La curcumina disminuye efecto Warburg en las células

cancerosas por abajo de la regulación piruvato quinasa M2 a

través de la inhibición de mTOR- HIF1 α
RESUMEN
El efecto de Warburg es un distintivo emergente de las células cancerosas con
piruvato quinasa M2 (PKM2) como su regulador clave. La curcumina es un
compuesto anticancerígeno ampliamente estudiado, sin embargo, su papel para
afectar el metabolismo del cáncer aún no se conoce bien. Aquí, mostramos que la
curcumina inhibe la captación de glucosa y la producción de lactato (efecto de
Warburg) en una variedad de líneas celulares de cáncer al disminuir la expresión de
PKM2, a través de la inhibición del eje mTOR-HIF1α. El silenciamiento estable de
PKM2 reveló que se requiere PKM2 para el efecto de Warburg y la proliferación de
células cancerosas. La sobreexpresión de PKM2 anuló los efectos de la curcumina,
demostrando que la inhibición del efecto de Warburg por la curcumina está mediada
por PKM2. La alta expresión de PKM2 se correlacionó fuertemente con una pobre
supervivencia general en el cáncer, lo que sugiere el requisito de PKM2 en la
progresión del cáncer. El estudio revela el novedoso efecto inhibitorio mediado por
PKM2 de la curcumina sobre las capacidades metabólicas de las células
cancerosas. Por lo que sabemos, este es el primer estudio que vincula la curcumina
con la glucólisis del cáncer impulsada por PKM2, por lo que ofrece nuevas
perspectivas sobre el mecanismo de su actividad anticancerígena.

Las prioridades metabólicas de las células cancerosas difieren notablemente de las

células normales, proporcionando así una nueva ventana terapéutica. La
reprogramación metabólica en células cancerosas apoya su crecimiento,
supervivencia, proliferación y mantenimiento. En la década de 1920, Otto Warburg
observó que las células tumorales producen grandes cantidades de lactato, incluso
cuando hay suficiente oxígeno presente, fenómeno conocido como efecto de
Warburg o glucólisis aeróbica. El efecto de Warburg se caracteriza por una alta
captación de glucosa y liberación de lactato, y ahora se considera un sello distintivo
de casi todos los tumores. Esta adaptación metabólica beneficia a las células
cancerosas en la supervivencia a través de condiciones hipóxicas, que se
encuentran comúnmente en los tumores, y para apoyar sus requerimientos
anabólicos. La tendencia de las células cancerosas a absorber grandes cantidades
de glucosa se explota en la detección clínica de tumores mediante la exploración
con tomografía por emisión de positrones (desodorredoxiglucosa
18fuorodeoxyglucose). Se sabe que las mutaciones hiperactivadoras en la
señalización de crecimiento inducen la expresión de enzimas que son vitales para
el metabolismo del cáncer. El interés en estudiar el metabolismo del cáncer se ha
reavivado recientemente con una explosión en el número de publicaciones en la
última década. Ahora, el metabolismo de las células cancerosas se considera un
punto de acceso terapéutico para las intervenciones dietéticas y farmacológicas.

Estudios extensos han demostrado que la piruvato quinasa M2 (PKM2) es uno de

los reguladores críticos del efecto de Warburg. En consecuencia, PKM2 se expresa
altamente en células en proliferación como células tumorales y embrionarias. PKM2
es una de las cuatro isoformas de la piruvato quinasa: PKL, PKR, PKM1 y PKM2.
El cambio hacia la isoforma PKM2 es un requisito previo para la glucólisis
aeróbica16. Se ha demostrado que el factor de transcripción oncogénico c-Myc
controla el empalme alternativo mutuamente exclusivo del ARNm de PKM a favor
de PKM2. La expresión de PKM2 se ha utilizado como marcador tumoral. Nosotros
y otros hemos informado previamente que la PKM2 está asociada con el
metabolismo y el crecimiento de tumores. Varios estudios han sugerido PKM2 como
un objetivo terapéutico para el tratamiento del cáncer. Por lo tanto, es pertinente
evaluar los fármacos que podrían suprimir la expresión de PKM2, inhibiendo así el
metabolismo del cáncer.

