UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

FACULTAD DE CIENCIAS
UNIDAD DE EXTENSION UNIVERSITARIA Y PROYECCION SOCIAL

Biorremediación de aguas y suelos contaminados con hidrocarburos

Bioensayos

Victor Meza: vmeza@lamolina.edu.pe

Wilfredo Baldeón: wbq@lamolina.edu.pe

16 de febrero 2019
 Que es bioensayo?
Exposición de un organismo vivo a un contaminante orgánico o inorgánico con
fines de evaluar la toxicidad y los efectos del contaminante sobre la biota (Reish &
Oshida, 1987).

El bioensayo se basa en una relación: estimulo - respuesta

Dosis - Mortalidad

Tiempo - Mortalidad

Se espera que los incrementos en las dosis o tiempos de

exposición aumenten la mortalidad o el efecto
Los bioensayos de toxicidad se clasifican en ensayos de toxicidad aguda y en
ensayos de toxicidad crónica.

La toxicidad aguda, se llevan a cabo mediante la exposición de un grupo de

individuos de una especie a una serie de concentraciones crecientes de un
xenobiótico en el laboratorio durante un breve periodo de tiempo (en relación con
la duración del ciclo vital del organismo considerado); el efecto buscado es la
mortalidad y el parámetro eco-toxicológico es la concentración letal 50 (CL50) o la
dosis letal 50 (DL50).
DOSIS: Cantidad de una sustancia que es ingerida, inhalada o absorbida a través de
la piel por un organismo. Se expresa en mg de la dosis /kg de peso corporal/día

La mortalidad es el efecto o
punto final más utilizado en los
estudios de toxicidad aguda
porque ha demostrado ser un
parámetro de sencilla
observación y fácil
interpretación (Giesy & Graney,
1989).
 Los ensayos de toxicidad
crónica evalúan los efectos
que se producen en los
organismos como resultado de
una exposición prolongada. Los
efectos más importantes son
aquellos relacionados con la
reproducción y el desarrollo
de los individuos expuestos y
los parámetros más relevantes
son NOAEL o la LOAEL.
NOAEL: “no observed adverse effects level”
LOAEL: “lowest observed adverse effect level”
Treshold dose: cantidad mínima para producir un efecto

La toxicidad crónica es la propiedad de una sustancia de causar daños a largo

plazo. Los efectos tóxicos crónicos pueden resultar de una exposición simple
severa o repetidas exposiciones a lo largo de un período. Los efectos crónicos
pueden ser: neurológicos (daño al Sistema Nervioso), mutagénicos (daño al
material genético que puede ser transmitido a futuras generaciones),
cancerígenos (que pueden causar cáncer), Sistema Reproductor (daño al sistema
reproductivo femenino/masculino) y teratogénicos (daño al embrión /feto).
 Organismos bioindicadores de contaminacion

La pulga de agua, más conocida por su nombre científico Daphnia, debe su nombre al gran
parecido externo que tiene con la pulga verdadera, aunque la pulga de agua o daphnia (foto
derecha) no es un insecto como la pulga terrestre (foto izquierda).

La Pulga de agua es un crustáceo de agua dulce con la forma de una pequeñísima

lenteja. Existen distintas especies de pulga de agua, algunas extremadamente
pequeñas con una longitud inferior a 1 mm. La pulga de agua Daphnia magna mide 2
mm en el caso del macho y 6 mm la hembra, es la especie de dafnia más frecuente.
Esta especie vive de forma salvaje en Europa, África, Asia y América del Norte, se dice
que es una especie cosmopolita. Estos animalillos tienen una vida corta, puesto que la
longevidad de la pulga de agua es de apenas 1 semana de vida, aunque esto varía
según la especie.
 Debe incidir la luz solar uniformemente y se debe respetar un ritmo diurno correcto. La
temperatura del agua debe oscilar entre 17ºC y los 22ºC. El pH neutro (pH=7).

La pulga de agua es un depredador que se alimenta filtrando el agua de algas y bacterias.

En Suiza, las dafnias vigilan a partir de ahora la calidad del agua potable que beben los
habitantes de la ciudad de Zúrich. Según los servicios industriales de Zúrich, esos pequeños
crustáceos de agua dulce son "mucho más sensibles" a la presencia de materias
contaminantes y a sus variaciones mínimas que los sistemas electrónicos de detección.

Con ese sistema de 'biovigilancia', totalmente

novedoso en Suiza, se podrá controlar y alertar
sobre eventuales concentraciones de
contaminantes en las aguas subterráneas y en
las de los lagos Lengg y Moos, que suministran
en agua potable a los habitantes de Zúrich y de
otros municipios de la región. La ciudad de
Zúrich que ya utilizaba desde hace 30 años un
sistema similar con truchas, que son, según los
expertos, menos sensibles que las pulgas de
agua. 16 marzo 2006
 Bioensayo de toxicidad aguda con plantas nativas para evaluar un derrame de petróleo
Los bioensayos con plantas constituyen una excelente herramienta en la evaluación del
riesgo ambiental. La utilización de semillas de plantas vasculares es recomendada debido
a su mayor sensibilidad.
Podemos usar Lactuca sativa, Atriplex lampa (arbusto forrjero), Prosopis denudans
(árbol leguminoso).

