UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE INGENIERIA QUIMICA
PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES
1. TÍTULO:

Influencia del tipo de pretratamiento con un líquido iónico o un alcóxido

en el rendimiento de azúcares obtenidos por hidrólisis enzimática de la
paja de arroz

2. TIPO DE INVESTIGACIÓN

Investigación Básica Desarrollo Tecnológico

Investigación Aplicada Innovación

3. NOMBRE DE LOS TESISTAS

MENDOZA AZABACHE, MARIELA

APELLIDOS Y NOMBRES DEL TESISTA 1
ESTEFANI

Número de matrícula: 1511601311

Teléfono: 941477220

Email: mariela_mendoza_123@hotmail.com

Dirección: Alfonso Ugarte #343 - Moche

ZAVALETA RODRIGUEZ, MICHELLE

APELLIDOS Y NOMBRES DEL TESISTA 2
ALEJANDRA

Número de matrícula: 1031600111

Teléfono: 990330725

Email: michzr@hotmail.com

Dirección: Jr. San Pedro 146 – La Esperanza

4. NOMBRE DEL ASESOR

QUEZADA ALVAREZ, MEDARDO

Apellidos Y Nombres
ALBERTO
Categoría Y Dedicación Docente Auxiliar TC

Código 5645

Título Profesional Ingeniero Químico

Grado Académico Doctor en Química Sostenible

Departamento Académico Ingeniería Química

Teléfono 964197877

Email maqa69@hotmail.com

Dirección Pasaje Salaverry 296, Palermo

5. LUGAR DE EJECUCIÓN DEL PROYECTO

SEDE UNT - TRUJILLO Av. Juan Pablo II s.n.

6. PRESUPUESTO

Presupuesto requerido en nuevos soles S/. 5,024.10

7. DURACIÓN DEL PROYECTO

INICIO 12 de Setiembre 2016

TERMINO 24 de Abril 2017

8. CRONOGRAMA DE EJECUCIÓN DEL PROYECTO

DEDICACIÓN
ETAPAS INICIO TÉRMINO
SEMANAL (horas)

a. Recolección de datos 12/09/2016 13/11/2016 35

b. Experimentación y Análisis
14/11/2016 19/03/2017 40
de resultados

c. Redacción del informe 20/03/2017 24/04/2017 30

9. RECURSOS DISPONIBLES

a. Personal:

02 Bachiller en Ingeniería Química

01 Ingeniero Químico

b. Material y equipos:

Los recursos disponibles son financiados por el Proyecto de Investigación

con Fondos de Canon Minero PIC 08-2014

Insumos y Reactivos disponibles

Etanol 95%
Celluclast 1.5 L
Indicador Ferroína
Citrato de sodio
Sulfato de Amonio Ferroso
Ácido Dinitrosalicílico
Ácido sulfúrico
Fenol
Hidróxido de sodio
Dicromato de potasio
Sulfato de sodio
Glucosa
 Materiales disponibles Cantidad
Bolsas herméticas 100 und.
Parafilm 5 cm x 32 m 1 und.
Guante quirúrgico 1 caj.
Tubo de ensayo 16x100mm 10 und.
Soporte universal 2 und.
Papel de filtro whatman 2 cajas.
Frasco de vidrio transparente 1 L 5 und
Frasco de vidrio ámbar 1 L 2 und.
Frasco de vidrio ámbar 250 ml 2 und.
Frasco de plástico 250 mL 10 und.
Pizeta 500 mL 2 und.
Bureta graduada 50 mL 1 und.
Matraz Erlenmeyer 250 mL 10 und.
Matraz Erlenmeyer 500 mL 5 und.
Matraz Erlenmeyer 1000 mL 1 und.
Vaso de precipitación 600 mL 1 und.
Vaso de precipitación 250 mL 6 und.
Varillas de agitación de vidrio 2 und.
Matraz de filtración 1000 ml 1 und.
Matraz de filtración 250 ml 1 und.
Crisol de porcelana 50 ml 4 und
Pipeta graduada 10 mL 2 und.
Pipeta graduada 25 mL 2 und.
Pipeta graduada 50 mL 2 und.
Pipeta graduada 75 mL 2 und.
Bombilla de succión 2 und.
Probeta graduada 100 mL 2 und.
Gotero 2 und.
Guante quirúrgico 1 caj.
Mangueras 1 und.
Rejilla 1 und.
Embudo Buchner 1 und.
Termómetro 2 und.
Celdas de cuarzo paso óptico 1cm 4 und
Pastillas de agitación 3 und
 Equipos disponibles Cantidad
Equipo de baño de aceite 1 und.
Autoclave 1 und.
Equipo de Filtración al vacío 1 und.
Agitador Magnético. 1 und.
Agitador Magnético con plancha
1 und.
de calentamiento
Incubadora rotatoria 1 und.
Balanza Analítica 1 und.
Centrifuga 1 und.
Espectrofotómetro UV - VIS 1 und.
Estufa de convección forzada 1 und.
Equipo de reflujo 1 und.
Extractor Soxhlet 1 und.
Desecador 1 und.
Mufla 1 und.
Dispersor de pulpas 1 und.