La curcumina (diferuloylmethane) es un conocido compuesto fitopolifenólico aislado

del rizoma de la planta Curcuma longa (Zingiberaceae) 26. La curcumina es
considerada como una planta medicinal valiosa en los sistemas de medicina de la
India. Numerosos estudios han demostrado las propiedades anticancerígenas de la
curcumina en una amplia variedad de líneas celulares y animales27–33. Las
principales características de la carcinogénesis han demostrado ser inhibidas por la
curcumina34. Se han propuesto varios mecanismos para las actividades
anticancerígenas de la curcumina, incluida la inducción de apoptosis34,
estabilización de p5335, mTOR33, Wnt36, Notch37, PI3K38, inhibición de
señalización, activación de AMPK39, inhibición del ciclo celular40, inhibición de
oncogenes41, desactivación de NF-kB42, inhibición de la metástasis43, inhibición
de la angiogénesis44, regulación de miARN45, daño y reparación del ADN46. Sin
embargo, el efecto de la curcumina sobre el metabolismo del cáncer, una
característica emergente del cáncer, sigue siendo desconocido.

Aquí, investigamos el efecto de la curcumina en el metabolismo del cáncer e

informamos los nuevos efectos inhibitorios mediados por PKM2 de la curcumina
sobre el efecto de Warburg. Nuestros resultados identifican un nuevo mecanismo
anticancerígeno de la curcumina y avalan su importancia terapéutica en la inhibición
del cáncer.
Figura 1. Efecto dependiente de la dosis de la curcumina sobre el efecto Warburg.
Alta captación de glucosa y producción de lactato. también conocido como efecto
Warburg, es una característica distintiva de las células cancerosas necesaria para
apoyar la proliferación de las células cancerosas. Se redujo la captación de
glucosa (a) y la liberación de lactato (b) por células H1299, MCF-7, HeLa y PC3.
significativamente después del tratamiento con curcumina en comparación con
HEK293 donde el cambio en la glucosa y el lactato no fue significativo. Se
utilizaron diferentes dosis de curcumina (2,5, 5, 10 y 20 μM) durante 24 horas para
fines de tratamiento. Se observó una disminución máxima en el efecto de Warburg
a 20 µM. Las barras de error representan la media ± SD.

Resultados:

La curcumina inhibe el efecto de Warburg en las células cancerosas.

El efecto de la curcumina sobre el efecto de Warburg se estudió midiendo la tasa
de captación de glucosa y la producción de lactato en líneas celulares de cáncer:
pulmón (H1299), mama (MCF-7), cervical (HeLa) y próstata (PC3) y riñón
embrionario humano ( HEK) 293 células, tomadas como control. Para el estudio se
utilizaron concentraciones sub tóxicas de curcumina de 0 a 20 μM durante 24 horas.
Se observó una inhibición significativa en la captación de glucosa y la liberación de
lactato en las cuatro líneas celulares, sin embargo, no se observó una disminución
apreciable en el efecto de Warburg en las células HEK 293 (Fig. 1a, b). La
disminución dependiente de la dosis en el efecto de Warburg comenzó a 2,5 µM
con una disminución máxima a la curcumina 20 µM.

