Diagnóstico basado en citometría de flujo de enfermedades de

inmunodeficiencia primaria

Resumen
Las inmunodeficiencias primarias (PID) son un grupo heterogéneo de enfermedades hereditarias del
sistema inmunológico. El diagnóstico definitivo de la PID se determina mediante análisis genético; Sin
embargo, esto lleva tiempo y es costoso. La citometría de flujo proporciona una herramienta rápida y
altamente sensible para el diagnóstico de PID.
La citometría de flujo puede evaluar poblaciones y subpoblaciones de células específicas, superficie celular,
proteínas intracelulares e intranucleares, efectos biológicos asociados con defectos inmunes específicos y
ciertas características inmunitarias funcionales, cada una de ellas útil para el diagnóstico y evaluación de
las PID. La citometría de flujo identifica de manera efectiva las formas principales de PIDs, incluyendo la
inmunodeficiencia combinada severa , agammaglobulinemia ligada al cromosoma X , síndromes hiper
IgM, síndrome de Wiskott-Aldrich , síndrome ligada al cromosoma X linfoproliferativa, familiar
hemofagocíticolinfohistiocitosis , síndrome linfoproliferativo autoinmune, síndrome IPEX, CTLA
4haploinsuficiencia y LRBA deficiencia, IRAK4 y MyD88 deficiencias,Susceptibilidad mendeliana a
la enfermedad micobacteriana , candidiasis mucocuneous crónica y enfermedad granulomatosa crónica . Si
bien el análisis genético es el enfoque definitivo para establecer diagnósticos específicos de PID, la
citometría de flujo proporciona una herramienta para evaluar de manera efectiva a los pacientes con PID a
un costo relativamente bajo.

Introducción
Las enfermedades de inmunodeficiencia primaria (PID, por sus siglas en inglés) son un grupo heterogéneo
de trastornos monogenéticos del sistema inmunitario, que producen infecciones recurrentes y / o
graves, autoinmunidad , autoinflamación o tumores malignos. Una historia cuidadosa centrada en los tipos
de agentes infecciosos y otras complicaciones son pistas importantes para sospechar de
PID. Investigaciones de laboratorio que incluyen hemograma completo, niveles de inmunoglobulina ,
títulos de anticuerpos, evaluación de neutrófilosLos componentes de función y complemento también son
herramientas importantes para confirmar el diagnóstico de PID. A medida que el espectro de PID se está
expandiendo, a menudo es difícil diagnosticar PID basándose solo en los hallazgos clínicos y de laboratorio
convencionales. La investigación genética más recientemente disponible es una herramienta definitiva
para diagnosticar PID; Sin embargo, el análisis de ADN lleva tiempo y es caro. En contraste, las tecnologías
que utilizan las características físicas y químicas de las partículas marcadas con fluorescencia en la fase
líquida que se pasa a través de los láseres son más limitadas que el análisis genético, aunque necesitan
investigadores experimentados y expertos. Por lo tanto, la citometría de flujo puede servir como un puente
entre las pruebas inmunológicas convencionales y la secuenciación del ADN , ofreciendo resultados rápidos
y precisos basados en el análisis de células individuales. 1
Aplicación de la citometría de flujo en el diagnóstico de enfermedades de inmunodeficiencia primaria.
La citometría de flujo es una herramienta muy sensible para evaluar el sistema inmunológico y apoyar el
diagnóstico de PID. Las aplicaciones de la citometría de flujo en la evaluación de PID son múltiples e
incluyen la investigación de poblaciones y subpoblaciones de células específicas , membrana celular
específica , proteínas intracelulares e intranucleares, efectos biológicos asociados con defectos inmunes y
anomalías inmunitarias funcionales ( Tabla 1 ).
XLA, agammaglobulinemia ligada a X ; SCID, inmunodeficiencia combinada severa ; XLP, síndrome linfoproliferativo
ligado a X; iNKT, asesino natural invariante T; ALPS, síndrome linfoproliferativo autoinmune; TCR, receptor de células
T ; HIES, síndrome de hiper IgE; CMCD, enfermedad de candidiasis mucocutáneacrónica ; CVID, inmunodeficiencia
variable común; BAFF-R, receptor del factor activador de células B ; ICOS, coestimulador inducible; HIGM, síndrome
de hiper IgM; CD40L, ligando CD40; MSMD, susceptibilidad mendeliana a la enfermedad
micobacteriana; IFN, interferón ; IL, interleucina ; LAD, deficiencia de adhesión de leucocitos ; CGD,enfermedad
granulomatosa crónica ; BTK, tirosina quinasa Bruton ; WASp, proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich ; SAP,
proteína asociada a la molécula de activación de señalización; XIAP, inhibidor de la apoptosis ligado a
X ; LHF,linfohistiocitosishemofagocítica familiar; FOXP3, caja de cabezal P3; ZAP70,proteína quinasaasociada a
cadena of de 70 kDa; DOCK8, dedicador de citocinesis 8; CTLA4 , proteína 4 asociada a los linfocitos T
citotóxicos ; LRBA, proteína de anclaje tipo beige sensible a LPS; IPEX, desregulación inmune,
poliendocrinopatía, enteropatía , ligada al X; STAT, transductor de señal y activador de transcripción; CTLs,linfocitos
T citotóxicos ; DHR, deshidrorodamina; JAK3, Janus quinasa 3; IRAK4, quinasa 4 asociada con el receptor
de interleucina 1 ; MyD88, gen de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88; TNF, factor de necrosis
tumoral; LPS, lipopolisacárido; GOF, ganancia de función. Esta tabla se modifica de la referencia2con permiso.

