Alteración de las válvulas bioquímicas en el metabolismo central de Escherichia coli

La manipulación del metabolismo bacteriano ha sido un aspecto importante de la biotecnología y

ha recibido una atención creciente por parte de la industria y la academia. Los pasos típicos para
diseñar un organismo para la producción de metabolitos incluyen la desregulación de las rutas
deseadas, la eliminación de enzimas que compiten y la sobreexpresión de enzimas en el vías
deseadas. Estas tareas ahora se pueden lograr mediante una variedad de técnicas de ADN
genético y recombinante. Las vías terminales son a menudo los primeros objetivos para la
ingeniería, y los resultados suelen ser alentadores. Una vez eliminados todos los cuellos de botella
en las vías terminales, los pasos de control se mueven hacia el metabolismo central, que
suministra monómeros, energía y poder reductor para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos
y otros componentes celulares. Sin embargo, las tasas metabólicas y la distribución del flujo en el
metabolismo central están bien controladas, y es probable que los intentos de alterar las vías
enfrenten la resistencia de muchos mecanismos reguladores de la célula. Para redirigir los flujos
metabólicos en el metabolismo central, es imperativo entender cómo se regulan estas vías.

Nuestro laboratorio ha estado trabajando en la regulación y la redirección del metabolismo en la

unión entre la glucólisis y el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) en Escherichia coli (Figura 1). De
particular interés son cuatro enzimas, la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (Pck), la PEP carboxilasa
(Ppc), la PEP sintasa (Pps) y la piruvato quinasa (PykI y PykII), que son responsables de cambiar
entre la glucólisis y la gluconeogénesis. Estas enzimas median las conversiones entre el
fosfoenolpiruvato (PEP), el oxaloacetato (OAA) y el piruvato, que son precursores de muchos
aminoácidos. Además, PEP y el piruvato están involucrados en el sistema de PEP: azúcar
fosfotransferasa, y OAA es un intermediario en el ciclo de TCA.

LAS VALVULAS BIOQUIMICAS

La dirección y la magnitud de los flujos entre

estos tres metabolitos dependen de la fuente de
carbono. Cuando E. coli crece en glucosa, se
producen flujos netos de PEP a piruvato a través
de Pyk y del sistema de fosfotransferasa, y de
PEP a OAA a través de Ppc (Figura 1). Cuando la
célula crece en piruvato, se producen flujos de
piruvato a PEP por medio de Pps y de PEP a OAA
por medio de Ppc para suministrar precursores
para la biosíntesis (FIG. 1b). Cuando la célula
crece en succinato, OAA se convierte en PEP por
medio de Pck, pero el flujo de PEP a piruvato
puede ser positivo (FIG. Lc) o negativo (FIG. Id.).
Aparentemente, la célula ha desarrollado
mecanismos efectivos para modular estas
enzimas para controlar la dirección y las
magnitudes de estos flujos metabólicos en
respuesta a las condiciones nutricionales.
El control de estos flujos se ejerce tanto a nivel transcripcional como de actividad. Sin embargo, los
mecanismos para controlar la expresión génica de estas enzimas no se conocen completamente.
Un estudio con la fusión del operón pck-IacZ mostró que la transcripción de pck se encuentra bajo
represión catabolítica y se induce al inicio de la fase estacionaria a través de un mecanismo que
involucra a la CAMP y la proteína Crp. La regulación de pps está vinculada al sistema de la
fosfotransferasa. Se ha demostrado que el regulador negativo del operón fru, fiuR, es necesario
para pps. Una fusión de operón de pps-IacZ mostró que el gen pps en Salmonella typhimurium
está bajo represión de catabolitos, pero la adición de CAMP en presencia de glucosa no lo hace.
Aliviar esta represión.