La curcumina regula a la baja PKM2 mediante la inhibición del eje mTOR-

HIF1α.
Para comprender la disminución en el consumo de glucosa y la producción de
lactato por líneas celulares tratadas con curcumina, estudiamos el estado de PKM2,
un regulador crítico del efecto de Warburg. Dado que se observó una disminución
máxima en el efecto de Warburg a la curcumina a 20 μM, utilizamos esta
concentración para estudiar el efecto de la curcumina en el estado de PKM2 en las
líneas celulares H1299, MCF-7, HeLa y PC3. El tratamiento con curcumina redujo
sustancialmente el ARNm y la proteína PKM2 según se evaluó mediante qRT-PCR
e inmunotransferencia (Fig. 2a, b y Figura Suplementaria S2). Además, en un
intento por dilucidar el mecanismo responsable de la regulación por disminución de
PKM2, estudiamos la inhibición de la vía mTOR / HIF1α en el tratamiento con
curcumina. Con frecuencia, mTOR se encuentra hiperactivado en varios tipos de
cáncer47 y se ha demostrado que la curcumina inhibe la señalización de mTOR48.
HIF1α es un activador transcripcional conocido de PKM213,49. Tras el tratamiento
con curcumina, la expresión disminuida de PKM2 coincidió con la disminución de la
treonina 389 (T389) en la fosforilación de la quinasa p70S6 y la disminución de la
proteína HIF1α, lo que sugiere que la curcumina regulaba la PKM2 al inhibir la
señalización de mTOR / HIF1α. Además, la inhibición de la expresión de PKM2 por
la rapamicina (un conocido inhibidor de mTOR), validó aún más que la curcumina
disminuyó la PKM2 a través de la inhibición de la señalización de mTOR / HIF1α
(Fig. 2c). También se encontró que el ARNm de GLUT1 y HKII disminuía con el
tratamiento con curcumina, lo que sugiere la contribución de estas enzimas, además
de PKM2, en la inhibición del efecto de Warburg en el tratamiento con curcumina
(Figura Suplementaria S1).

La curcumina disminuye la viabilidad de las células cancerosas.

Para analizar si la inhibición de la PKM2 y el metabolismo del cáncer por la
curcumina contribuyeron a la reducción de la viabilidad, el crecimiento de las células
HEK293, H1299, MCF-7, HeLa y PC3 se evaluó durante el período de 24–72 horas
en presencia de curcumina 20 μM. La tendencia decreciente de la viabilidad se
observó de manera dependiente del tiempo (Fig. 3a). La disminución máxima en la
viabilidad de todas las líneas celulares se observó a las 72 horas, aunque; caída en
la viabilidad comenzó a las 24 horas. Sin embargo, no se observó una disminución
significativa de la viabilidad en las células HEK 293 de control.
El silenciamiento de PKM2 disminuye el efecto de Warburg y la viabilidad
celular.
Conjeturamos que la disminución en el efecto de Warburg sobre el tratamiento
con curcumina se debe, al menos en parte, a la disminución de la expresión de
PKM2. Con este fin, la PKM2 se silenciaba de forma estable en células H1299
utilizando un método de shRNA. La eficiencia de derribo se verificó mediante
transferencia de Western (Fig. 4a). Se midieron tereafer, consumo de glucosa y
liberación de lactato. Las células H1299 transfectadas con shPKM2 mostraron una
reducción significativa en el consumo de glucosa y la producción de lactato, lo que
indica que PKM2 es crucial para el efecto de Warburg (Fig. 4b, c). Estos
resultados validaron que la curcumina inhibía la glucólisis aeróbica al regular a la
baja la expresión de PKM2. Además del efecto de Warburg, el silenciamiento de
PKM2 también redujo la viabilidad de las células H1299 (Fig. 4d), lo que sugiere
que el efecto de Warburg impulsado por PKM2 es esencial para la supervivencia
de las células cancerosas.

