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ANEXO 4: IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

La identificación bacteriana se puede realizar tras el estudio de las características morfológicas, tintoriales y
bioquímicas de los microorganismos. Aunque la tinción de estructuras o tipos de colonias, son muy necesarias, no son
suficientes y para llegar una completa identificación. La identificación bioquímica se basa en las características
metabólicas específicas de cada grupo de microorganismos, la detección de ciertas enzimas, metabolitos o productos
de desecho.

Al igual que gran parte de los organismos las bacterias son capaces de modificar el ambiente que las rodea captando
sustancias necesarias para su crecimiento y liberando sustancias de desecho (enzimas, exotoxinas y otras). Las
interacciones que cada tipo bacteriano establece con el entorno, son propias y características, esta depende del
material genético de la bacteria y se expresa en un determinado fenotipo. Por ello la caracterización de estas
sustancias es fundamental en la identificación bacteriana. Con este fin el uso de medios diseñados no solo para
permitir el crecimiento si no para inhibir algunos (selectivos) o resaltar características metabólicas (diferenciales) es
determinante en lograr la identificación bacteriana patógenas en muestras clínicas u otras de interés agropecuario,
industrial o ambiental.

1.- PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Streptococcus y Staphylococcus (GRAM

POSITIVOS)
A.- DETERMINACIÓN DE ENZIMAS ASOCIADAS A LA RESPIRACIÓN
Todas las bacterias aeróbicas obtienen su energía por la respiración, en donde el oxígeno molecular actúa como
último aceptor de electrones, produciendo agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su
sistema Enzimático.

1. Prueba de la catalasa
Esta prueba tiene por finalidad detectar la presencia de la enzima catalasa, cuya función es descomponer el peróxido
de hidrógeno en agua y oxígeno. Este compuesto (H 2O2) se forma como producto terminal oxidativo de la
descomposición de azúcares y al ser muy tóxico provoca la muerte de la célula. La catalasa se encuentra en la mayoría
de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromos. Por lo general los organismos que no
poseen el sistema citocromo carecen de esta enzima y por lo tanto no pueden descomponer el peróxido de
hidrógeno.
La mayoría de las bacterias anaerobias no poseen la enzima catalasa, pero en su reemplazo poseen una enzima
flavoproteínica NADH2 Peroxidasa, que también cumple la función de descomponer el peróxido de hidrógeno,
produciendo agua solamente.

Procedimiento: Agregar 3 gotas de H2O2 (agua oxigenada) sobre un cultivo sólido de 18 a 24 hrs. de incubación.
Resultados: Si el microorganismo es catalasa positiva, inmediatamente se producirán burbujas de oxígeno.

Figura 1 : Prueba de la Catalasa (A: negativo, B: positivo)

A B

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B. HEMOLISIS
Muchos microorganismos son capaces de crecer en agar sangre y cuando lo hacen responden de diferente manera
según realicen o no la lisis de los glóbulos rojos (hemólisis) producida por la acción de una enzima llamada hemolisina.

La hemólisis α es una hemólisis incompleta que crea un color verdoso alrededor de las colonias respectivas en cultivos
en agar de sangre. Las bacterias α-hemolíticas como por ejemplo S. viridans y S. pneumoniae, atacan los eritrocitos y
descomponen la hemoglobina pero no producen la hemolisina así que en las zonas verdes se encuentran todavía
eritrocitos enteros. El color resulta de la reducción de la hemoglobina a biliverdina.
La hemólisis β es la denominación de la hemolisis completa y decolora la zona alrededor de la colonia en agar de
sangre. Bacterias que muestran este comportamiento producen estreptolisina S u O y lisan todos los eritrocitos.
Descomponen la hemoglobina completamente. En la imagen a la izquierda vemos este tipo de hemólisis; ejemplos son
S. pyogenes y agalactiae.
La Hemólisis γ es un término que expresa la ausencia de hemólisis en los cultivos como es el caso en de la especie S.
bovis y Enterococos sp.

Figura 7: Tipos de hemolisis presentes en gram positivos

C. SENSIBILIDAD A ANTIBIOTICOS

1. Bacitracina
Prueba utilizada para la diferenciación de estreptococos beta hemolíticos del grupo A de otros estreptococos beta
hemolíticos. La bacitracina es un antibiótico que inhibe la síntesis de pared celular bacteriana, y a la concentración que
se encuentra en los discos (0.04 U) inhibe el crecimiento de los estreptococos beta hemolíticos del grupo A de
Lancefield pero no inhibe el desarrollo de otros estreptococos beta hemolíticos. Los micrococcus y los estomatococcus
también son inhibidos, mientras que los estafilococos coagulasa negativo son resistentes.