Además del control genético, estas enzimas están reguladas en el nivel de actividad. El Ppc es
inhibido por el aspartato y el malato y se activa por la acetil coenzima A, fructosa 1,6-difosfato,
GTP, guanosina-5 'difosfato-3'-difosfato y ácidos grasos. Pck se activa alostéricamente por el calcio
y se inhibe por el ATP y PEP. Pps es activado por la carga de energía del adenilato e inhibido por
ADP, AMP, aketoglutarate, malate, OAA, y PEP. PykI es activado por fructosa 1,6-difosfato e
inhibido por GTP y succinil coenzima A. Pykl es inhibido por iones fosfato y activado por nucleósido
monofosfato y ribosa 5-fosfato. Estos efectores enzimáticos se resumen en la TABLA 1

Si estas enzimas son consideradas como válvulas bioquímicas que modulan los flujos entre las
reservas de metabolitos, estas válvulas están bajo controles genéticos y de actividad. Nuestra
investigación se refiere a tres preguntas generales. ¿Por qué la célula necesita controlar las
válvulas? ¿Las configuraciones de valvc (niveles de expresión de enzimas) son óptimas para el
crecimiento? y ¿Cómo responde la célula a los ajustes de válvula alterados? Las respuestas a estas
preguntas ayudarán en el diseño de mejores estrategias para redireccionar los flujos metabólicos
de importancia práctica en el metabolismo central. Específicamente, hemos intentado responder
algunos aspectos de estas preguntas alterando el control genético de las enzimas anteriores. Al
relajar el control transcripcional de las enzimas gluconeogénicas en condiciones glucolíticas,
podemos comprender mejor las razones por las que E. coli necesita controlar las válvulas. Al
cambiar los niveles de expresión de estas enzimas, podemos evaluar cómo crece E. coli en
condiciones de laboratorio definidas. Finalmente, al utilizar el operón y las fusiones de genes,
podemos detectar los efectos de la alteración del metabolismo central en las actividades
transcripcionales y de traducción de varios genes no vinculados.
Este artículo resume nuestro progreso hasta la fecha, que no incluye la alteración del control de la
actividad. Aunque nuestra investigación no está completa, los resultados ya arrojan nueva luz
sobre estas cuestiones fundamentales.
Sistemas experimentales

Para alterar el nivel de expresión de las enzimas, clonamos los fragmentos de ADN que contienen
estos genes corriente abajo de un promotor transmitido por plásmidos para que la actividad
transcripcional pueda ser manipulada. Además, construimos plásmidos de expresión que
contenían solo los genes estructurales de estas enzimas sin sus promotores naturales, de modo
que los controles transcripcionales nativos pudieran inhabilitarse. Los plásmidos que contenían
estos genes se transformaron luego en E. coli, y se demostró que la expresión diferencial de los
genes clonados era controlable por isopropil-P-o-tiogalactopiranósido (IPTG), según lo juzgado por
ambos ensayos enzimáticos y SDS-PAGE. Para controlar cualquier carga ribosomal adicional o
carga metabólica causada por la expresión de proteínas de plásmidos multicopia, aislamos alelos
mutantes que produjeron productos génicos inactivos pero solubles y estables. Debido a que estas
proteínas mutantes eran solubles y estables, probablemente eran mutantes del sitio activo. No
alteraron las actividades de transcripción o traducción, según lo juzgado por el nivel de expresión
de la proteína de SDS-PAGE. Además, no se indujo ninguna respuesta al choque térmico mediante
proteínas activas o inactivas, como se juzga a partir de dos fusiones lucZ impulsadas por
promotores del choque térmico. Por lo tanto, los productos de genes inactivos se utilizaron como
controles en un huésped isogénico para distinguir los efectos de la actividad enzimática de los de
la sobreproducción de proteínas. Se debe reconocer que pueden existir efectos proteicos
independientes de la actividad. Por lo tanto, es preferible aislar más de un alelo mutante
independiente que produce productos génicos inactivos pero solubles y estables. De hecho,
obtuvimos múltiples alelos mutantes como controles para la sobreexpresión de Pps y Pck
(resultados no publicados).

Medición de parámetros fisiológicos.