La sobreexpresión de PKM2 revierte el efecto de la curcumina sobre el

metabolismo de las células cancerosas.
Con el fin de validar aún más que los efectos inhibitorios de la curcumina en la
glucólisis del cáncer son mediadas por PKM2, la PKM2 se sobreexpresó
transitoriamente en células H1299 en ausencia y presencia de curcumina 20 µM.
Las células H1299 se transfectaron con control vectorial o con myc-PKM2. La
confirmación de la transfección se realizó mediante inmunotransferencia utilizando
anticuerpos anti-myc (Fig. 5a). La actividad de la curcumina se midió controlando la
inhibición de la fosforilación de p70S6 quinasa T389. Como era de esperar, la
sobreexpresión de PKM2 resultó en un efecto de Warburg aumentado incluso en
presencia continua de curcumina 20 μM (Fig. 5b, c). Los resultados demostraron
que la expresión ectópica de PKM2 reprimió los efectos de la curcumina en la
absorción de glucosa y la liberación de lactato, lo que demuestra que la PKM2 es
un objetivo de la curcumina. En obsesión con la curcumina, las células transfectadas
con PKM2 en comparación con el vector mostraron el aumento esperado en la
captación de glucosa y la producción de lactato. De acuerdo con la Fig. 1, el control
del vector tratado mostró una disminución de la glucosa y el lactato en comparación
con el control del vector no tratado.
La expresión de PKM2 es más alta en el cáncer y se asocia con una
supervivencia general deficiente.
Para investigar los niveles de expresión de PKM2 en tejidos tumorales, se utilizó la
base de datos de Oncomine. En el estudio de cáncer de pulmón de Selamat que
comparó la expresión de PKM2 en pulmón normal (n = 58) con el tejido de
adenocarcinoma de pulmón (n = 58), se encontró que la expresión de PKM2 es 2,5
veces mayor en el adenocarcinoma de pulmón en comparación con el pulmón
normal (Fig. 6a) 50. De manera similar, el conjunto de datos de Hou también reveló
un aumento de 2,3 veces en la expresión de PKM2 en el carcinoma de pulmón de
células escamosas en comparación con el pulmón normal (n = 65) (Fig. 6a) 51.
Además, realizamos el análisis de Kaplan-Meier utilizando el portal en línea
(www.kmplot.com) para correlacionar la expresión de PKM2 con la supervivencia
general de los pacientes con cáncer. Una mayor expresión de PKM2 se correlacionó
fuertemente con una supervivencia global pobre en pacientes con cáncer de pulmón
y gástrico (Fig. 6b) 52,53. Estos resultados sugieren que una mayor expresión de
PKM2 está asociada con el cáncer y puede representar un marcador pronóstico útil.

Figura 2. La expresión de PKM2 es inhibida por la curcumina a través del eje mTOR
/ HIF1α. (a) Reducción sustancial en el ARNm de PKM2 en células H1299, MCF-7,
HeLa y PC3 tratadas con 20 µM durante 24 horas. (b) Inmunotransferencia de
células H1299, MCF-7, HeLa y PC3 que muestran una reducción coincidente en
PKM2, HIF1α y fosforiladop70S6K (T389), en tratamiento con curcumina. (c)
Tratamiento con inhibidor de mTOR estándar-rapamicina también mostró un patrón
de expresión similar. Los resultados sugieren que la curcumina inhibe la expresión
de PKM2 a través de la inhibición de mTOR y HIF1α. Las barras de error en el
gráfico de ARNm de PKM2 representan la media ± SD.
Figura 3. Disminución de la viabilidad celular en el tratamiento con curcumina.
(a) El tratamiento con curcumina disminuyó la viabilidad de H1299, MCF-7, HeLa y
PC3 en el transcurso de 24, 48 y 72 horas. Disminución de la viabilidad de cuatro
líneas celulares de cáncer son significativamente más altas en comparación con las
células HEK293 de control. Máxima disminución de la viabilidad de todas las líneas
celulares estudiadas se observaron a las 72 horas. Las barras de error representan
la media ± SD.

