NEFROLOGIA. Vol. Xl. Nim, 1. 1993 Introduccion a la biologia molecular J. Diez* y J. M. Lopez-Novoa** Fis Conespondenca: Dr. Javier Diez Depart de Medica nema. Cento de Ivesgaones oma. acta de Meira, Unive de Nea. Deparment de log y Farmacologa. Facultad de Medicina. Unveridod de Salamanca, RESUMEN Los acontecimientos fisiolégicos que acontecen en nuestro organismo estan modu- lados por miitiples factores actuando a distintos niveles biolégicos: molecular, subcelu- lar, celular, de drgano o de tejido y de organismo completo. Hasta hace poco tiempo, el estudio de las enfermedades humanas consistia exclusiamente en el estudio de las anomalias que se producian a nivel del organismo completo o a nivel de determinados Srganos 0 tejidos en panicular. En los Gkimos aris, los procesos patol6gicos se estudian también en los niveles celular, subcelula y molecular. Para ello, la medicina ha incorpo- ‘ado la logic y la teenologfa de la biologla molecular. La biologia molecular estudla fun- damentalmenie el proceso por el que la informacian contenida en ef ‘genoma es trans- mitido a los elementos de los que se valen las células para hacer operativa esa informa- Ci6n: las proteinas. De tal incorporacin estén resutando avances que modifican sustan- cialmente no s6lo la comprension de la fisiopatologia de las enfermedades humanas, sino también su diagnéstico y, probablemenie, su profil y su tratamiento. En esta breve re- vision sobre la biologia molecular se consideraran brevemente sus bases bioquimicas y fisiol6gicas, sus principales instrumentos metodolégicos y sus aplicaciones en nefrologia. Palabras clave: Genes. Acidos nucleicos. ADN. ARN. Proteinas. Células. ‘SUMMARY Physiological events are regulated by a number of factors acting at several levels, ie., molecular, subcellular, cellular, organ-tissue, and whole organism. Classically, the study of human diseases was approached at the whole organism and/or organ-tissue level. Lastly, pathologic conditions are also studied at the ‘molecular, subcellular, and cellular le This new approach comes from the development and application of molecular biology to medicine. Molecular biology studies the process by which genetic message is translat- ed into final proteins synthesized by techniques to begin to unravel complex biological problems that have direct relevance to understanding, diagnosis, and treatment of medi- cal problems. The objective of this article is to rouge a comprehensive discussion of the biochemical and physiological foundations of molecular biology and its application to cli- nical medicine. in addition, this brief review is intented to provide a framework within which evaluate research articles in this eld of growing importance to clinical nephrology. Key words: Genes. Nucleic acids. DNA. RNA. Proteins. Cells Departamento de Medicina Irtema Centro de Investigaciones Biomedics. Faaultad de Medicina, bruni, s/ 31080 Pamplona, 4Evolucién historica Elorigen de la biologia molecular data de principios de los afios cuarenta. En aquel tiempo, los bioquimicos ha- bian descubierto muchas reacciones quimicas intracelula res fundamentales y habian comprendido la importancia de las reacciones especticas y de ciertas moléculas para definir numerosas propiedades de las células. Sin embar- g0, el desarrollo de la biologia molecular tuvo que espe- rar a los adelantos que se llevaron a cabo estudiando cé- lulas esencillase tales como bacteras y virus bacterianos (organismos procariéticos), los cuales proporcionan infor- rmacién acerca de fos procesos biol6gicos basicos de una forma mas rapida que las células animales (organismos eu- caribticos), La creencia en la uniformidad basica de los procesos de la vida fue un factor importante en este ri- pido desarrollo. Es decir, se pens6 que los principios bio- logicos fundamentales que gobieman la actividad de los organismos procariéticos; podrian aplicarse también a los corganismos eucariéticos, solamente variarian los detalles Fsta creencia ha sido posteriormente raificada por los re- sultados experimentales. Las bacterias y los virus permitieron a los cientificos identificar un écido nudeico, el cido deoximibonucleico ‘© ADN, como la molécula que contiene la mayoria de la informacién genética de una