Para las caracterizaciones fisiológicas, todas las cepas se cultivaron en medio M9 mínimo con 0,2%
de glucosa u otras fuentes de carbono. Se agregaron varias cantidades de IPTG después de
aproximadamente una o dos veces después de la inoculación. La tasa de crecimiento específico, la
tasa de consumo de glucosa y la tasa de consumo de oxígeno se midieron después de al menos
seis generaciones posteriores a la inoculación. Las densidades celulares fueron entre ca. 2x lo7 y 6
x 10 'células por mililitro. Durante esta fase, el cultivo no estuvo limitado por ningún nutriente;
Tampoco fue inhibido por los productos. Los parámetros fisiológicos medidos se mantuvieron
aproximadamente constantes. Todos los cultivos se cultivaron a 37 ° C en un agitador rotatorio y
se añadió ampicilina (50 pg / ml) como presión de selección para cepas que contienen plásmidos.
En cultivos discontinuos, es importante que estos parámetros se midan durante un crecimiento
equilibrado sin restricciones, cuando el estado fisiológico se puede definir claramente. Los cultivos
de quimiostatos en estado estable también tienen un estado claramente definido. Sin embargo,
están limitados constantemente por un nutriente esencial, y los parámetros fisiológicos medidos a
partir de cultivos de quimiostatos tienen diferente significado.

La tasa de crecimiento específica (p) se puede interpretar como la cantidad de masa celular
producida por unidad de masa celular por hora. La tasa de consumo específica para un sustrato
(QiIc y Q, para glucosa y oxígeno, respectivamente) es el sustrato consumido por hora por unidad
de masa celular. El rendimiento de crecimiento en glucosa (YGlc) es la masa celular producida por
unidad de glucosa consumida. De manera similar, el rendimiento de crecimiento para el oxígeno
(Yo2) es la masa celular producida por unidad de oxígeno consumido. En crecimiento equilibrado,
Y ,,, es igual a p / Q ,, y Yo2 es igual a p / Q ,. Yale se calcula trazando la glucosa residual frente al
peso celular (peso seco). Esta gráfica se convierte en una línea recta cuando las células alcanzan un
crecimiento equilibrado (ca. 2-6 x lo7cells / mL). La pendiente negativa de esta recta es Ycilc. Los
coeficientes de rendimiento pueden interpretarse como la estequiometría del crecimiento con
respecto a la glucosa o al oxígeno en un crecimiento equilibrado. El rendimiento recíproco es la
tasa de consumo de sustrato normalizada por la tasa de crecimiento.

¿POR QUÉ LA CELDA NECESITA CONTROLAR LAS VÁLVULAS BIOQUÍMICAS?

Se sabe que los genes gluconeogénicos se reprimen en presencia de glucosa. En principio, la

coexistencia de enzimas antagonistas en el viuo podría dar lugar a un ciclo metabólico inútil (figura
2). La prevención de ciclos inútiles ha sido considerada como una de las principales razones para
controlar los flujos entre la glucólisis y la gluconeogénesis, ya sea que tales ciclos ocurran in vivo;
Sus efectos sobre la fisiología celular han sido temas de interés. Aunque el propósito de la
regulación metabólica en E. coli puede extenderse más allá de la prevención de ciclos inútiles, nos
centramos en el ciclo como primer paso. Con una configuración genómica inalterada, el ciclo inútil
puede no existir. Poco, si es que hubo alguno, se detectó un ciclo inútil entre la fructosa 6 / fosfato
y la fructosa 1,6-difosfato en E. cofi en condiciones glucolíticas o gluconeogénicas. Sin embargo,
cuando el control transcripcional de la enzima gluconeogénica se elimina en condiciones
glucololíticas, Puede ocurrir un ciclo inútil, que, en efecto, disminuye la eficiencia del metabolismo
energético. Por lo tanto, examinamos los efectos de la sobreexpresión de las enzimas
gluconeogénicas (Pps y Pck) en condiciones glucolíticas ".33 Los resultados se resumen
cualitativamente en la TABLA 2. Se observó que quince veces la sobreexpresión de Pps en E. cofi
estimula el consumo de oxígeno en medio de glucosa sin afectando adversamente el crecimiento.