Índice de Germinación (IG), es un método

económico, rápido y reproducible para determinar
toxicidad de suelo, ayudando a caracterizar áreas
con suelos contaminados. La germinación de
Atriplex lampa y Prosopis denudans resultó más
resistente en los suelos contaminados de un
yacimiento petrolero que el bioindicador de
referencia utilizado (Lactuca sativa)
 Bioensayos con lombrices
Las lombrices desempeñan un papel ecológico primordial por su influencia en la
descomposición de la materia orgánica, el desarrollo de la estructura del suelo y el
ciclo de los nutrientes (Ríos, 2005). Durante su proceso de alimentación, succionan
o chupan la tierra de las galerías que excavan y digieren de ella las partículas
vegetales y animales en descomposición.
Los bioensayos con lombrices se emplean para evaluar la toxicidad de suelos
contaminados con hidrocarburos, porque de esta manera se puede predecir el
impacto de las mezclas complejas de compuestos como el petróleo e
hidrocarburos aromáticos policiclicos sobre los organismos. Estas pruebas también
son útiles para monitorear la biorremediación de suelos contaminados con
hidrocarburos, tanto en laboratorio como en campo (Salanitro, 1997; Meier et al.,
1997), ya que la reducción de la contaminación no siempre viene acompañada de
una disminución de la toxicidad del suelo debido a la transformación incompleta
de los contaminantes o a la formación de metabolitos mas toxicos (Phillips et al.,
2000).

Los bioensayos con lombrices pueden realizarse directamente con las muestras de
suelo o con sus extractos.
 Prueba de mortalidad en lombrices

Fundamento del método:

Este bioensayo es una prueba aguda, con exposición de 14 días, en la cual se mide
la mortalidad a través de la concentración letal media (CL50), la cual representa la
concentración del suelo problema que ocasiona la muerte (daño máximo) en el 50
% de las lombrices que han sido expuestas.

Organismos de prueba
Para esta pruebas se
usan lombrices Eisenia
Fetida que presenten
clitelo y con un peso
promedio de 0.30 g.

Clitelo: evidencia madurez, es más aparente en

época reproductiva. Ayuda a la cópula
segregando un moco que une los poros de ambos
progenitores. También ayuda en la segregación
de los capullos en los que depositará los óvulos y
el fluido nutritivo (albúmina) del que se
alimentarán los zigotos.
Suelo
Se recomienda realizar los bioensayos inmediatamente después de la toma de
muestras del suelo problema; pero si esto no es posible, las muestras pueden ser
preservadas a 4ºC en la oscuridad hasta 15 días en recipientes de vidrio.
El suelo debe tener un tamaño de partícula menor o igual a 4 mm.
El suelo debe presentar una humedad del 35 a 45 %.
Ejemplo: Calcular el agua requerida para que una muestra de suelo de 100 gr
tenga 45% de humedad, sabiendo que su humedad inicial es de 20%

Procedimiento
Preparación de los organismos: La prueba de mortalidad tiene una duración de 14
días. Antes de iniciar las pruebas, las lombrices deben vaciar sus intestinos, para lo
cual se depositan en cajas de Petri sobre papel filtro humedecido con agua
desionizada durante 5 hr. Finalmente se lava, seca y pesa.
Desarrollo de la prueba: En los recipientes de vidrio se
depositan 50-100 gr de suelo problema con una
humedad del 45 % y un pH entre 6 y 7. Posteriormente
se depositan 10 lombrices por recipiente y luego se
cubren con la tela sintética (evita la perdida de
humedad, pero permite que exista circulación de aire)
Los recipientes se mantienen a una temperatura de 22 ± 2ºC con luz continua.
Transcurridos los primeros 7 días, se vacía el contenido de cada recipiente en uno
nuevo y se observa el comportamiento, así como los movimientos de las lombrices
ante estímulos de tacto. Las lombrices son nuevamente depositadas en los
contenedores originales para continuar con la prueba durante los restantes 7 días.
La humedad es medida y ajustada al 45 %.
A los 14 días, las lombrices son sacadas de los recipientes y depositadas en unos
nuevos para determinar la mortalidad. Se cuentan los organismos vivos, el
movimiento y las reacciones ante los estímulos de tacto. Las lombrices que no
responden a esos estímulos se consideran muertas. También se pesan para registrar
su ganancia de peso al termino de la prueba. Finalmente, se mide la humedad y el
pH de los suelos (problema y controles).
 Cálculo de CL50
La concentración letal media (CL50):
Probit (paramétrica)
Spearman-Karber (no paramétrica)

El Análisis Probit está diseñado para ajustar un modelo de regresión en el cual la

variable dependiente Y caracteriza un evento con sólo dos posibles resultados.

Se llama función Probit a la inversa de la función de distribución o función cuantil

asociada con la distribución normal estándar.

En un experimento típico de pruebas de toxicidad aguda se tiene la siguiente

situación:
Concentración de la sustancia o dosis (d)
Numero de individuos (n)
Numero de organismos muertos o afectados (r)
Porcentaje de afectados (p)
P=(r/n)*100
 Método Spearman-Karber
Se determinan los logaritmos naturales de las concentraciones, y los datos de
mortalidad se convierten en probabilidad considerando las muertes y el numero
total de lombrices en la prueba; se establecen intervalos de los logaritmos de las
concentraciones. Para obtener la frecuencia relativa, se calcula la diferencia de las
probabilidades de muerte en el intervalo. Posteriormente se multiplica la
frecuencia relativa por la media de la concentración de los logaritmos del
intervalo, y a la sumatoria se le aplica el antilogaritmo para obtener la CL50.
 Ejemplo de la aplicación del método Spearman-Karber para calcular la
concentración letal media (CL50) de Benzopireno

El benzopireno es un hidrocarburo policíclico aromático potencialmente carcinógeno