una incubadora, de
manera que se mantuviera la temperatura indicada constante, con aireación otorgada por un
aireador (motor de pecera).
*La determinación de crecimiento bacteriano se dio por pruebas organolépticas, en este
caso por observación directa y agitación (a mayor turbidez, mayor crecimiento bacteriano).
Proceso de fermentación:
Durante 20 días, se mantuvo en incubación los fermentadores, se realizaron conteos
bacterianos periódicos en la cámara Newbauer. El conteo de los microorganismos se
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realizó partiendo de un volumen de 10 μl en cuadros esquineros y el central, 5 cuadros en
total.
Tabla No. 3. Resultados de cinética en biorreactor.

Día 0* 6 8 13 15 18 20
Conteo
promedio 1.06 2.01 2.05 2.17 1.81 1.33 1.26
(E+06)

*El día 0 hace referencia a la hora 0, justo el momento en que se inició la fermentación. Se
utiliza este número para fines aritméticos en el logaritmo.

DISCUSIÓN:
Se observa un crecimiento exponencial durante los primeros 13 días, que llega
posteriormente a una fase estacionaria, posteriormente se observa el decrecimiento de la
población bacteriana. Este descenso precipitado en la población bacteriana es explicado en
lo que respecta a la degradación de las fracciones de los hidrocarburos:
Durante la degradación de hidrocarburos se ha observado que las diferentes fracciones se
asimilan a tasas de consumo variadas, como respuesta a las diferentes afinidades que
presentan las bacterias hacia los compuestos disponibles, la cual depende de la estructura y
el peso molecular (García & Aguirre, 2014).
Cinética de crecimiento bacteriano.
El tiempo de duplicación de Pseudomonas varía entre 30 y 50 minutos, dependiendo de la
cepa que se esté estudiando. Por lo tanto, se debe ejecutar un análisis de curva de
crecimiento para el punto de tiempo exacto (Vipin & Prasun, 2017). Múltiples variables
influyen en el crecimiento de esta bacteria, como se ha mencionado anteriormente, el
oxígeno, sustrato, temperatura, peptona, y otros.
Se utiliza como método estadístico de predicción de crecimiento de Pseudomona p. en los
tiempos que no se realizó conteo, para así encontrar la constante de crecimiento con alta
precisión. En una correlación de variables dependientes (y) e independientes (x) que
representan variables distribuidas normalmente y en relaciones curvilíneas (Hopkins et al.,
1997). Aquella relación significativa se encuentra hallando la gráfica y la ecuación que la
representa. Una vez evaluados los datos, se identifica la ecuación que tiene como
propiedad: la línea de regresión es la que mejor se ajusta a los puntos de muestra (Triola,
2000).
Para determinar la dinámica de crecimiento de Pseudomona p. hasta llegar a su fase de
latencia en presencia de aceite de motor usado se aplicaron diferentes regresiones quienes
arrojaron un buen coeficiente de regresión R2 tal como se muestra en la tabla No. 4. Se
asumió como periodo de latencia el dia 13, dado que en la siguiente lectura la cantidad de
bacterias empiezan a descender. Razón por la cual se analizan las cuatro primeras duplas
(relación de tiempo - cantidad de bacterias).
Tabla No. 4. Modelos y R2 asociados a regresiones.
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Lineal Polinómica Logarítmica Potencial
Modelo 0,086x+1,2418 (- 0,0747ln(x)+1,9174 1,8679x^0,0493
0,0092x^2)+(0,2032x)+
1,0672
R 0,8135 0,9922 0,9925 0,9975
2

Sin embargo, al graficar las regresiones se observó que ninguna de las expresiones pasaba
por alguna de las duplas, por ende se procedió a realizar un análisis con la ecuación
logística y un polinomio de grado tres que se ajuste a las duplas.
Gráfica No. 2.. Regresiones xxx.

La ecuación logística describe la variación del tamaño de una población en la que el

crecimiento per cápita es dependiente de la densidad. Si N(t) es el tamaño de la población
en el instante t, entonces la variación de crecimiento viene dada por la ecuación
diferencial:

Ⓐ
Donde: r = velocidad de crecimiento per cápita, k = capacidad de alojamiento (determina
el tamaño de la población que puede ser admitido por el medio).
La solución de la anterior ecuación, viene dada por:

Ⓑ
Con cualquier tamaño inicial positivo de la población, dicho tamaño alcanzará el valor de
k, es decir, Lim N(t) = k para No > 0, t ∞ (Neuh). Despejando r se obtiene:
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Al reemplazar en Ⓑse obtiene:

Cuya xx se muestra en la gráfica No. 1.