Un aumento adicional en la actividad de Pps a treinta veces estimula el consumo de glucosa en

aproximadamente el doble y da como resultado un aumento de la excreción de piruvato y acetato.
La inserción de dos codones en marco en el gen pps anula la actividad enzimática y elimina los
efectos fisiológicos mencionados anteriormente. Por lo tanto, los efectos observados pueden
atribuirse a la actividad de Pps.
La sobreexpresión de Pck en presencia de glucosa causa un retraso grave del crecimiento por
razones desconocidas. El Pck elevado aumenta la tasa de consumo de glucosa en relación con la
tasa de crecimiento, según lo determinado por el rendimiento recíproco de crecimiento en
glucosa. Sin embargo, disminuye la tasa de respiración incluso después de ajustar la diferencia de
tasa de crecimiento. El Pck inactivo no muestra estos fenotipos. Para determinar si estos fenotipos
son respuestas al inútil ciclo in vivo, abolimos la actividad antagonista correspondiente mediante
la inactivación del gen ppc del cromosoma. Se observaron los mismos fenómenos, lo que indica
que no están causados por ciclos inútiles entre Pck y Ppc. Estos resultados sugieren que la célula
podría tolerar la sobreexpresión de Pps, pero no Pck, en condiciones glicolíticas. Sin embargo, la
razón de la toxicidad de Pck no está relacionada con el ciclo inútil.

Para probar cómo responde la célula a un ciclo inútil, generamos una ruta de ciclismo artificial
mediante la sobreexpresión simultánea de Pck y Ppc. La sobreexpresión simultánea de estas dos
enzimas en presencia de glucosa estimula el consumo de oxígeno y glucosa, reduce los
rendimientos de crecimiento y da como resultado un alto nivel de excreción de productos de
fermentación como el piruvato y el acetato (ver Tabla 2). Estas respuestas se eliminan cuando pck
o ppc se eliminan del plásmido o cuando en su lugar se sobreexpresan alelos mutantes que
carecen de las actividades de Pck y Ppc. Por lo tanto, los efectos observados implican la existencia
de ciclos inútiles, ya que se requieren actividades de ambas enzimas para generar los fenómenos.
Aunque la prueba bioquímica del ciclo debe provenir de los experimentos con trazadores, los
resultados anteriores proporcionan evidencia genética que respalda dicho ciclo. Este enfoque es
similar al enfoque genético que ha contribuido significativamente a la elucidación de las vías
metabólicas en las últimas décadas.

Además, en la medida en que la expresión de la enzima está bajo el control de IPTG, la inducción
incremental se puede usar para modular cuantitativamente el nivel de ciclo y así caracterizar las
respuestas fisiológicas a diferentes niveles de ciclo inútil. Encontramos que la estimulación del
consumo de oxígeno es la primera respuesta a niveles bajos de ciclos inútiles. Aumentar la
estimulación del consumo de oxígeno es la primera respuesta a los bajos niveles de ciclos inútiles.
El aumento del nivel de ciclos inútiles (por concentraciones más altas de IPTG) estimula el
consumo de glucosa y la excreción de piruvato. La tasa de crecimiento específica de E. coli es
insensible al ciclo inútil per se, ya que también se observó una inhibición del crecimiento
comparable cuando las enzimas inactivas se expresaron en exceso a un nivel similar. Estas
observaciones sugieren que a niveles bajos de ciclos inútiles, la célula puede compensar el drenaje
de energía al aumentar la tasa de respiración con un pequeño aumento en el consumo de glucosa.
Un aumento adicional en el ciclo inútil induce el consumo de glucosa.
En niveles muy altos de ciclos, el ciclo de TCA o la capacidad de respiración parece estar saturado,
y la mayor afluencia de glucosa se excreta principalmente como productos de fermentación. En la
medida en que el ciclo del TCA es la vía principal que conduce a la generación de ATP aeróbica, el
aumento del consumo de ATP por el ciclo inútil artificial no puede ser compensado de manera
efectiva por las cepas con deficiencias de enzimas en el ciclo del TCA. Como se esperaba, una cepa
que carece de a-cetoglutarato deshidrogenasa utiliza la glucólisis (es decir, la fosforilación a nivel
de sustrato) como la vía principal para compensar el ciclo inútil, y no crece a niveles altos de ciclo
inútil.