Figura 4. La caída de PKM2 reduce la captación de glucosa, la producción de

lactato y la viabilidad celular. PKM2 fue silenciado de forma estable en células
H1299 usando shRNA lentiviral como se describe en los métodos. (a) Confirmación
de caída de PKM2 por transferencia Western, (b) disminución de la captación de
glucosa (c) producción de lactato y (d) se observó la viabilidad celular. Error Las
barras en el gráfico de ARNm de PKM2 representan la media ± SD.
Figura 5. La sobreexpresión de PKM2 revirtió los efectos de la curcumina en la
glucólisis del cáncer. (a) Inmunotransferencia confirmando la sobreexpresión de
myc-PKM2 en células H1299 expuestas continuamente a curcumina 20 µM. Casi la
disminución de p-p70SK (T389) tanto en el vector como en las células H1299
transfectadas con PKM2 confirmó la inhibición de mTOR por curcumina Aumento
de la captación de glucosa (b) y la liberación de lactato (c) en células H1299 que
sobreexpresan PKM2, en comparación Al vector transfectado, en ausencia y
presencia de curcumina.

Figura 6. La expresión de PKM2 es alta en el cáncer y se correlaciona con una

supervivencia general deficiente. (a) Diagramas de caja de Oncomine que
representa la mayor expresión de PKM2 en adenocarcinoma de pulmón y de
carcinoma escamoso de pulmón , en comparación con el pulmón normal. (b) Curva
de supervivencia general (SG) de Kaplan-Meier de pacientes con cáncer de pulmón
Expresando bajo y alto ARNm de PKM2. (Grupo de baja expresión PKM2, n = 360;
Grupo de alta expresión PKM2, n = 360) y la curva de supervivencia general (SG)
de Kaplan-Meier de pacientes con cáncer gástrico que expresan bajo y alto ARNm
de PKM2. (Grupo de baja expresión PKM2, n = 269; Grupo de alta expresión PKM2,
n = 607).