La evaluación cuantitativa de las poblaciones de células y las subpoblaciones es útil para el diagnóstico
de agammaglobulinemia ligada al X (XLA) caracterizada por la ausencia de células B en la sangre periférica . Los
pacientes con inmunodeficiencia combinada grave(SCID) carecen de células T, mientras que el impacto enlas
célulasB yNKes variable dependiendo del defecto genético. Los pacientes con síndrome linfoproliferativo ligado al X
tipo 1 (XLP1) tienen una disminución marcada en las células invariantes del asesino natural T (iNKT). El síndrome
linfoproliferativo autoinmune (ALPS) se caracteriza por un aumentodel receptor de células T(TCR) -α / β-positivo
doble negativo T (DNT) las células. Los pacientes con síndrome hiper IgE autosómico dominante (HIES) y aquellos
con candidiasis mucocutánea crónica (CMCD) presentan una disminución en el número de células T helper (Th) 17
circulantes.
En lo que concierne a las proteínas específicas de la superficie celular , se pueden caracterizar subconjuntos únicos
de pacientes con inmunodeficiencia variable común (CVID) mediante la evaluación de las células B CD19 + ,
el receptor del factor activador decélulas B (BAFF-R) en las células B y el coestimulador inducible. (ICOS) en células T
activadas. Los pacientes con síndrome de hiper IgM ligado a X (X-HIGM) no expresan el ligando CD40 (CD40L) en las
células T activadas, y un grupo de pacientes con síndrome de hiper IgM autosómico recesivo carecen de expresión
de CD40 en las células B. La susceptibilidad mendeliana a la enfermedad micobacteriana (MSMD) se ha asociado con
una expresión aberrante de interferón (IFN) -γR1 en monocitos o una expresión deficiente de IL-12Rβ1 en células T
activadas. Pacientes conla deficiencia de adhesión de leucocitos tipo 1 (LAD1) se puede identificar por la ausencia de
expresión de CD18 en granulocitos . Los linfocitos de pacientes con SCID ligada a X (X-SCID) muestran una expresión
deficiente de CD132 (cadena γ común). Los pacientes que padecen enfermedad granulomatosa
crónica (CGD) deficiente en gp91 y p22-phox , que carecen del citocromo b558 unido a la membrana , pueden
identificarse utilizando el anticuerpo monoclonal (mAb) 7D5 contra el citocromo b558 expresado por granulocitos y
células B. La falta de expresión de IL-17RA en linfocitos y monocitos es típica en pacientes con infección crónica por
Candida mucocutánea y deficiencia de IL-17RA.
Se puede diagnosticar una gran cantidad de PID mediante el análisis de la expresión de proteínas intracelulares
específicas. Los pacientes con XLA generalmente carecen de la expresión de tirosina quinasa (BTK) de Bruton en
monocitos y plaquetas . Los pacientes que padecen el síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) o
la trombocitopenia ligada al X (XLT) muestran una expresión ausente o reducida de la proteína WAS (WASp) en
linfocitos y células mieloides . Los pacientes con XLP1 carecen de expresión de la proteína asociada a SLAM (SAP) en
linfocitos. Los linfocitos de pacientes con XLP2 carecen de expresión del inhibidor de laapoptosis(XIAP)ligado a
X. Pacientes conlinfohistiocitosishemofagocítica familiar.el tipo 2 (FHL2) puede identificarse por la ausencia
de expresión de perforina en células T CD8 + y células NK. Los pacientes con FHL3 demuestran una expresión reducida
de Munc13-4 en plaquetas. Los pacientes con deficiencia de proteína kinasa asociada a lacadena ζ de 70 kDa (ZAP70)
carecen de expresión de ZAP70 en linfocitos. Los neutrófilos de pacientes con CGD ligados a X carecen de gp91-phox,
y los de pacientes con CGD autosómico recesivo debido a la mutación de p47-phox y p67-phox carecen de expresión
de proteína relevante. La mayoría de los pacientes con deficiencia de citocinesis 8 (DOCK8) carecen de expresión de
DOCK8 en los linfocitos. Ambas proteínas asociadas a los linfocitos T citotóxicos 4La haploinsuficiencia (CTLA4) y la
deficiencia de la proteína de anclaje similar a beige y sensible a lipopolisacáridos (LRBA) tienen en común una
baja expresión de CTLA4 en células T reguladorasFOXP3+ CD4 +. La mayoría de los pacientes con desregulación
inmunitaria, polendocrinopatía, enteropatía , síndrome de herencia ligada a X (IPEX) tienen una expresión de caja de
cabeza de tenedor nuclear P3 (FOXP3) baja o ausente por célulasT reguladorasCD4+CD25+.
Técnicas de citometría de flujo están ahora disponibles para evaluar los efectos biológicos de los genes mutados, y
los resultados se pueden utilizar para el diagnóstico de los PID relevantes. La mayoría de los pacientes con síndromes
de CVID o hiper IgM tienen disminución de las células B de memoria conmutada . El síndrome de Omenn y la
mayoría de los síndromes de SCID hipomórficos se caracterizan por un repertorio oligoclonal de células T.
La introducción de pruebas funcionales que utilizan citometría de flujo ha proporcionado una herramienta poderosa