Procedimiento
La muestra debe haberse cultivado en medio de cultivo líquido de densidad 1,5x10 8 UFC/ml (McFarland 0,5), Si no se
dispone de éste patrón, puede realizarse, a partir de un cultivo denso, diluir hasta obtener una leve turbidez. Con una
tórula se toma la muestra y luego, sembrar en la mitad de la placa, pasando varias veces sobre el medio de cultivo. En
la otra mitad siembre una línea directamente desde el medio de cultivo.
Resultados
Un resultado sensible, es presuntivo de la presencia de estreptococo grupo A. La sensibilidad está determinada por un
halo de inhibición alrededor del disco, independiente del diámetro de dicho halo.

2. Optoquin
Prueba que permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de Streptococcus viridans (resistente).
Las colonias de Streptococcus pneumoniae son inhibidas por 5 µg de optoquina contenida en un disco de papel de
filtro aplicado sobre la superficie de una placa de agar sangre. Las colonias de S. pneumoniae son mucoides o
crateriformes. Colocar un disco de optoquina sobre el inóculo. Incubar toda la noche en CO2 5-10% a 35°C. Examinar
la placa para observar cualquier zona de inhibición alrededor del disco de optoquina. Medir el diámetro de la zona de
inhibición incluyendo el diámetro del disco.

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Procedimiento
La muestra debe haberse cultivado en medio de cultivo líquido de densidad 1,5x10 8 ufc/ml (McFarland 0,5), Si no se
dispone de éste patrón, puede realizarse, a partir de un cultivo denso, diluir hasta obtener una leve turbidez. Con una
tórula se toma la muestra y luego, sembrar en la mitad de la placa o una placa completa según lo que su profesor le
indique, pasando varias veces sobre el medio de cultivo. En la otra mitad siembre una línea directamente desde el
medio de cultivo.
Resultados
Una zona de inhibición mayor o igual de 14 mm es presuntiva para Streptococcus pneumoniae. Si no se observa zona
de inhibición es compatible con estreptococos alfa hemolíticos diferentes al Streptococcus pneumoniae (generalmente
S. viridans). Las zonas de inhibición inferiores a 14 mm de diámetro son cuestionables para Streptococcus pneumoniae
y deben ser confirmadas por la prueba de solubilidad en bilis.

3. Novobiocina
La novobiocina es un curioso y viejo antibiótico natural (obtenido en 1956) al que se reconocen varios tipos de
mecanismos de acción, que al haberse aislado de varias fuentes ha recibido varios nombres. Un disco de papel con
una carga de 5 microgramos permite diferenciar Staphylococcus saprophiticus que es resistente, de Staphylococcus
epidermidis. Como el 98% de los estafilococos coagulasa negativos aislados en clínica son de las especies S.
epidermidis y S. saprophyticus, el uso dos pruebas sencillas. Coagulasa (S. aureus es coagulasa +) y sensibilidad a
novobiocina facilita la identificación de los estafilococos patógenos.

Procedimiento: La sensibilidad al antibiótico Novobiocina se utiliza para distinguir diferentes especies de estafilococo.
Se aísla una pequeña cantidad de colonia bacteriana del paciente y se la coloca en platos medios de cultivo con el
antibiótico novobiocina. La presencia de cultivo después de una incubación a 98.6 grados Fahrenheit (37° C) por 18
horas indica la presencia de las especies saprofitas de estafilococos.
Resultado: La ausencia de una zona de inhibición es presuntiva para S. epidermidis y S. saprophyticus.

D.- IDENTIFICACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE Staphylococcus mediante Agar Manito Sal

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado

para el aislamiento y diferenciación de estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de
estafilococos patogénicos a partir de muestras
clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros
materiales de importancia sanitaria. También, este
medio puede utilizarse para el cultivo de especies
halófilas de Vibrio, si no se dispone de medios
apropiados.

Se trata de un medio altamente selectivo debido a

su alta concentración salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando
el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa
negativos, presentan colonias rodeadas de una zona
roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se
repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y
minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta
concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador
de pH. Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos,
con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en
altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el
manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no
fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.

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2.- PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACILOS GRAM NEGATIVOS (2 PARTE)

A.- UTILIZACIÓN DE FUENTES DE CARBONO (BATERIAS BIOQUÍMICAS)

1.- Prueba del Agar TSI (Triple Sugar Iron)

Con esta prueba se determina si un microorganismo es capaz de utilizar glucosa, lactosa o ambos azúcares, con
producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico. Este medio contiene
glucosa al 0,1%, lactosa al 1%, peptonas y rojo fenol como indicador de pH. También contiene sulfato de amonio
férrico y tiosulfato de sodio para detectar la producción de H 2S. Algunos microorganismos tienen la facultad de utilizar
ambos azúcares, otros solamente la glucosa y otros no son capaces de utilizar ninguno. En el tendido (la parte aerobia
del tubo) la glucosa es oxidada completamente produciendo CO2, H2O y energía. En la parte anaerobia del tubo (la
inferior), la glucosa es fermentada produciendo ácidos. En el caso de la lactosa, al estar compuesta por glucosa y
galactosa, primero debe ser desdoblada por medio de la enzima β-galactosidasa.