Discusión:
La transformación metabólica en las células cancerosas ha ganado una enorme
atención en el pasado reciente por su inmenso potencial Como opción terapéutica
viable. Debido a las vulnerabilidades metabólicas de las células cancerosas, varios
medicamentos que son dirigidos al metabolismo del cáncer se encuentran en
ensayos clínicos. Al igual que con cualquier fármaco quimioterapéutico, los
fármacos dirigidos al metabolismo de Las células cancerosas pueden tener efectos
secundarios que podrían deteriorar la salud y la calidad de vida del paciente. Por el
contrario, Los compuestos naturales a base de plantas tienen relativamente menos
toxicidad y efectos secundarios. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de
encontrar Compuestos más naturales por sus efectos inhibitorios sobre las
características emergentes del cáncer, como el metabolismo. Hasta la fecha, se ha
demostrado que muy pocos fitoquímicos se dirigen al metabolismo del cáncer.
Claramente, hay una necesidad de obtener Compuestos más naturales por sus
efectos negativos sobre el metabolismo del cáncer. Las enzimas metabólicas
podrían ser puntos de acceso terapéuticos. siempre que sean reguladores clave de
las vías metabólicas que operan en las células cancerosas. Gran cantidad de la
evidencia sugiere que la PKM2 es el regulador clave del metabolismo del cáncer,
por lo tanto, apunta a la PKM2 para inhibir el cáncer.
La curcumina ha sido bien estudiada como un inhibidor de una variedad de
características del cáncer; Sin embargo, sus efectos sobre el metabolismo del
cáncer permanecieron sin dilucidar. Demostramos que la curcumina inhibe el
metabolismo del cáncer en una manera PKM2-dependiente. Los resultados
presentados aquí revelan una nueva dimensión de los mecanismos
anticancerígenos de la curcumina.
Los resultados de este trabajo, junto con la literatura ya conocida sobre la
curcumina, sugieren que la curcumina inhibe la mayoría, si no todas, las
características del cáncer, lo que lo convierte en un poderoso compuesto
anticancerígeno a base de plantas. Sin embargo, Existen varias advertencias
asociadas con la estabilidad y biodisponibilidad de la curcumina, lo que dificulta su
aplicación en el ámbito clínico. Debido a la naturaleza química inestable de la
curcumina, se sabe que se degrada en pocas Horas en medios de cultivo, por lo
tanto, haciendo su biodisponibilidad abismal. No obstante, numerosos estudios han
demostrado Las propiedades anticancerígenas de la curcumina. Esto plantea la
posibilidad de papel de los productos de degradación de La curcumina contribuye a
sus efectos onco-farmacológicos.
Se encontró que el efecto de la curcumina en el efecto Warburg (Fig. 1) es
consistente en las cuatro líneas celulares de cáncer estudiado, destacando el
espectro de la curcumina como un medicamento contra el cáncer. Además, estos
resultados también apuntan al Requisito casi universal del efecto de Warburg por
cánceres sólidos para su crecimiento y supervivencia. Curiosamente, La inhibición
del metabolismo inducida por la curcumina fue evidente a una concentración baja
de 2.5 μM, lo que demuestra la sensibilidad De las células cancerosas a la
curcumina y la dependencia a la glucólisis aeróbica. En particular, los efectos
despreciables de la curcumina en la glucólisis y la viabilidad de las células epiteliales
HEK 293 sugirió que la inhibición observada del efecto Warburg por la curcumina
es específico de las células cancerosas. La disminución en el consumo de glucosa
y la producción de lactato impide el crecimiento de las células cancerosas debido a
que el flujo glucolítico proporciona una síntesis anabólica en las células cancerosas
para producir macromoléculas para las células cancerígenas hijas. Además, los
intermedios de la glucólisis actúan como precursores o intermedios. de vía
anabólica cruzada como vía de pentosa fosfato. Además, las altas tasas de
glucólisis en el cáncer también Sirve al propósito de la rápida producción de ATP,
como en el caso de los músculos durante el ejercicio intenso. Por lo tanto, es
insondable esa alta tasa de glicolíticos es una línea de vida de las células
cancerosas en división. La disminución en la expresión de PKM2 sobre el
tratamiento con curcumina explica la disminución observada en la glucólisis
aeróbica en líneas celulares tratadas con curcumina. Desde PKM2 Actúa un
regulador del flujo glucolítico, a través de su actividad de proteína y piruvato
quinasa, con los cambios en su expresión Se espera que cause cambios en el flujo
glucolítico.
En consecuencia, el silenciamiento de PKM2 suprimió el efecto Warburg y
viabilidad (fig. 3). Además, una mayor expresión de PKM2 en tejidos cancerosos y
una asociación estadísticamente significativa con la mala supervivencia general de
los pacientes con cáncer, sugirió fuertemente el papel de la PKM2 en el cáncer (Fig.
6). mTOR es un importante regulador del crecimiento y suele ser muy activo en las
células cancerosas debido a mutaciones en las vías de regulación o la propia
mTOR. El papel de mTOR en la síntesis de proteínas lo hace indispensable para la
supervivencia de las células cancerosas. La regulación de la expresión HIF1α y
PKM2 por mTOR destaca la importancia de la señalización de mTOR en la
regulación del metabolismo del cáncer (fig. 2). mTOR es un sintonizador del
metabolismo porque este último proporciona materia prima para la síntesis de
proteínas, es decir, aminoácidos y se sabe que regula la expresión de HIF1α y
PKM2. Por lo tanto, se espera que la inhibición de mTOR inhiba la PKM2 y la
glucólisis, que de otro modo apoyan Metabolismo anabólico en el cáncer. La
inhibición del efecto de Warburg produce una disminución del anabolismo y, por lo
tanto La viabilidad de las células cancerosas se ve afectada negativamente por la
curcumina (Fig. 3) y el silenciamiento de PKM2 (Fig. 4), ya que todos estos factores
convergen para suprimir la síntesis macromolecular. El papel de HIF1α en el control
de la expresión de PKM2 es Un resultado de las condiciones hipóxicas que existen
en las células tumorales. PKM2 puede conducir la glucólisis incluso en ausencia de
oxígeno, Promoviendo la conversión de piruvato a lactato a través de un mecanismo
en gran parte desconocido, por lo tanto, la inducción de PKM2 por HIF1α es una
adaptación necesaria para el crecimiento del tumor. La Anulación de los efectos
inhibitorios de la curcumina sobre La glucólisis aeróbica en las células que sobre
expresan PKM2 no solo sugiere que los efectos estén mediados por PKM2 sino
también destaca la importancia de la PKM2 para el metabolismo de las células
cancerosas (Fig. 5).
Aunque se ha demostrado que la curcumina ejerce efectos contra el cáncer a través
de una variedad de mecanismos, es importante para identificar mecanismos que
podrían ser dirigidos sin dañar las células normales. Reacondicionamiento
metabólico en las células cancerosas es uno de esos mecanismos. El trabajo
presentado aquí representa un nuevo mecanismo anticancerígeno de la curcumina
y señala la enzima responsable de mediar los efectos anticancerígenos de la
curcumina. Dado que la biodisponibilidad de La curcumina es un desafío que se
enfrenta en el contexto clínico; Los análogos estables de la curcumina deben ser
probados por su capacidad para Imita los efectos inhibitorios de la curcumina sobre
el metabolismo del cáncer.
En resumen, este estudio revela una nueva función anticancerígena de la curcumina
e invita a seguir una mayor investigación para explotar La curcumina y sus análogos
para la inhibición clínica exitosa de las adicciones metabólicas en las células
cancerosas.