para evaluar vías importantes de inmunidad relacionada e innata . Los pacientes con MSMD debido a mutaciones en
los genes de la vía / 23-IFN IL12 pueden ser identificados mediante la demostración de reducción de la fosforilación
de transductor de señal y activador de la transcripción (STAT) 1 expresión en respuesta a la estimulación
con citocinas . Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con CMCD responden con una
reducción de la fosforilación de STAT1 cuando se estimulan con IFN-γ. Los pacientes con expresión CD107a fhl3 /
4/5, de Chediak-Higashi y el síndrome de Gricelli demuestran reducen en células NK en reposo y en linfocitos T
citotóxicos (CTL). Los monocitos de pacientes con XLP2 responden con reducciónProducción del factor de necrosis
tumoral (TNF) -α por monocitos en respuesta al dipéptido muramilo. Los pacientes con CGD, independientemente
del defecto molecular, muestran reducción reducida o ausente de dihidrorodamina (DHR) 123 en granulocitos,
monocitos y células B. Los pacientes con X-SCID y Janus quinasa 3 (JAK3) SCID deficiente demuestran una
fosforilación reducida de STAT3 y STAT5 en respuesta a la estimulación con citocinas. IL-1 quinasa asociada al
receptor 4 (IRAK4) y mieloide diferenciación gen de respuesta primaria 88 (MyD88) deficiencias pueden ser
identificados por la disminución de la producción de TNF-α en monocitos en respuesta al lipopolisacárido (LPS). Los
pacientes con deficiencia de receptor de IL-10 muestran una reducción de la fosforilación de STAT3 cuando se
estimulan con IL-10. De inicio infantil multisistémica enfermedad autoinmune 1, causada por una mutación
heterocigótica de ganancia de función en STAT3, se asocia típicamente con un aumento de la fosforilación de STAT3
por linfocitos no estimulados.
Los siguientes son ejemplos que ilustran la aplicación de la citometría de flujo para el diagnóstico de PID definidos
molecularmente.
Inmunodeficiencia combinada severa
Los trastornos de SCID, las formas más graves de PID, se caracterizan generalmente por la ausencia total de
inmunidad mediada por células T y la función de las células B alterada. 3Los pacientes con SCID pueden clasificarse
por características inmunofenotípicas basadas en citometría de flujo. T - B - NK - SCID incluye disgenesia reticular
y deficiencia de adenosina desaminasa (ADA). T - B - NK + SCID sugiere mutaciones que afectan los genes activadores
de recombinación ( RAG) 1 y RAG2 , Artemis, ADN ligasa IV y Cernunnos. T - B + NK -El fenotipo es característico de la
deficiencia de X-SCID y JAK3. T - B + NK + SCID incluye deficiencias de IL-7Rα, CD3δ, CD3ε y CD3ζ. En X-SCID, que
representa cerca de la mitad de todos los pacientes con SCID, 4 células T y NK están ausentes mientras que el
recuento de células B es normal o alto ( Fig. 1 A). El gen responsable de X-SCID es IL2RG, que codifica la cadena γ
común (CD132). Por lo tanto, la ausencia de CD132 por citometría de flujo sugiere fuertemente X-SCID ( Fig. 1 B),
aunque algunos pacientes con mutaciones en el dominio citoplásmico del IL2RGPuede expresar CD132 normal. Dado
que la cadena γ común también forma parte de los receptores de IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21, estas citoquinas
constituyen los ligandos específicos para todas las vías que dependen de una cadena γ común funcional. La
fosforilación de las STAT intracelulares se puede evaluar mediante citometría de flujo utilizando mAbs que
reconocen solo las STAT que están fosforiladas. Como se muestra en la Figura 1 C, D, los pacientes con X-SCID tienen
un deterioro de la fosforilación de tirosina de STAT5 y STAT3 en respuesta a la estimulación con IL-2 e IL-21,
respectivamente. Este ensayo también identifica la deficiencia de JAK3 porque JAK3 interactúa intracelularmente
con la cadena γ común. La deficiencia de ZAP70 es una forma de SCID caracterizada por la deficiencia de CD8; los
pacientes con deficiencia de ZAP70 carecen de expresión de ZAP70 en las células T.
 Fig. 1 . La citometría de flujo en un paciente con ligada al cromosoma X de la
inmunodeficiencia combinada grave . A , las células T del paciente (CD3 + ),
las células B (CD19 + ) y las células NK (CD16 + CD56 + ) se separaron en
función de la puerta de los linfocitos . Las células T y NK están ausentes, y el
número de células B aumenta. B , CD132 (cadena γ común) expresión por
células B CD19 + . Las células del paciente carecen de expresión de CD132.
Área sombreada gris, control de isotipos; Línea negra, tinción anti-CD132.
doEvaluación de la citometría de flujo de la fosforilación de STAT5 después
de la estimulación con IL-2. Las células del paciente no responden. Área
sombreada gris, sin estimulante; línea negra, 20 min estimulación post-IL-2. D
, Evaluación de la citometría de flujo de la fosforilación de STAT3 después de
la estimulación con IL-21. Las células del paciente no responden. Área
sombreada gris, sin estimulante; línea negra, 20 min estimulación post-IL-21.