c. Locales:

Laboratorios ubicados en la Escuela Profesional de Ingeniería

Ambiental

10. PRESUPUESTO

Cantid Costo Monto

Partida Descripción Unidad %
ad Unitario (S/.)
2.3 BIENES Y SERVICIOS -- -- -- S/. 5,024.10 100.00%
2.3.1 COMPRA DE BIENES -- -- -- S/. 4,749.10 94.53%
2.3.1 5 Materiales y Utiles -- -- -- S/. 79.00 1.57%
2.3.1 5. 1 De Oficina -- -- -- S/. 79.00 1.57%
Papeleria en general, utiles y materiales de
2.3.1 5. 1 2 -- -- -- 1.57%
oficina. S/. 79.00
Lapiceros und 4 S/. 0.50 S/. 2.00 0.04%
Papel bond millar 0.5 S/. 26.00 S/. 13.00 0.26%
Cartucho de tinta para impresora und 2 S/. 30.00 S/. 60.00 1.19%
Paq. 100
Stickers 0.08%
und 2 S/. 2.00 S/. 4.00
2.3.1 9 Materiales y utiles de enseñanza -- -- -- S/. 1,800.00 35.83%
2.3.1 9. 1 Materiales y utiles de enseñanza -- -- -- S/. 1,800.00 35.83%

2.3.1 9. 1 99 Otros materiales diversos de enseñanza -- -- -- S/. 1,800.00 35.83%

Bolsas herméticas (x20 und) Paquete 5 S/. 10.00 S/. 50.00 1.00%
Tamiz - Malla N°40 und 1 S/. 600.00 S/. 600.00 11.94%
Tamiz - Malla N°70 und 1 S/. 600.00 S/. 600.00 11.94%
Molino de tornillo sin fin und 1 S/. 100.00 S/. 100.00 1.99%
Balon de dos bocas, 50 ml und 3 S/. 150.00 S/. 450.00 8.96%

2.3.1 99 Compra de Otros Bienes -- -- -- S/. 2,870.10 57.13%

2.3.1 99. 1 Compra de Otros Bienes -- -- -- S/. 2,870.10 57.13%
2.3.1 99. 1 2 Productos Quimicos -- -- -- S/. 2,870.10 57.13%
Trietilamina para HPLC und 1 S/. 1,100.00 S/. 1,100.00 21.89%
Cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio (100g) und 1 S/. 878.50 S/. 878.50 17.49%
Azida de sodio (100 g) und 1 S/. 400.00 S/. 400.00 7.96%
Etóxido de sodio (250 g) und 1 S/. 491.60 S/. 491.60 9.78%
2.3.2 CONTRATACION DE SERVICIOS -- -- -- S/. 275.00 5.47%
Servicios Básicos, Comunicaciones, Publicidad
2.3.2 2 -- -- -- S/. 100.00 1.99%
y Difusión.
2.3.2 2. 2 Servicios de Telefonía e Internet -- -- -- S/. 100.00 1.99%
2.3.2 2. 2 3 Servicios de Internet mes 1 S/. 100.00 S/. 100.00 1.99%
Servicio de Publicidad, Impresiones, Difusión e
2.3.2 2. 4 -- -- -- S/. 175.00 3.48%
Imagen Institucional
Servicio de Impresiones, Encuadernación y
2.3.2 2. 4 4 -- -- -- 3.48%
Empastado S/. 175.00
Impresiones y Fotocopiados und 500 S/. 0.10 S/. 50.00 1.00%
Encuadernación y Empastado und 5 S/. 25.00 S/. 125.00 2.49%