Materiales y métodos de Cultivo celular y tratamiento farmacológico.

Se adquirieron líneas celulares HEK293, H1299, MCF-7, HeLa y PC3 y se mantuvo
como se describe brevemente, las líneas celulares se cultivaron en monocapa y se
pasaron de forma rutinaria 2 a 3 veces por semana. Las líneas celulares se
mantuvieron en DMEM o RPMI con 10% de FBS (Gibco) y 1% de penicilina /
estreptomicina. (Sigma) a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Curcumina 2 mM (Sigma, MO, EE. UU.) Y rapamicina 200 μM (Sigma, MO, EE. UU.)
Las soluciones madre se prepararon utilizando DMSO y se almacenaron a -80 ° C,
hasta su uso posterior. Antes de tratamiento farmacológico, las células se dejaron
crecer durante 24 horas seguidas de un tratamiento con DMSO (control simulado)
o curcumina durante 24–72 horas.
Ensayos metabólicos.
Para la glucosa y el lactato: los medios gastados se recolectaron y se centrifugaron
para eliminar cualquier residuo celular, y además fueron desproteinizados usando
ácido tricloroacético (TCA) al 5% , la glucosa y el lactato se analizaron usando kits
colorimétricos (BioVision, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. Se
prepararon curvas de calibracion estándar y de fondo Se hicieron correcciones.
Todas las medidas se normalizaron a números de células. Tasa de captación de
glucosa y producción de lactato se midió y se expresó como nmol / millón de células
/ minuto.
Western blot y qRT-PCR.
Se preparó lisado de células completas en tampón RIPA modificado que contenía
Tris-Cl 50 mM pH 7.2, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio al 0.5%, SDS al 0.1%,
Triton X-100 al 1% con adicion de 1 mM de ditiotreitol (DTT), fluoruro de
fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, proteasa y cóctel inhibidor de la fosfatasa (Geno
Biosciences, USA). Los lisados se centrifugaron y se cuantificó el sobrenadante que
contenía proteína.
utilizando el kit de BCA (ácido bicincinínico) (Thermo Scientific, EE. UU.) según el
protocolo del fabricante. Una cantidad igual de la proteína se cargó y se separó
mediante SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (mdi, EE. UU.)
y se sondearon con anticuerpos primarios relevantes. La membrana se incubó con
el anticuerpo secundario apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente y las
proteínas se detectaron utilizando Luminata Forte (Millipore, EE. UU.). el análisis de
Densitometría se llevó a cabo utilizando el software ImageJ para examinar el cambio
relativo en la expresión génica luego de la normalización con β-actina. Los
anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-PKM2, anti-HIF1α, anti-myc, anti-p-
p70S6K (T389), anti-p70S6K y anti-β-actina (Cell Signaling Technology, EE. UU.).
Para qRT-PCR: el ARN total se extrajo de líneas celulares que utilizando el reactivo
TRI (Sigma, MO, EE. UU.) seguidas de una transcripción inversa al ADNc utilizando
Superscript III, kit de transcriptasa inversa (Life technologies, USA). Se utilizó la
máquina en tiempo real BIORAD CFX96 Touch para Análisis de RT-PCR utilizando
la mezcla maestra de PCR verde SYBR (Applied Biosystems). Método de TC
comparativo (2 − ΔΔCT) Se utilizó para el cálculo de la expresión génica relativa. La
actina se utilizó como control endógeno. Primers utilizados para qRT-PCR los
ensayos son los siguientes: PKM2 (exón 10); adelante 5′-
TGCAATTATTTGAGGAACTCC-3 ′, inverso 5′-CACTGCAG CACTTGAAGGAG-3 '.
HKII; reenviar 5′- CCAACCTTAGGCTTGCCATT -3 ', revertir 5′-
CTTGGACATGGGAT GGGGTG-3 ′. GLUT 1; adelante 5′-
CTTTGTGGCCTTCTTTGAAGT-3 ', reverso 5′- CCACACAGTTGCTCCA CAT-3 ′.
ACTIN; adelante 5′- ACTCTTCCAGCCTTCCTTC-3 ′, inverso 5 ′ ′ -
ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3 ′.