Agammaglobulinemia ligada al X
La XLA se caracteriza por la ausencia de células B circulantes y la reducción severa de todas las
inmunoglobulinas séricas debidas a mutaciones en el gen BTK. Los números de células B ausentes o
marcadamente reducidos, determinados por citometría de flujo en función de la falta de células que
expresan CD19 y / o CD20, son típicos de todas las formas de agammaglobulinemia ( Fig. 2A ). Por lo tanto,
la evaluación de BTK es obligatoria para el diagnóstico de XLA. 6 Debido a que los pacientes con XLA no
tienen células B, la expresión de BTK intracelular debe evaluarse en monocitos o plaquetas ( Fig. 2 B). Esta
técnica también se puede utilizar para la detección de portadores de XLA. La ausencia de expresión
reducida de BTK sugiere fuertemente XLA, pero la cantidad normal de BTK no descarta el diagnóstico, ya
que algunos pacientes con XLA expresan una cantidad normal de proteína BTK no funcional. Los pacientes
con deficiencia de células B con BTK de tipo salvaje pueden tener agammaglobulinemia autosómica
recesiva, y se requiere un análisis de secuencia de μ de cadena pesada, Igα, Igβ, λ5, BLNK, E47 o PI3KR1.

Fig. 2 . Citometría de flujo en un paciente

con agammaglobulinemia ligada al X (XLA). A ,
CD19 + CD20 +células B se reducen
notablemente. B , la expresión de la
tirosina quinasa de Bruton (BTK) está ausente en
los monocitos de los pacientes . Se muestra un
patrón bimodal o de mosaico de expresión de
BTK en el portador heterocigoto. Área
sombreada gris, control de isotipos; Línea negra,
anticuerpo monoclonalanti-BTK .
Síndromes hiper IgM
Los síndromes de HIGM son un grupo de trastornos genéticos que afectan a las moléculas involucradas en
la recombinación de cambio de clase de células B y la hipermutación somática . 10 Los pacientes afectados
presentan una IgM sérica normal o aumentada y niveles bajos de IgG e IgA. Si bien las mutaciones en varios
genes se han asociado con HIGM, el gen afectado con mayor frecuencia es CD40L con herencia recesiva
ligada al X. Los pacientes con deficiencia de CD40L desarrollan no solo infecciones bacterianas, sino
también oportunistas y malignas, lo que implica el importante papel de CD40L en la función de las células
T. La expresión de CD40L (CD154) por las célulasTCD4 + activadasestá ausente o se reduce cuando se evalúa
con mAbs específicos anti-CD40L en la mayoría pero no en todos los pacientes con HIGM ligada al X (Fig.
3 ), ya que algunas mutaciones dan como resultado una proteína no funcional que, sin embargo, se puede
unir a los mAbs neutros del epítopo . Por el contrario, solo el CD40L funcional puede unirse al constructo
de CD40-Ig, lo que proporciona un ensayo funcional basado en citometría de flujo para el HIGM unido a
X. 12 La deficiencia de CD40, uno de varios síndromes de HIGM autosómicos recesivos, es una fenocopia de
la deficiencia de CD40L que puede identificarse mediante la evaluación de la expresión de CD40 en células
B, monocitos o células dendríticas. Excepto por la deficiencia de CD40L y CD40, ninguno de los otros
síndromes HIGM puede identificarse mediante citometría de flujo.