Los resultados anteriores sugieren que la expresión simultánea (0ver) de enzimas glucolíticas y
gluconeogénicas conduce a un ciclo inútil. La sobreexpresión de Pps en condiciones glucolíticas
causa fenotipos similares, lo que sugiere que también puede ocurrir un ciclo inútil en esta
situación. Aparentemente, la célula puede compensar el ciclo a expensas del rendimiento de
crecimiento en lugar de la tasa de crecimiento. La tasa de crecimiento es insensible al ciclo inútil
per se, pero se reduce por razones desconocidas cuando Pck se sobreexpresa moderadamente. En
Saccharomyces cerevisiae, la expresión simultánea de dos enzimas gluconeogénicas (fructosa-1,6-
bisfosfatasa y Pck) en condiciones glucolíticas también genera fenotipos inútiles similares a los
ciclos sin afectar significativamente la tasa de crecimiento.

Por lo tanto, la principal consecuencia de los ciclos inútiles es la reducción del rendimiento de
crecimiento o la efectividad en la utilización del sustrato. Si el bajo rendimiento de crecimiento
conduce a una desventaja competitiva, prevenir el exceso de ciclos inútiles puede ser la razón para
controlar la expresión de Pps en presencia de glucosa. Aunque la sobreexpresión de Pck en
presencia de glucosa no conduce a fenotipos característicos de ciclos inútiles, causa una inhibición
grave del crecimiento, que puede ser la razón principal para controlar la expresión de Pck.

¿SON LOS AJUSTES DE VÁLVULA OPTIMOS PARA EL CRECIMIENTO?

Se acepta ampliamente que los microorganismos han evolucionado a un estado óptimo en el que
las alteraciones incrementales de las actividades existentes no pueden mejorar la condición física.
Este concepto generalmente se aplica a los microbios en el ambiente nativo. Se desconoce si es
cierto en condiciones de laboratorio, donde cambia la perspectiva de la condición física. Los
estudios con citrato sintasa y enzima IIG'c en el sistema de la fosfotransferasa mostraron que sus
niveles de expresión son óptimos: los aumentos adicionales en la expresión más allá de los niveles
de tipo salvaje no afectan la tasa de crecimiento o la tasa de consumo de glucosa,
respectivamente. Por otro lado, la expresión de genes heterólogos, como la hemoglobina de
Vitreoscilla, la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa de Zymomonas mobilis, ha
demostrado mejorar la tasa de crecimiento y la densidad celular en condiciones de laboratorio
definidas.

Para investigar si los niveles de expresión de enzimas en el metabolismo central son óptimos,
alteramos los niveles de expresión de Ppc, Pps y Pck en células que crecen en glucosa, piruvato y
succinato, respectivamente. Estas tres enzimas son necesarias para el crecimiento en la fuente de
carbono respectiva. Para variar el nivel de expresión por debajo de los niveles de tipo salvaje, las
copias cromosómicas de estos genes se inactivaron por mutación. Como se esperaba, aumentar el
nivel de expresión de Ppc más allá del nivel natural no afecta la tasa de crecimiento en la glucosa,
lo que indica que el nivel de expresión ya es óptimo para la tasa de crecimiento máxima. Sin
embargo, el rendimiento de crecimiento mejora significativamente cuando el Ppc se sobreexpresa:
la cepa que sobreexpresa Ppc excreta muchos menos productos de fermentación, lo que da como
resultado una utilización más efectiva de la glucosa (ver Tabla 2). Este fenómeno se puede
demostrar mejor mediante el cultivo de cepas en cultivos discontinuos no controlados a una
temperatura constante. La cepa de sobreexpresión de Ppc alcanza una alta densidad celular en la
fase estacionaria, aunque la tasa de crecimiento equilibrada es la misma que la de las cepas de
tipo salvaje (datos no publicados). Este fenómeno puede atribuirse a una menor reducción del pH
o una menor inhibición del producto, y demuestra que el nivel de Ppc de tipo salvaje en E. coli no
se ha optimizado para un rendimiento máximo en cultivos discontinuos.