célulay la que, a tavés de ato écido nuicleico —el acido ribonucleico 0 ARN—, con- ‘rola gran parte de las funciones celulares, regulando la sintesis de otras moléculas, las proteinas. Después de este descubrimiento, el nuevo campo de la genética molecu- lar avanzé rapidamente durante las siguientes décadas(ta- bla’), proporcionando nuevos conceptos a una velocidad que solo puede compararse con la del desarrollo de la mecénica cudntica en los aftos veinte. Los iltimos anos estan conociendo la aplicacién creciente de la metodo- logia de la biologia molecular —la denominada tecnolo- gia del ADN recombinante— a la investigacion de aspec- tos muy diversos tanto de la biologia general como de la medicina y de otras ciencias. Concepto Para defini la biologia molecular hay que partir de la consideracién de que una célula contiene entre 10,000 y 100.000 clases de moléculas diferentes. Aproximadamen- te la mitad de estas moléculas son pequefias —iones inor- Binicos y componentes orginicos cuyos pesos molecula- tes generalmente no exceden de algunos cientos—. Las ‘otras moléculas son grandes, peso molecular entre 10° y 10" y se les llama macromoléculas. Existen cuatro tipos de macromoléculas: proteinas, icidos nudleicos, polisacd- fidos y lipidos, que estén constituidos por polimeros de aminodcidos, nucle6tidos, azicares y acidos grasos, res- pectivamente, Las macromoléculas son esenciales para que acontezcan los distintos procesos que posibiltan la vida de las células. En este sentido, y dada la multiplicidad de BIOLOGIA MOLECULAR Tabla |. Hitos historicos en el desarrollo de la biologia molecular wt Sy genen ies cena tenny 7 Witams Watson Cick roponen re a eSrucra dl at sarees To Sancta ongntoracietr sa 197273. Boyer, Cohen y Berg desarolan las tenicas de clonacion del ye Cohen y Berg 1975.77 Sanger y Barely Maxam y Gilbert desanellan métodos de se- ‘uercacion répida del ADN. 1981-82 Palmitery inser desarollan rates transgénicos. las funciones desempenadas por las proteinas? (taba I), éstas son las macromoléculas mas importantes de la cé- lula. Peto, al fin y al cabo, las proteinas consttuyen la ex- presién molecular de una informacion quimica contenida en y elaborada por los cidos nucleicos ADN y ARN. A te- nor de todo elo, la biologa molecuar poda defrise como aquella rama de la biologia que estudia los meca- nismos que regulan la disponibildad y la actividad de las proteinas en las céulas a partir de la informacion genét- «a contenida en los acidos nudeicos. Tabla Il Principales funciones de las proteinas Tipo de proteinas Funcién raimas Regulara transmisién de la informa ‘in genetica Regular €l metabolsmo de la lula Mantener la coniguracin de lac Tula (itoesqueeto,. membrana plasmic, matiz ewacella Asegurac a constancaficoqueica fo medo iacdllar Protenas estructurles Mecanismos de varsporte Receptors, antigenos ‘Mediar la elacién de la ctula con ‘el medio exraceluar Hormonas, factors de recimien-‘Transenisefiles entre la clas 10, anbcverpes 5J. DIEZ Y J.M. LOPEZ-NOVOA oe ae c Deoxiribos: oF : 5 Temncons “oe 0. a oF 7* t o ¥ & ¥ os Leon e oF" a" union 3° union 5° \. - oF" Puente fosfodister Fig. 1—Cadena de nuclestidos constiuyertes del ADN (G: guanina; C: ‘hosing; Ttimina; A: aden). ‘Termiacion 3 ELADN y la sintesis de proteinas Estructura del ADN Cada molécula de ADN esti constituida por dos poll rmeros lineales de nuclestidos en forma de cadena’ Cada nucleétido consta de una base nitrogenada (adeni- nna, guanina,timina o citosina) y un azticar(deoxiibosa). Los nucledtidos estan unidos entre si por enlaces cova- lentes fosfodiéster que unen el carbono en posicion 5° de tuna deoxiribosa con el carbono 3° de la deoxiibosa si Buiente (ig. 1). ‘Watson y Crick’ avanzaron hace cuarenta afios que las dos cadenas que constituyen cada molécula de ADN se enrollan entre si adquiriendo una configuracion final de doble hélice (ig. 2). Ello es posible porque entre las ba- ses de cada polimero se forman parejas de bases com- plementarias. Cada pareja esti constituida por la union, a través de puentes de hidrogeno, de la adenina de un pol ‘mero con fa timina del otro y de la guanina de un pol- mero con la citosina del otro (ig. 2). La distrbucion de las bases a fo largo de cada polime- ro también