Fig. 3 . Identificación por citometría de flujo de CD154

(CD40L) en células T activadas en un paciente con síndrome
de hiper IgM ligado al X. A , se cultivaron células
mononucleares de sangre periférica con acetato de
miristato de forbol e ionomicina durante 3,5 h. Las células
son positivas para CD69, lo que indica células T activadas,
pero solo las células positivas para control CD69 expresan
CD152 . B , CD154 expresión en CD3 + CD8 - células T se
evaluó. Las células del paciente no pudieron expresar
CD154. Área sombreada gris, control de isotipos; Línea
negra, anticuerpo monoclonal anti-CD154 .

Inmunodeficiencia variable común

CVID es un grupo heterogéneo de trastornos caracterizados por hipogammaglobulinemia, producción
defectuosa de anticuerpos específicos y mayor susceptibilidad a infecciones recurrentes y crónicas, y con
frecuencia a autoinmunidad, trastornos linfoproliferativos y cáncer. 14 Los pacientes con CVID tienen un
número normal o bajo de células B. Las células B pueden subdividirse en naive (CD27 - IgD + IgM + ),
memoria IgM (CD27 + IgD +IgM + ), y células B de memoria conmutada (CD27 + IgD - IgM - ) basadas en CD27 y
expresión de IgD / IgM. 15La mayoría de los pacientes con CVID muestran un número reducido de células B
de memoria conmutada. También se observa una disminución en el número de células B de memoria
conmutada en los síndromes HIGM.
Un pequeño subconjunto de CVID es causado por mutaciones en ICOS, CD19 y BAFFR (TNFRSF13C). Estos
pacientes pueden ser examinados por citometría de flujo. Se informó que los pacientes con deficiencia de
ICOS tenían una reducción en la regulación de ICOS por las células T activadas. 17 BAFFR se expresa de
forma constitutiva en las células B, y los pacientes con mutaciones BAFFR muestran una expresión reducida
de esta proteína. 18CD19 forma complejos con CD21, CD81 y CD225 que colaboran con el receptor de
células B en el reconocimiento de antígenos . Se ha observado ausencia de expresión de CD19 en células B
en pacientes con deficiencias de CD19 y CD81. 19 ,20 , 21
Síndrome de Wiskott-Aldrich y trombocitopenia ligada al X
El WAS es un raro trastorno ligado a X caracterizado por microtrombocitopenia persistente, eccema ,
inmunodeficiencia celular y humoral y un mayor riesgo de enfermedad autoinmune
y neoplasia hematológica. 22 WAS es causado por mutaciones en el gen WAS que codifica la WASp; este gen
también es responsable de la neutropenia XLT y X-ligada . Los anticuerpos monoclonales contra WASp son
útiles para seleccionar a pacientes sospechosos de tener WAS o XLT ( Fig. 4 ). 23 , 24 Esta técnica también
es valiosa en la evaluación del quimerismo después del trasplante de células madre hematopoyéticasy el
mosaicismo de reversión somática del gen WAS .

Fig. 4 . Detección por citometría de flujo de WASp

en un paciente con síndrome de Wiskott-
Aldrich . Laexpresión de WASp citoplásmica se
redujo notablemente en pacientes con células
T CD3 + , células
BCD19 + y monocitos CD14 + . Área sombreada
gris, control de isotipos; línea negra, mAb anti-
WASp.