En contraste con el caso anterior, ¿la expresión de Pps y Pck más allá de los niveles de tipo salvaje
aumenta la rata de crecimiento sin restricciones? en piruvato y en succinato, respectivamente; lo
que indica que estas enzimas no se expresan de manera óptima incluso para el crecimiento
gluconeogénico en la fuente de carbono respectiva. Aunque la E. coli de tipo salvaje crece más
lentamente en el piruvato y en el succinato que en el glicerol, las cepas con Pps o Pck expresadas
de manera óptima pueden crecer a la misma velocidad en el piruvato y en el succinato,
respectivamente, a medida que la E. coli de tipo salvaje crece. glicerol. Estas observaciones
sugieren que la E. coli de tipo salvaje que crece en estas fuentes de carbono gluconeogénico está
al menos parcialmente limitada por el suministro de PEP. En el nivel óptimo de Pps o Pck, el paso
de control tal vez se desplace al suministro de fosfato de seis carbonos, otro paso en la
gluconeogénesis con una barrera de alta energía libre. La sobreexpresión de Pps o Pck más allá de
sus niveles óptimos se convierte rápidamente en inhibidor del crecimiento por razones
desconocidas. Estos resultados indican que los niveles de expresión de la enzima en E. coli no son
óptimos para el crecimiento de lotes en condiciones de laboratorio. Es posible que la E. coli de tipo
salvaje esté optimizada para un cambio rápido en las condiciones glucolíticas en lugar de un
crecimiento rápido en condiciones gluconeogénicas.

¿CÓMO RESPONDE LA CELULA A LAS CONFIGURACIONES DE VÁLVULAS ALTERADAS?

En vista de la importancia del metabolismo central en E. coli, es probable que la alteración de los
niveles de expresión de las enzimas en estas vías pueda afectar a muchos sistemas reguladores. La
alteración del metabolismo central cambiará ciertas reservas de metabolitos, lo que a su vez
modula la actividad de muchas enzimas. Además de estas regulaciones en el nivel de actividad, los
grupos de metabolitos alterados también pueden afectar las actividades transcripcionales de los
genes relacionados remotamente. Para investigar estas posibilidades, hemos empleado operones
y fusiones de genes, que informan actividades de transcripción y traducción por una enzima
fácilmente medible, P-galactosidasa. El operón y las fusiones genéticas probadas incluyen cyo-IacZ,
I 'cyd-lacZ, I' sdh-lacz, "'PgroE ,,, - lacZ, 4J PrpoD ,,, - lacZ, 44 y glnA ,, - lacZ.

La transcripción de los tres primeros requiere u7 ", el factor u de mantenimiento de la casa, y

todos están bajo el control del arco. Los genes cyo (que codifican el citocromo o oxidasa) y sdh
(que codifican la succinato deshidrogenasa) están reprimidos, mientras que cyd (el citocromo que
codifica) d oxidasa) es inducida por arcA durante la limitación de oxígeno. PgroE ,,, y PropD, son
reconocidos por @, que es responsable de la respuesta al choque térmico. El promotor de glnA, es
reconocido por d4, e impulsa el operón glnALG, que codifica la glutamina sintasa y sus proteínas
reguladoras, NR y NR, ... Las fusiones se clonan en el fago h, que luego lisogeniza la cepa huésped
deseada, lo que resulta en merodiploide en el locus genético de interés.

Tras la sobreexpresión de ppc, la actividad transcripcional de estos promotores no cambia mucho.

Sin embargo, la sobreexpresión de pck afecta significativamente estas actividades: las
transcripciones de cyo-IacZ, cyd-IacZ, PgroE, -lacZ y PrpoD, - lucZ disminuyen en un 50-70%, pero la
transcripción de glnAp-lacZ aumenta en aproximadamente un 50%. Estos resultados sugieren que
pck afecta significativamente las respuestas globales. De particular interés es que la
sobreexpresión de pck disminuye las actividades transcripcionales de los promotores de choque
térmico, en contraste con la expectativa común de que la sobreexpresión de proteínas induce la
respuesta de choque térmico. La disminución de las actividades lacZ fusionadas puede atribuirse a
la mayor carga en la ARN polimerasa y ribosoma causada por la sobreexpresión de proteínas. Sin
embargo, dos líneas de evidencia se oponen a este argumento: primero, los efectos insignificantes
de niveles similares de sobreexpresión de ppc, y segundo, el aumento en la transcripción de gln.4,
-lacZ (datos no publicados). La expresión simultánea de Pck y Ppc también causa los mismos
efectos en la transcripción, excepto que no induce la transcripción de glnA, -1acZ. Como se
mencionó anteriormente, este sistema crea una ruta artificial de ciclismo inútil que estimula el
consumo de oxígeno. Sin embargo, los niveles de transcripción de los tres genes respiratorios, cyo,
cyd y sdh, disminuyen, lo que sugiere que los productos de estos genes respiratorios terminales no
controlan la frecuencia respiratoria en las condiciones probadas.