TOTAL: S/. 5,024.10 100.00%

11. FINANCIAMIENTO

a. Con recursos externos: Los recursos disponibles dentro del Proyecto PIC
N°08-2014 (Monto: S/. 4,749.10)
b. Autofinanciación: Contratación de servicios de recursos no disponibles
(Monto: S/. 275.00)
II. PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACIÓN CIENTÍFICA, TÉCNICA O
HUMANÍSTICA

La generación y gestión de los residuos es uno de los retos ambientales más

complejos a los que se enfrenta la sociedad actual. “En este contexto, las
materias primas lignocelulósicas han sido percibidas como fuente sostenible y
de mayor potencial para la producción de combustibles alternativos y productos
químicos de plataforma” (Khare, Pandey & Larroche, 2015, p.38). Asimismo, Xu
J. et al (2016) afirman:
Los materiales lignocelulósicos tales como residuos agrícolas, subproductos
agrícolas, y la biomasa leñosa se producen en abundancia en todo el mundo. Estos
materiales son esencialmente potenciales materias primas para la producción de
azúcares fermentables, que son esenciales para diversos productos industriales,
tales como biocombustibles, plásticos biodegradables, biosurfactantes, enzimas,
etc. (p.180)
En Perú, la industria agrícola, agroindustria y la industria de madera generan
más de 10’247,000 TM de residuos de biomasa que representan 2’991,711 TEP
de energía. Los residuos de biomasa principalmente están integrados por
residuos de cultivos de caña de azúcar (20%), tallos, hojas y mazorcas de maíz
(35%), bagazo (17%), cáscara de arroz (4%), paja de arroz (14%), broza de
espárrago (2%), paja de la planta de algodón (6%), virutas y serrín de madera
(1%). (Assureira & Assureira, 2014, p.2)

Según Bardales et al. (2015):

La Libertad es un departamento líder en la actividad agroindustrial, destacando por
su aporte de 11,6% al sector a nivel nacional (…). Asimismo con los resultados
obtenidos en esta investigación, muestran claramente que la actividad agroindustrial
en el departamento La Libertad-Perú, se realiza en mayor proporción en la zona
costera del departamento y, abarca principalmente 4 provincias: Virú, Ascope,
Trujillo y Chepén.
“Mientras que, los residuos agrícolas y forestales son fuentes que en la
actualidad no son explotadas comercialmente a pesar de su potencial
energético” (Assureira & Assureira, 2014, p.2).
“La paja de arroz es un residuo lignocelulósico producido en casi todo el mundo”
(Kim & Dale., citado por Poornejad et al, 2013). Así, Buranov & Mazza (2008)
nos indican que:
La producción mundial total de la paja de arroz es de 525 millones de toneladas /año
(…). Debido a su mayor contenido de sílice (~ 10%), la paja de arroz no se puede
utilizar para la alimentación animal. Por lo tanto, la mayoría de la paja de arroz se
quema causando la contaminación ambiental. La paja de arroz es única en relación
con otras pajas de cereales y contiene lignina de bajo peso molecular, pero más alta
de sílice (ceniza). (p.247)
Xu J. et al (2016) afirman: “Hoy en día, considerables esfuerzos se han dedicado
a la hidrólisis enzimática de materiales lignocelulósicos para los azúcares. Hay,
sin embargo, limitaciones a este proceso, debido a la solubilidad limitada de
lignocelulosa en fase acuosa tradicional” (p.180).