Síndrome linfoproliferativo ligado a X

La XLP, una PID rara con susceptibilidad a la infección por el virus de Epstein-Barr , se caracteriza
clínicamente por linfohistiocitosis hemofagocítica e hipogammaglobulinemia, con o sin linfoma . XLP se
clasifica en tipo 1 (XLP1) causado por mutaciones en el gen SH2D1Aque codifica SAP y tipo 2 (XLP2)
causado por mutaciones en elgen XIAP o BIRC4 que codifican XIAP. La detección por citometría de flujo de
las proteínas SAP y XIAP intracelulares son pruebas de detección útiles para la identificación de pacientes
con XLP1 y XLP2, respectivamente ( Fig. 5 A, B). Mientras que los pacientes con XLP1 tienen un número
extremadamente reducido de células iNKT, los pacientes con XLP2 tienen un número variable bajo de
células iNKT. La citometría de flujo también es útil para identificar casos atípicos de XLP que incluyen
mosaicismo de reversión somática de XLP1 y XLP2 femenino. 29 , 30 Debido a que XIAP desempeña un
papel esencial en la señalización de la proteína del dominio de oligomerización de unión a nucleótidos
(NOD) 1/2, la evaluación por citometría de flujo de la producción de TNF-α por monocitos en respuesta a la
estimulación con NOD2 por el dipéptido muramilo es un enfoque funcional útil para diagnosticar XIAP
deficiencia. Se encontró que la producción de TNF-α estaba severamente disminuida en todos los
pacientes con deficiencia de XIAP estudiados.
Fig. 5 . Citometría de flujo en pacientes con síndrome linfoproliferativo
ligado al X tipo 1 (XLP1) y XLP2. A , la expresión de SAP se redujo
notablemente en las células T CD8 + y en las células NK CD56 + de un
paciente con XLP1. B , la expresión de XIAP se redujo
en linfocitos y monocitos de un paciente con XLP2. Área sombreada
gris, control de isotipos; Línea negra, anticuerpo monoclonal anti-SAP
o anti-XIAP .

Linfohistiocitosis hemofagocítica familiar

La FHL es un grupo de trastornos genéticamente determinados
y potencialmente mortales asociados con la proliferación
descontrolada de linfocitos e histiocitos activados que secretan
grandes cantidades de citoquinas inflamatorias. 32 Los defectos
genéticos que afectan a la citotoxicidad mediada por
gránulos están asociados con la FHL, incluidas las deficiencias de
perforina (FHL2), Munc13-4 (FHL3), sintaxina 11 (FHL4) y Munc
18-2 (FHL5). FHL2 puede evaluarse evaluando la expresión de la
perforina en CD56 + CD16 +NK y las células T CD8 + ( Fig. 6 A), 33 y
FHL3 se pueden detectar detectando la expresión de Munc13-4
en plaquetas ( Fig. 6 B). 34La evaluación de la liberación de
gránulos citolíticos mediante la medición de la expresión
superficial de CD107a por NK o células T citotóxicases útil para
el diagnóstico de FHL3. 35 , 36 Este ensayo también se ha
sugerido para el diagnóstico de FHL 4, FHL5, síndrome de
Chédiak-Higashi y síndrome de Griscelli, todos con defectos
comunes en las vías citotóxicas mediadas por gránulos.