La razón del aumento de la respiración en esta situación es quizás la disminución de la carga de

energía debido a los ciclos inútiles. Aunque el mecanismo subyacente de estos efectos todavía
está bajo investigación, estos resultados demuestran que las alteraciones de las enzimas
metabólicas centrales pueden afectar los genes no relacionados en el nivel transcripcional. Por lo
tanto, al caracterizar la respuesta fisiológica mediante la sobreexpresión controlada de una
enzima, uno no siempre puede descuidar sus efectos en los niveles de expresión de otros. Esto es
particularmente importante cuando se determinan los coeficientes de control (derivado parcial de
una respuesta con respecto a la actividad de una enzima) mediante la expresión controlada de un
gen específico in vivo.

DISTRIBUCION DE FLUJO

Modificar la distribución del flujo metabólico es una de las principales tareas de la ingeniería
metabólica. Aunque no existe una forma simple y directa de medir los flujos internos, pueden
estimarse a partir de la estequiometría de la vía, la tasa de crecimiento y las tasas de formación de
productos. Cuando E. coli crece en piruvato, Pps convierte el piruvato en PEP, que se incorpora
principalmente a la masa celular. Pps está compitiendo con la piruvat deshidrogenasa, que
convierte el piruvato en acetil coenzima A, un precursor del ciclo TCA.

Los flujos a aminoácidos derivados de C4 o CS provienen de las vías anapleuróticas. Por lo tanto, el
flujo de piruvato a PEP es proporcional a la tasa de crecimiento específica. El flujo de piruvato a
acetato es aproximadamente proporcional a la tasa de crecimiento específica. El flujo de piruvato
a acetato es aproximadamente proporcional a la tasa de respiración, en la medida en que no
existe un producto importante. La relación entre estos dos flujos es, por lo tanto, proporcional al
rendimiento de crecimiento del oxígeno (Yo2 en estado estable). En principio, el flujo se puede
dirigir mediante la sobreexpresión de la enzima que conduce a la rama deseada. Si las enzimas
están débilmente reguladas de forma cruzada, la sobreexpresión de las enzimas todavía puede ser
capaz de valorar los efectos reguladores. Por lo tanto, se espera que la sobreexpresión de Pps en
medio de piruvato aumente la relación de flujo entre el crecimiento (de piruvato a PEP) y el
catabolismo (de piruvato a acetil coenzima A). Sin embargo, los datos de Yo indican que esta
relación permanece aproximadamente constante cuando Pps se sobreexpresa. Esta observación
sugiere que existe rigidez en la regulación, que no puede eliminarse mediante la sobreexpresión
de la enzima. El candidato más probable para el regulador es quizás la carga de energía de
adenilato. El valor de Yo2 disminuye por razones desconocidas cuando la actividad de Pps excede
el nivel óptimo de crecimiento en piruvato.

CONSUMO DE GLUCOSA

La tasa de captación de glucosa por el sistema de fosfotransferasa está bajo controles altamente
sofisticados (revisados por Postma et al. "). Se sabe que el control transcripcional de los genes
involucrados en este sistema involucra al menos AMP cíclico y enzima IIG1C.13 de tipo salvaje el
nivel de expresión de la enzima IIGIc ha demostrado ser óptimo: un aumento adicional en esta
enzima no aumenta la tasa de consumo de glucosa. Sin embargo, al cambiar los niveles de
expresión de Pps, Pck y Ppc, pudimos cambiar el consumo de glucosa. La sobreexpresión de Pps y
Pck aumenta la tasa de consumo de glucosa en relación con la tasa de crecimiento, mientras que
la sobreexpresión de Ppc la disminuye. Una posible explicación es que la sobreexpresión de estas
enzimas altera la relación PEP / piruvato, que a su vez afecta la tasa de consumo de glucosa. Según
lo propuesto por Saier y Chin, 3 "un aumento en esta relación puede cambiar el equilibrio hacia
enzimas fosforiladas (ver Figura 3). y así aumentar la tasa de captación de glucosa.