Procedimiento: Se debe realizar, primero, una siembra en picadura en la parte inferior del tubo e inmediatamente
una siembra en estría en el tendido. Los tubos se deben incubar por 24 hrs a 35-37°C

Resultados, puede haber alteraciones al leer posterior a las 48 horas:

K/A (superficie alcalina sobre fondo ácido) El

Figura 2: Resultados Medio TSI
microorganismo ha sido capaz de utilizar solamente
la glucosa, tanto aeróbica como anaeróbicamente.
Como la glucosa está a una concentración baja, a las
24hrs, el tiempo de lectura, este carbohidrato ya se
ha consumido, por lo que el microorganismo
comienza a utilizar las peptonas del medio,
produciendo amoníaco, alcalinizando el medio (color
fucsia). En la parte anaerobia, si bien también se
acabó la glucosa, los metabolitos ácidos producidos
por la fermentación son muy estables, manteniendo
la acidez del medio (color amarillo).
A/A (superficie ácida sobre fondo ácido) El
microorganismo ha sido capaz de utilizar ambos
carbohidratos, tanto aeróbica como
anaeróbicamente. Una vez que ha consumido la
glucosa, comienza a utilizar la lactosa, que por estar
a una concentración mayor, a las 24 hrs (tiempo de
lectura) todavía está presente este carbohidrato en
A/A G+ K/A K/A H2 S K/K el medio, manteniéndose la acidez de éste.
K/K (superficie alcalina sobre fondo alcalino) El
microorganismo NO ha sido capaz de utilizar ni glucosa ni lactosa. Por lo que utiliza directamente las peptonas del
medio, tanto aeróbica como anaeróbicamente. Si utiliza las peptonas sólo en forma aeróbica, el resultada será K/sin
cambio.

B.-Prueba del Agar LIA (Agar-Hierro-Lisina).

Es un medio diferencial que permite identificar enterobacterias, siendo especialmente útil en la identificación de
Salmonella y Proteus. Con esta prueba se desea determinar si el microorganismo posee la capacidad de descarboxilar
o desaminar el aminoácido LISINA. El medio contiene glucosa (dextrosa) que es rápidamente fermentada por el
microorganismo, produciendo acidificación que se representa por el cambió de color de púrpura a amarillo del medio.
En las siguientes horas de incubación, aquellos microorganismos que producen rápidamente la descarboxilación de la
lisina, provocan una subida del pH de ácido a alcalino, virando el indicador de amarillo a púrpura nuevamente
(púrpura de bromocresol). En cambio, aquellos capaces de desaminar la LISINA, provocan un descenso del PH (ácido),
tornando un color rojo al medio. Además se puede detectar producción de ácido sulfhídrico que queda evidenciado
por la formación de un precipitado negro en el fondo del tubo y de gas por la formación de burbujas o agrietamiento
del agar.

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Procedimiento: Se debe realizar, primero, una siembra en picadura en la parte inferior del tubo e inmediatamente
una siembra en estría en el pico de flauta. Los tubos se deben incubar por 24hrs a 35º-37ºC.

Figura 3: Resultados Agar LIA Resultados, puede haber alteraciones al leer posterior a las
48 horas:
K/A (superficie alcalina sobre fondo ácido). Si el
microorganismo es capaz de fermentar la glucosa virara el
indicador de púrpura a amarillo(A); K se debe a que el
microorganismo fue capaz de descarboxilar la lisina,
provocando un viraje del indicador de amarillo a púrpura lo
que se evidencia principalmente en el pico de flauta del tubo.
Además puede haber formación de gas y ácido sulfhídrico en
el fondo del tubo.
R/A (Rojo en la superficie y amarillo en el fondo). Si el
microorganismo es capaz de fermentar la glucosa, el medio se
tornara amarillo; si posteriormente ocurre una deaminacion
del aminoácido lisina el medio en la punta se tornara rojo.
S Además puede haber formación de gas y ácido sulfhídrico en
K/K K/A R/A K/A H 2 el fondo del tubo.

C.-Prueba del MIO (Movilidad-Indol-Ornitina).