Se plantea ajustar una curva al conjunto de datos obtenidos en el laboratorio. El método
citado por (Riaño & Lizarazo, 2016) consiste en construir un polinomio de grado tres que
vale por las cuatro duplas obtenidas (T0, N(t0)), (T1, N(t1)), (T2, N(t2)), (T3, N(t3)), así:

Al reemplazar las duplas se obtiene con ayuda de algún programa de álgebra como
Derive®, Máxima® o Scientific Workplace®: N(t)=4,578754578E+07(3001x3-
79779x2+716438x+2315040). Con este polinomio N(t) puede evaluarse cualquier valor
intermedio como se encuentran en la siguiente tabla:
Tabla No. 5. Resultados de cinética en biorreactor.

t 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
N(t) 1.06 1.25 1.44 1.60 1.74 1.85 1.94 2.00 2.05 2.08 2.11 2.13 2.14 2.15 2.16 2.16 2.16 2.17 2.17 2.17 2.17
(E+06)
Con N(t) se observa que pasa por los cuatro puntos de lectura, algo que no ocurrió con los
anteriores ajustes.
Gráfica No. 3. Curva de crecimiento de Pseudomona P. ajustada al polinomio N(t).
Gráfica sigmoidea.

Biosíntesis.
La observación de las actividades tensioactivas y emulsificantes indica que los
biosurfactantes fueron producidos por Pseudomona p., en específico ramnolípidos:
ramnosil-β-hidroxidecanoil- β -hidrodecanoato (mono-ramnolípido) y ramnosil-ramnosil-
β -hidroxidecanoil- β -hidrodecanoato (di-ramnolípido).
La biosíntesis de los ramnolípidos en Pseudomona p. ocurre a través de tres etapas
secuenciales; (1) la enzima RhlA (codificada por el gene rhlA) es involucrada en la
síntesis del dímero de ácido graso (HAAs) del ramnolípido, (2) la ramnosiltransferasa
RhlB se encuentra unida a la membrana (codificada por el gen rhlB) usa dTDP-L-ramnosa
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y la molécula de HAAs como precursores, forman el monoramnolípido y (3) estos
monoramnolípidos a su vez son sustratos, junto con la dTDP-L- ramnosa, de la
ramnosil-transferasa RhlC (codificada por el gene rhlC) para producir diramnolípido
(Toribio et al., 2014).
Otros biosurfactantes probablemente producidos por la apariencia del medio, son los los
lipopéptidos, estos son compuestos por un péptido que puede ser ciclados (pudiendo
formar estructuras cíclicas) para formar un anillo lactona entre dos aminoácidos en la
cadena peptídica y una cadena de ácido graso unida por el N-terminal del aminoácido. Esta
característica proporciona propiedades biológicas como la regulación de la formación de
biopelículas (Huber et al., 2002). Commented [5]: Necesitamos simplificar pero
explicando claramente el proceso de biosíntesis
Figura No. 1. Comparación de medios, transcurridos 13 días en biorreactor. Presencia de
micelios en la superficie del recipiente con el medio bacteriano (derecha).

Las bacterias hidrocarbonoclastas, como lo son las Pseudmonas spp., tienen la

particularidad de alimentarse exclusivamente de hidrocarburos, este lo utilizan como
fuente de carbono y energía (García & Aguirre, 2014).
La biodisponibilidad de los hidrocarburos es esencial para su descomposición, los agentes
de superficie (surfactantes o emulsificantes) permiten mejorar esta disponibilidad de los
hidrocarburos para las bacterias. Los microorganismos producen sus propios surfactantes:
biosurfactantes o bioemulsificantes, en general, al principio de la fase estacionaria de
crecimiento (Ron & Rosenberg, 2002).
CONCLUSIONES:
● La presencia de biosurfactantes en un medio acuoso favorece la solubilidad y la
biodisponibilidad de compuestos orgánicos, siendo ésta una de sus principales
propiedades para su aplicación en el área de la biotecnología ambiental en el campo de
la biodegradación de contaminantes.
● La velocidad de crecimiento per cápita disminuye cuando el tamaño de la
población aumenta, por lo que la velocidad de crecimiento es dependiente de la densidad
poblacional.
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