Cambiar los niveles de expresión de Pps, Pck y Ppc proporciona una manera indirecta de alterar
esta relación y afectar el consumo de glucosa. Alterar la expresión de Pykl o PykII debería
proporcionar una prueba más directa de esta hipótesis. Los experimentos a lo largo de esta línea
están en marcha en nuestro laboratorio. El aumento en la tasa de consumo de glucosa y la
formación del producto de fermentación también se observó en un mutante uspA, que falta en
una proteína de estrés universal, pequeña y soluble. En la E. coli de tipo salvaje, la proteína UspA
se induce cuando la tasa de crecimiento cae por debajo de la tasa de crecimiento máxima
soportada por el medio, y está implicada en participar en la modulación del flujo de carbono en el
metabolismo central. Sería interesante ver si UspA está involucrado en la generación de los
fenómenos descritos anteriormente.

RESUMEN

Aunque el metabolismo central de E. coli se ha estudiado durante varias décadas, muchas

características reguladoras aún son desconocidas. Para lograr el objetivo de la manipulación
racional del metabolismo celular, es importante comprender cómo responde E. coli a las enzimas
sobreexpresadas. Al estudiar el control bioquímico de los flujos entre PEP, piruvato y OM, hemos
abordado algunas cuestiones fundamentales que pueden resultar esenciales para las aplicaciones
en ingeniería metabólica. Primero, encontramos que la sobreexpresión simultánea de Pck y Ppc, o
Pps solo en presencia de glucosa conduce a fenotipos compatibles con ciclos inútiles. En contraste
con nuestras expectativas, los ciclos inútiles per se no afectan significativamente la tasa de
crecimiento. Sin embargo, el exceso de ciclos inútiles puede causar una desventaja competitiva en
el entorno natural. La sobreexpresión de Pck causó la inhibición del crecimiento pero ningún ciclo
inútil. Por lo tanto, E. coli controla la expresión de las enzimas gluconeogénicas no solo para evitar
el exceso de ciclos inútiles, sino también para evitar efectos de toxicidad. En la ingeniería
metabólica, el ciclo inútil se puede usar como una estrategia para estimular el metabolismo, ya sea
para la producción de metabolitos o la digestión de desechos tóxicos.

En segundo lugar, encontramos que los niveles de expresión de Pps y Pck en E. coli no son óptimos
para el crecimiento en piruvato y succinato, respectivamente. La sobreexpresión de estas enzimas
aumenta la tasa de crecimiento en el piruvato y en el succinato, respectivamente, lo que indica
que las lentas tasas de crecimiento en estos sustratos son causadas, al menos parcialmente, por el
suministro insuficiente de PEP y sus derivados. Además, E. coli tampoco ha optimizado el nivel de
Ppc para un rendimiento de crecimiento óptimo en glucosa en cultivos discontinuos no
controlados. Estos resultados demuestran que el metabolismo central no está optimizado para el
crecimiento en condiciones de laboratorio definidas. Por lo tanto, existe la posibilidad de que el
ajuste de los niveles de enzimas nativas en el metabolismo central pueda mejorar el rendimiento
del biorreactor.

En tercer lugar, encontramos que la sobreexpresión de Pck afecta los niveles transcripcionales de
genes no relacionados. Este ejemplo indica que las respuestas fisiológicas a la expresión de la
enzima (0ver) deben interpretarse con cautela, ya que cambiar el nivel de expresión de una
enzima específica puede afectar a muchos genes no vinculados. También se han obtenido
resultados similares mediante el uso de electroforesis bidimensional de proteínas de E. coli. ". *
'Aunque aún quedan por responder más preguntas, se puede esperar un rápido progreso en el
área de la ingeniería metabólica en un futuro próximo.