Fig. 6 . Detección por citometría de flujo de pacientes con

FHL2 y FHL3. A , expresión de perforinareducida en células
NK (CD3 - CD56 + CD16 + población de linfocitos ) de un
paciente con FHL2. Los histogramas sólidos representan la
tinción con el anticuerpo de control de isotipo y los
histogramas abiertos representan la tinción con el
anticuerpo anti-perforina. B , expresión reducida de
Munc13-4 en plaquetas ( población CD41a + ) de un
paciente con FHL3. Los histogramas sólidos representan
tinción con suero de conejo de control e histogramas
abiertos representan tinción con anticuerpo de conejo
anti-Munc13-4.
Síndrome linfoproliferativo autoinmune
El ALPS es un trastorno de la homeostasis linfocítica caracterizada por una linfoproliferación no maligna
crónica, manifestaciones autoinmunes (principalmente citopenia autoinmune) y un aumento de la
incidencia de tumores malignos linfoides . 38 La mayoría de los pacientes con ALPS albergan mutaciones en
genes que regulan la vía de muerte celular programadamediada por Fas
extrínseca ( FAS , FASLG y CASP10 ). Una característica inmunológica de este síndrome es el aumento del
nivel de células TCR-α / β + CD4 - CD8 - en circulación , denominadas células DNT ( Fig. 1A
complementaria ). Mientras que las células T de control se someten a una apoptosis robusta como lo
muestraanexina V células positivas después de la estimulación con anticuerpo anti-FAS, las células T del
paciente ALPS no ( Fig. 1B complementaria ).
Síndrome de IPEX
El síndrome de IPEX, un trastorno autoinmune raro ligado al X causado por mutaciones en el gen FOXP3 ,
se caracteriza por enteropatía severa, endocrinopatías (diabetes y / o tiroiditis) y dermatitis
eccematosa. 39 FOXP3 desempeña un papel fundamental en el desarrollo y la función de las células T (Treg)
reguladoras CD4 + CD25 + . La mayoría de los pacientes con IPEX carecen o tienen un número reducido de
células Treg bajas en CD4 +CD25 + FOXP3 + o CD4 + CD25 + CD127 . Curiosamente, un número suficiente de
CD4 +CD25 + CD127 bajaSe observaron células en pacientes con mutaciones hipomórficas
de FOXP3 . 40 Debido a que CD25 (cadena α del receptor de IL-2) y STAT5b afectan el desarrollo y la función
de Treg, los pacientes con mutaciones de CD25 o STAT5b presentan un fenotipo similar a
IPEX. 41 , 42 Aunque reducido en número, las células Treg de estos pacientes expresan FOXP3.
CTLA4 haploinsuficiencia y deficiencia de LRBA
CTLA4 es una molécula coestimuladora expresada por células T activadas y, similar a la molécula
coestimuladora de células T CD28, se une a B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) en la superficie de las células
presentadoras de antígenos . CTLA4 transmite una señal inhibitoria a las células T, mientras que CD28
transmite una señal estimulante. Se han identificadomutaciones heterocigotas de pérdida de función en
el gen CTLA4 en pacientes con CVID con fenotipo similar a IPEX, que incluyen enteropatía y citopenias
autoinmunes. 43 , 44 Los pacientes con haploinsuficiencia CTLA4 muestran una expresión reducida de
CTLA4 en célulasTCD4 + FOXP3 + activadas( Fig. 2 complementaria). Se identificaron mutaciones bialélicas de
pérdida de función en LRBA en pacientes con diagnóstico clínico de CVID con manifestaciones similares a
ALPS o IPEX. 45 , 46 Un denominador común es la aparición temprana de autoinmunidad grave, a menudo
asociada con infecciones recurrentes y enfermedad linfoproliferativa con mayor riesgo de linfoma. Debido
a que LRBA colocaliza con CTLA4 en vesículas endosómicas , la deficiencia de LRBA aumenta la rotación de
CTLA4, dando como resultado niveles reducidos de proteína CTLA4 en células T convencionales
reguladoras de FOXP3 + y activadas. 47 La similitud fenotípica entre las deficiencias de LRBA y CTLA4 puede
explicarse por este defecto común en la expresión de CTLA4.
Deficiencia de IRAK4 y MyD88
IRAK4 es una quinasa que desempeña un papel crucial en el receptor tipo Toll (TLR) y en la señalización del
receptor IL-1. La unión de los ligandos a estos receptores desencadena el reclutamiento de las proteínas
adaptadoras MyD88, IRAK4 e IRAK1, lo que resulta en la transducción de señales en sentido
descendente . Las deficiencias autosómicas recesivas de IRAK4 y MyD88 dañan la inmunidad mediada por
el receptor de TLR e IL-1, lo que resulta en infecciones bacterianas invasivas,
especialmente infecciones neumocócicas . 48La producción intracelular de TNF-α en monocitos en
respuesta a LPS (un ligando TLR4) se analizó mediante citometría de flujo y se encontró que disminuía en
pacientes con deficiencia de IRAK4 ( Fig. 3 complementaria ). 49 Este ensayo también puede ser útil para la
detección de pacientes con deficiencia de MyD88.
La susceptibilidad mendeliana a la enfermedad micobacteriana