Silenciamiento de shRNA estable y transfecciones transitorias.

Para la disminucion estable de PKM2: las partículas lentivirales se generaron como
se describe brevemente, las células HEK293T se transfectaron con un vector de
transferencia (LKO.1) que contiene shRNA, además de vectores de
empaquetamiento, psPAX y pMD2.G, utilizando Lipofectamine 3000 (ThermoFisher
Científico, ee.uu.). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las partículas
virales se recolectaron y se usaron para infectar las celulas H1299. La selección de
células infectadas se realizó en DMEM que contenía 2 μg / ml de puromicina durante
un período de 2 semanas. Para la Sobreexpresión de PKM2: se transfectaron
pcDNA-PKM2-myc o pcDNA-myc utilizando el reactivo Lipofectamine 3000
(ThermoFisher Scientific, EE. UU.), Según las instrucciones del fabricante.

Ensayo de MTT para la viabilidad celular.

La viabilidad celular se evaluó utilizando MTT 3- (4, 5-dimetiltiazol-2il) -2, 5-difenil
bromuro de tetrozolio (Sigma). Las células de crecimiento exponencial se
sembraron en una placa de 96 pocillos con Densidad de 10.000 células por pozo.
Posteriormente a la adherencia celular a la superficie de la placa de cultivo (después
de aproximadamente 12 horas), las células se trataron con curcumina 20 µM. La
viabilidad celular se midió cada intervalo de 24 horas (24 a 72 horas) lavando las
células y reemplazando con medio fresco que contiene 20 μl de MTT (5 mg / ml en
PBS) para cada pozo las placas se incubaron durante tres horas en oscuridad. Los
cristales de formazon desarrollados fueron solubilizados con 100 μl de DMSO y la
placa se mantuvo en oscuridad durante otros 5-10 min. La absorbancia se midió
utilizando un lector de microplacas (Dispositivo Molecular) a 570 nm. Las células se
sembraron por triplicado para cada grupo y el experimento se repitió
independientemente tres veces.
Análisis estadístico.
Los datos se representaron como media con SD. Prueba t de Student o
unidireccional o bidireccional, Se utilizó ANOVA con comparaciones múltiples para
calcular la significación estadística. P <0.05 fue considerado como Estadísticamente
significante. La significancia estadística se representa como: * P <0.05; ** P <0.01;
*** P <0.001.