esti sometida a unas determinadas normast. Concretamente, en ciertas partes de la molécula, que constituyen las secuencias codifcantes, hay bases orde- nades en grupos de bes o bipetes, de tal manera que cada uno de estos tripletes constituye una palabra clave ‘0 codén que codificara un aminodcido determinado. Los codones se hallan presentes s6lo en ciertos segmentos del ADN, los llamados exones 0 regiones codificadoras, ‘que constituyen alrededor del 10 % del total de ADN. En ‘otros segmentos, las bases no estin dispuestas formando codones. Entre estos segmentos se cuentan los denomi- nnados intrones o regiones intercalares. Los intrones se i llan intercalados entre los exones a lo largo de la mol aula de ADN. También hay secuencias repettivas de ba- Compleio szicarfstato ie, 2—Esiuctura on doble hélice de una rmolécula de ADN (ls niiales coresponden 2 as bases 6Ses y otros segmentos cuyas funciones se conocen en. tunos casos y se desconocen en otros. Un gen representa la secuencia completa de bases de ADN que especifica la secuencia de aminoacidos de una unica cadena poli- peptidica o de una molécula proteica. Ello significa que en el ADN un gen consiste en un ntimero variable de exo- nes y de los intrones entre ellos intercalados. Se ha calculado que el genoma humano (constituido por el conjunto del ADN localizado en os 23 cromoso- mas de cada célula) consta de 3.000 millones de bases y que codifica entre 30.000 y 100.000 productos génicos. Transmisién de la informacion genética: Expresién del ADN en las proteinas Que la informacion genética contenida en el ADN se transmite quiere decir que los genes se expresan en for- ma de proteinas. Elo implica que una secuencia lineal de nnudleétidos ha de ser convertida en una secuencia coli- neal de aminodcidos, lo que acontece a lo largo de una serie de pasos (fig. 3). El primer paso consiste en que el ADN de los cromo- somas se transcribe en el nicleo celular a una copia de ‘ARN*?. ELARN es otto polimero lineal de nucledtidos que se distingue del ADN porque su azticar es la ribosa (en Ingar de deoxithosay poraue la tnina est susttuda por la uridina o uracil (otra base capaz de formar una pa- rej de bases complementarias con la adenina). Durante latranscripcion, los nucledtidos del ARN se van alineando a lo largo de uno de los polimeros del ADN que sive como «moldes del ARN— siguiendo las reglas Tenn wuao Procraneno ABN mere [= reese AN mero crrOMASA |— Tanke Polpéptide/Pteina Fig, 3—Proceso de tansmisi6n del informacion genetica del ADN a 2s proeinas, BIOLOGIA MOLECULAR del emparejamiento de las bases*. Asi, la adenina del ADN se empareja con fa uridina del ARN, la citosina se empareja con la guanina, la timina con la adentna yla gua- nina con la citosina. Los nucledtidos se unen entre si por accion de una enzima con varios componentes: la ARN ppolimerasa de tipo Il. Un componente inicia la transcrip- ci6n cuando reconoce en el ADN una secuencia espec fica de nucle6tidos (denominada serial de iniciacion, otto componente realiza la adicion sucesiva de nucleotidos (elongacién de la cadena de ARN) y otro componente f- naliza a transcripci6n cuando reconoce otra secuencia es- pecifica en el ADN (denominada seal de terminacién). Fe rnalmente, el ARN transcrito y la ARN polimerasa se sepa- ran del ADN. Hay que senalar que la transcripcién del ADN da lugar a una copia fel de toda la secuencia genica; asi, en el 'ARN transcrito también alternan los exones y los intrones Pero el ARN transcrito, antes de salir al Gtoplasma es so- rmetido en el nicleo a un procesamiento que elimina los intrones y posiblta que los exones se agrupen para for ‘mar un solo gen continuo®. De esta manera, el ARN trans- crito resuitante constituye el mode necesario para la ta- duccién en forma de secuencia de aminodcidos de una proteina. Este es el ARN denominado ARN mensajero. EL ARN mensajero abandona el nucleo y penetra en el citoplasma, donde se asocia a los ribosomas, que son grandes complejos de ARN (ARN ribosémico) y proteinas Una vez en ellos, la sintesis tiene lugar mediante la par cipacién de otro tipo de ARN (denominado ARN de trans- ferencia o transtacion) unido especiicamente a, cada uno de los 20 aminoacidos eaistentes en las celulas. Cada ARN de