Es un medio diferencial que se utiliza en la identificación de Enterobacterias en base a su movilidad, actividad de la
enzima Ornitina descarboxilasa y la producción de Indol. Como se trata de un agar semi-sólido, la movilidad se
demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que difunde desde la línea de inoculación. La reacción
de la Ornitina se indica mediante un color púrpura en todo el medio, este color puede variar de intensidad y puede
blanquearse a un color pálido debido a la reducción del indicador. La reacción se debe a que el microorganismo
fermenta la dextrosa del medio, reduciendo su PH, esta condición ácida origina que el indicador púrpura de
Bromocresol se vuelva amarillo y proporcione las condiciones óptimas para la descarboxilación de la Ornitina.
Si ocurre esta reacción el pH sube como resultado y el indicador se vuelve púrpura. Los cultivos negativos a la Ornitina
producen un tubo amarillo que puede ser púrpura en la parte superior. El Indol se puede detectar por la acción que
tendrá la enzima triptofanasa sobre el triptófano obtenido de las peptonas, lo cual se aprecia al añadir al medio
reactivo de Kovacs, en donde la reacción positiva formara un halo de color rojo en la superficie. De lo contrario solo se
formara un halo de color amarillo indicando así que la reacción del Indol es negativa.

Procedimiento
Figura 4: Prueba del Indol
A: Ornitina negativo Sembrar la muestra de microorganismo en estudio por picadura con asa
B: Ornitina Positivo recta, en el tubo que contiene el medio semi-sólido. Incubar a 37°C durante
48hrs.

A B Resultados
Descarboxilación de la Ornitina produce una coloración púrpura en el medio;
de lo contrario el medio quedará de color amarillo debido a la utilización de
la dextrosa. Prueba positiva para movilidad: Los microorganismos móviles
migran en la línea de siembra y difunde en el medio provocando turbidez.
Prueba negativa para movilidad: Crecimiento bacteriano en línea de siembra,
el medio circundante se mantiene claro.

Para observar si es Indol positivo o negativo, se agregará, una vez incubado,

unas gotas de reactivo de Kovacs. Si la muestra es positiva el reactivo que es
de color amarillo, variará a un color rojo, formando un anillo en la superficie
del medio.
Para evidenciar movilidad o ausencia de ella, se observará el trazo del
pinchazo. Si se logra observar una línea, en donde crece la bacteria, la

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consideramos movimiento negativo, es decir, la bacteria no es capaz de movilizarse. Pero si se observa todo el medio
con turbidez, se considera movilidad positivo.

D.-Prueba del Citrato de Simmons

Figura 5: Prueba del Citrato
A: Citrato negativo
B: Citrato positivo
En el medio de cultivo, existen sales de amonio inorgánicas como única fuente de
nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos
componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato
forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico, y el azul de bromo timol es el indicador de pH, que
vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a
que los microorganismos capaces de utilizar citrato como única fuente de
carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en
aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido
tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.

Procedimiento
Sembrar la muestra en estría en el pico de flauta. Incubar por 24hrs a 35º-37ºC.
Resultados
El medio, es un principio, es de color verde y cuando el microorganismo utiliza el citrato como única fuente de
carbono, vira a color azul por alcalinización de él. De lo contrario, si no es capaz de utilizar citrato como única fuente
de carbono, permanece del mismo color original, es decir, verde.

E.-Prueba Urea de Christensen

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el

Figura 6: Prueba la ureasa
A: Ureasa negativo
B: Ureasa positivo
A B
desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico,
y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por
medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de carbono. Estos
productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo.
En este medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la
velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la
urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

Procedimiento
Sembrar la muestra en estría en el tendido. Incubar por 24hrs a 35º-37ºC.
Resultados
El medio, es un principio, es de color amarillo. Si nuestro microorganismo posee la
enzima ureasa, podrán hidrolizar la urea y debido al indicador en el medio, virará
de amarillo a rosado o rojo, de ésta forma consideramos la prueba como positiva.
Si el medio se mantiene de color amarillo, la prueba es negativa.

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B.- DIFERENCIACIÓN DE GRAM NEGATIVOS MEDIANTE AGAR CROMOGENICO

En los últimos años, se han producido avances importantes en la

formulación de los medios de cultivo diferenciales con la aparición de
medios Cromogenicos. Estos medios incluyen en su composición
sustratos Cromogenicos de enzimas específicas bacterianas.

Cuando la enzima actúa sobre estos cromógenos, estos sufren un

cambio en su estructura, formándose una nueva estructura molecular
coloreada. La interacción entre los microorganismos y los sustratos
cromogénicos, depende del tipo de sustrato usado, pues la sustancia
coloreada producida puede quedar absorbida en el interior de la célula
bacteriana coloreando la colonia o difundir en el medio de cultivo
produciendo un cambio de color en éste.

Procedimiento
Sembrar desde su muestra, con asa curva, utilizar siembra por estrías

Resultados
Dependerá del fabricante del medio de cultivo, Consulte la guía de colores del medio Cromogenico respectivo.

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