MSMD representa un grupo de PIDs caracterizadas por la vulnerabilidad a la infección con micobacterias
débilmente virulentas y Salmonella. 50 Los pacientes afectados pueden tener mutaciones en los genes
implicados en la vía IL-12/23-IFN-γ. Los pacientes con deficiencias de IL-12Rβ1 e IFNγR1 pueden ser
evaluados por citometría de flujo. La mayoría de los pacientes con deficiencias de IL-12Rβ1 y de IFNγR1
autosómicas recesivas demuestran ausencia de proteína de superficie celular. En contraste, la expresión de
IFNγR1 aumentó en un paciente con una forma autosómica dominante de deficiencia de IFNγR1 debido a
la sobreexpresión de la cadena anormal de IFNγR1 ( Fig. 4 complementaria ).
Candidiasis mucocutánea crónica
La CMCD se caracteriza por infecciones persistentes o recurrentes de C. albicans en la piel, las uñas y las
membranas mucosas. 51 CMCD se refiere a un grupo heterogéneo de PID que incluye HIES autosómico
dominante asociado con mutación STAT3 heterocigótica , deficiencia de IL-12p40, deficiencia de IL-12Rβ1 y
polendocrinopatía autoinmune-candidiasis-distrofia ectodérmica / displasia (APECED). Los pacientes con
CMCD a menudo tienen niveles reducidos de células Th17, al igual que los pacientes con HIES. 52 Aquellos
con APECED pueden desarrollar autoanticuerpos neutralizantes contra IL-17A, IL-17F y / o IL-22, lo que
explica el desarrollo de CMCD. De las deficiencias de IL-17RA autosómicas recesivas recientemente
descubiertas y de IL-17F autosómicas dominantes asociadas con CMCD,53 La deficiencia de IL-17RA puede
diagnosticarse fácilmente por la ausencia de IL-17RA en la superficie de linfocitos y monocitos
circulantes. 54 La causa más común de CMCD son mutaciones heterocigotas de ganancia de función
en STAT1 . 55 , 56 El análisis de flujo reconoce fácilmente los niveles elevados de STAT1 fosforilados que
persisten después de la estimulación con IFN-γ de monocitos de pacientes conmutaciones de ganancia de
función de STAT1 ( Fig. 5 complementaria ). 57 En contraste con las células de control, el inhibidor
de la tirosina quinasa , estaurosporina, no redujo la fosforilación de STAT1 en monocitos obtenidos de
pacientes con mutaciones de ganancia de función de STAT1.
Enfermedad granulomatosa crónica
CGD es un PID genéticamente heterogéneo que afecta la función bactericida de los fagocitos y se
caracteriza por infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes . La CGD es causada por defectos en el
complejo NADPH oxidasa, que es responsable de la explosión respiratoria de los fagocitos que conduce a la
generación de superóxido y otras especies reactivas de oxígeno . Las mutaciones en cinco componentes
(gp91phox, p22phox, p47phox, p67phoxy p40phox) del complejo NADPH explican las formas de CGD ligadas al X y
autosómicas recesivas. Diagnóstico de laboratorioLa CGD se realiza mediante la medición de la producción
de superóxido y se evalúa mediante citometría de flujo utilizando la oxidación DHR123 ( Fig. 7 ). Este
método permite la distinción entre CGD ligada a X y autosómica recesiva, y la detección de portadores de
CGD ligada a X. 58 Los subtipos de CGD se pueden determinar mediante análisis genético y de citometría de
flujo. El mAb 7D5 reconoce los componentes de la superficie de la NADPH oxidasa, y los pacientes con
deficiencias de gp91 phox y p22 phox pueden diagnosticarse utilizando este anticuerpo ( Fig. 7). 59 Los pacientes
con deficiencias de p47 phox y p67 phox pueden identificarse con tinción intracelular utilizando anti-p47 phoxy
p67 phox anticuerpos monoclonales específicos, respectivamente.

Fig. 7: Análisis de citometría de flujo de la oxidación con

dihidrorodamina (DHR) y expresión de p47phox, p67phox y
gp91phox en pacientes con CGD y una madre portadora. En el
ensayo de DHR, los granulocitos se analizaron utilizando DHR123
como una sonda fluorescente antes (histograma sólido) y después
de la estimulación (histograma abierto) con acetato de miristato
de forbol (primera columna de paneles). Expresión de gp91phox
en pacientes granulocitos, según se evaluó utilizando 7D5
(segunda columna de paneles). La expresión de p47phox y
p67phox en monocitos CD14 + se muestra en la tercera y cuarta
columna. Los histogramas sólidos indican anticuerpos de control
de isotipo y los histogramas abiertos representan
anticuerpos monoclonales anti-subunidad.

Conclusión

La citometría de flujo es una herramienta instrumental para la

evaluación y el diagnóstico de los PID. El uso de la citometría de
flujo proporciona resultados rápidos y, a menudo, sugiere el
diagnóstico correcto. Si bien el análisis genético ofrece un
diagnóstico definitivo, la citometría de flujo desempeña un papel
importante en la evaluación rentable de los pacientes sospechosos
de tener PID.