transferencia contiene un tiplete de bases complemen- tarias de las existentes en un codén especitico del ARN rmensajero. Las moléculas del ARN de transferencia, con su aminoacido correspondiente, se alinean a lo largo de la molécula del ARN mensajero en el orden preciso dictado por la secuencia de codones de éste. Por la accion de cier tas enzimas citoplésmicas (aminoacil transferasas) se for man enlaces peptidicos entre los diversos aminodcidos, y la cadena polipeptidica o la proteina completa asi forma- das se desprenden del ribosoma® Regulacién de la expresién génica Los distintos tipos de células existentes en los organis- mos plurcelulares deben su diversidad al hecho de que expresan distintos genes. Ello es debido a que en cada cé- lula fa expresion de sus genes esté regulada. La regulacion de la expresion genica puede hacerse a tres niveles" 1) Nivel transcripcional, en el que se regula como es trans- tito el ADN en el ARN de transcripcion. 2) Nivel pos- transcripcional, en el que se reguian el procesamiento del ARN transcrito hasta su conversion en ARN mensajero, el ‘transporte del ARN mensajero desde el nicleo hasta el ci- toplasma y la o transferencia translacién de los codones del ARN mensajero a los aminoacidos del ARN de trans- vJ. DIEZ Y JM. LOPEZ-NOVOA lain, 3) Nel de rena, en el que se egul lt esc turay la actividad de las proteinas sintetizada La regulacién a nivel transcripcional es la mas impor. tante de las tres". Esta regulaci6n es ejercida por las la- imadas proteinas reguladoras de genes o factores de trans ipci6n. Se trata de unas proteinas existentes en el ni ceo que reconocen en el ADN secuencias especiicas de rnudledtidos a las que se nen, Esta union hace que en unos casos se facidite la transcripcién de un gen a cente 0 alejado y que en otros casos se inhiba. A las se cuencias de ADN que facitan la transcripcion se las de- rnomina promotoras o intensificadoras segtin que facilten el inicio 0 la continuacion de la transcripcion, respectva- mente. Se sabe actualmente que la transcripcion de un gen esta regulada por una combinacién de proteinas re- guladoras faciltadoras y de proteinas reguladoras inhibi- doras. Asimismo, se sabe que existen proteinas regulado- ras, llamadas maestras, cada una de las cuales regula la transcripcion de grupos grandes de genes. Hay genes que son transcrtos siempre de una manera constante. La regulacion de su expresion se efectia en- tonces a nivel postranscripcional'. Este tipo de control es ejercido por protelnas reguladoras 0 por moléculas regu- ladoras de ARN que reconocen secuencias espectficas del ‘ARN a regular. Hay que seftalar que uno de los puntos im- ortantes de este tipo de control es el que afecta tanto a la formacion como a la degradacion del ARN mensajero. Finalmente, la regulacion del producto titimo del gen, |a proteina, también forma parte del control de la expre- sion génica". Flo supone que se regula la degradacion de las mismas, su elocalizacion» y funciones en la célula y las modifcaciones que pueda experimentar su estruc: tura Papel de la expresin gia en as interciones las células de un organismo multicelular se comunican entre si con el triple fin de regular su desarrollo y organi- zaclon en tejdos, controlar su cecimiento y deison Coordinar sus funciones. Esa comunicacion se puede es tablecer a través de tres mecanismos distintos'": 1) Secre- tendo molecule que actian en clas loalzada a ds tancia variable de la céula secretora (moléculas de senal), 2) Siniendose de moléculas unidas a la membrana plas: ‘matica y que contactan fisicamente con la membrana de células adyacentes. 3) Intercambiando pequefias molécu- las a través de las uniones abiertas (gap junctions) que existen entre las membranas de células adyacentes y a tra- vés de las que se unen los citoplasmas de dlchas céulas ‘Aunque los tres mecanismos son importantes para las in- teraccones cellars el primero ese mejor conocido ac tualmente. Las moigculas de sefal secretadas por ciertas células pueden comunicar a éstas con células muy alejadas de elas (comunicacion endoctina mediada por hormonas transportadas por la sangre), con células de su entomo 8 pr6ximo (comunicaci6n paracrina mediada por mediado- res quimicos locales) y con células adyacentes (comuni- ‘acion sinéptica mediada por neurotransmisores). La no- repinefrina y las encefalinas constituyen excepciones a esta clasicacion, pues traténdose de neurotransmisores median un tipo de comunicacion paracrina-autocrina las moléculas de seftal que median cualquiera de es- tos tes tipos de comunicacién son de dos cases, segun sea la solubilidad que presentan en el agua, el tiempo que permanecen intactas en el medio extracelular, el me- canismo por el que transmiten la informacion a las célu- las diana y la respuesta que provocan en éstas”: 1) Mo- leculas hidrofébicas (las hormonas esteroideas y las hor- monas tiroideas) que persisten en el medio extracelular poor largo tiempo y que, tas atravesar la membrana de la Céhia diana, aan receptoresfocalzados enol ctoplas- ma o en el niidleo, dando lugar a respuestas lentas y de larga duracién. 2) Moléculas hidrofilcas la gran mayoria de las hormonas, los mediadores quimicos locales y los neurotransmisores) que, tras perrnanecer corto tiempo en el medio extraceluar, iteraccionan con receptores de la membrana de las células diana, originando respuestas ré- pias y de corta duraci6n. Una excepcion a esta doble dis- Criminacion la constituyen las prostaglandinas y el factor activador de las plaquetas, moléculas hidrofobicas que ac- ian como mediadores quimicos locales unigndose ar ceptores de la membrana celular y provocando una res puesta répida y de corta duracion: La respuesta de las células diana a estas dos clases de moléculas implica siempre una modificacion de la expre- sién génica, resultado fundamentalmente de cambios en la transcripcion del ADN. Mientras que las moléculas hi- drofobicas de sen influencian la expresion génica direc- tamente', las moléculas hidroficas de seftal lo hacen a través de mediadoresintracelulares, los segundos mensa- jeros 2, Asi, la union de las motéculas hidrofobicas de seal a su receptor intracelular forma un complejo molécula-e- ceptor que se une a secuencias del ADN que son secuen- cias intensiicadoras de la transcripcién de ciertos genes réximos (fig. 4). La respuesta primaria inmediata de fa cé- lula a esas moléculas Consiste, pues, en faciltar la expre- sin de ciertos genes, conocidos como genes de respues- ta inmediata. Pero, a su vez, el producto de algunos de estos genes puede facilitar la transcripcién de otros genes genes de respuesta tras llamada respuesta secu lara diferida, que sive para amplificar la respuesta de la célula a las moléculas hidrofobicas de senal. Fs interesante mencionar que los receptores para estas rmoléculas estén constituidos por una familia de proteinas homélogas en la que cada proteina reconoce una sola ‘molécula hidrofébica de senal y secuencias intensiicado- ras de mas de un gen, segtin ef tipo de célula que se con- sidere. Flo da una idea de la muitiplcidad de respues- tas alas que puede dar lugar en distinta células una mis- ma molécula hidrofobica de senal las moléculas hidroflicas de sefalinciden sobre el ge-BIOLOGIA MOLECULAR ‘Molécula hidrofbica de sera | Receptor nracellar | Complejo motieuaeceptor | Secuencia intensifcadora del AON | Teansrpcon gen @) Fg bers implica ent modicacin del exprsion génica rls moleculs hots de sa “eens rnoma a través de una cascada de eventos (ig 5). Esta cas- cada se inicia con la interaccién de esas moléculas con sus receptores especificos de la membrana celular. Exs- ten tres tipos de receptores: receptores ligados a canales ibicos,receptres gas ation Grass expecta y receptores ligados a las proteinas G®. ta union de una molécula de sefal con un receptor ligado a proteinas G dda lugar ala modificacién, mediada por el guanosintrfos- fato 0 GTP, de la actividad de tres enzimas de la mem- brana: La adenilatociclasa, la guanilatociclasa y la fosfoi- pasa C. La aderilatociclasa activada hidroliza el adenosin- Irifosfato o ATP y da lugar al AMP ciclico®. La guanilato- ciclasa activada hidroliza el fosfatidilinositob-bostato y da lugar al inositoltifostato y al diacilgicerol*. El AMP ciclico induce la activacién de ciertas protein- Ba: 'Sc mathodaog ithe molec chanterzaton of pees. | Hypenens, 016, 192. ‘Alber Sey todish if Molecular biology of renal function, En Bene ner OM y Recor F (2) The fodney WB Sunde, Psd, pp. 216), 991