Una explicación a ese fenómeno es la compleja estructura que presentan las

lignocelulosas. Jorgensen, Kristensen & Felby (citado por Kumar et al., 2009)
afirman que:
La Lignocelulosa es el bloque de construcción principal de las paredes celulares de
las plantas. La biomasa vegetal se compone principalmente de celulosa,
hemicelulosa y lignina, junto con cantidades más pequeñas de pectina, proteínas,
extractivos (materiales no estructurales solubles tales como azúcares no
estructurales, material nitrogenado, clorofila, y ceras), y ceniza. (p.3714)
“La composición de estos componentes puede variar de una especie de planta
a otra” (Sun & Cheng, citado por Kumar et al, 2009, p.3714). “Además, las
relaciones entre los diversos componentes dentro de una sola planta varían con
la edad, etapa de crecimiento, y otras condiciones” (Perez et al, citado por Kumar
et al, 2009, p.3714). Beguin & Aubert (citado por Kumar et al, 2009) aportan:
La celulosa es el principal constituyente estructural en las paredes celulares de las
plantas y se encuentra en una estructura fibrosa organizada. (…) Este polímero lineal
consiste en subunidades de D-glucosa unidas entre sí por enlaces β-(1,4)-
glucosídicos. La celobiosa es la unidad de repetición establecido a través de este
enlace, y constituye cadenas de celulosa. Los polímeros de celulosa de cadena larga
están unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y Van Der Waals, que hacen que la
celulosa se envase en microfibrillas. Las hemicelulosas y lignina cubren las
microfibrillas (p.3714).
Buranov & Mazza (2008) también indican que: “El principal obstáculo para la
utilización de la biomasa de cultivos herbáceos es la completa separación de los
complejos lignina - carbohidratos (LCC) la cual protege a la celulosa en la
hidrólisis enzimática y la fermentación” (p.238). Adler; Liu & Wyman (citados por
Buranov & Mazza, 2008) hablan de: “La digestibilidad enzimática de la biomasa
para la producción de bioproductos y biocombustibles depende principalmente
de su contenido de lignina” (p.238).
Por lo tanto, la extracción de la lignina de las plantas herbáceas es de suma
importancia y la utilización de la lignina extraída dará lugar a la producción industrial
de productos valiosos de alimentos e industriales tales como la vainillina, ácido
ferúlico, guayacol de vinilo y los lignanos ópticamente activas, los dímeros de
monolignoles” (Buranov & Mazza, 2008, p.238).

“La falta de procesos amigables con el medio ambiente, rentables y prácticos

limitan el uso de la paja en procesos a escala industrial. Por ello, el pretratamiento
es un estado clave en la hidrólisis enzimática de lignocelulosas” (Wooley et al.,
citado por Poornejad et al., 2013). Kumar et al (2009) refieren que:
El objetivo del proceso de pretratamiento es romper la estructura de la lignina y
romper la estructura cristalina de la celulosa, de modo que los ácidos o enzimas
puedan acceder fácilmente e hidrolizar la celulosa. El pretratamiento puede ser el
proceso más caro de la conversión de biomasa a los combustibles, pero tiene un
gran potencial para la mejora de la eficiencia y reducción de los costes a través de
la investigación y el desarrollo. (p.3714)

Merino & Cherry (citado por Van Dyk, J.S & Pletschke,B.I, 2012) advierten que:
La selección del método de pretratamiento tiene un impacto sobre la hidrólisis
enzimática subsecuente y debe estar basado en varias consideraciones: Costo del
pretratamiento, (…), el grado en que se elimina la lignina, (…), el grado en que el
pretratamiento hidrolizaría polisacáridos dentro de la biomasa lignocelulósica, (…),
prevención de productos de degradación de azúcar (así como furfural a partir de
xilosa) y productos de degradación de lignina (…), mejora significativa de la hidrólisis
enzimática después del pretratamiento con un bajo requerimiento de cargas
enzimáticas. (p.1461)
Los métodos de pretratamiento pueden ser divididos en diferentes categorías:
físicas (molienda y pulverizado), fisicoquímicas (pretratamiento con
vapor/autohidrólisis, hidrotermólisis, y oxidación húmeda), química (álcali, ácido
diluido, agentes de oxidación, y solventes orgánicos), biológicos, eléctricos, o una
combinación de esos (Kumar et al, 2009). Sin embargo, hay varios defectos
asociados a esas técnicas tales como condiciones de reacción severas, alto
consumo de energía, toxicidad, operación costosa, costo de recuperación de
eliminación y velocidades de reacción lentas (Elgharbawy, Alam, Moniruzzaman
& Goto, 2016).

“La hidrólisis lignocelulósica a menudo pone resistencia a la degradación debido

a la cristalinidad e insolubilidad de la celulosa” (Zhang Y. & Lynd L., citados por
Khare S. et al, 2015). “En este contexto, el uso de líquidos iónicos está emergiendo
rápidamente como una estrategia eficaz para el pretratamiento de biomasa
lignocelulósica recalcitrante” (Gräsvik J. et al, citados por Khare S. et al, 2015).

Lan Mai, Ahn & Koo (2014) sostienen que:

Los líquidos iónicos (LIs), conocidos también como Líquidos iónicos a temperatura-
ambiente (RTILs), son sales que están compuestas sólo de iones y tienen punto de
fusión por debajo de 100°C. Los líquidos iónicos, en general, han atraído mucha
atención en comunidades académicas e industriales como una alternativa
prometedora para solventes orgánicos volátiles debido a sus propiedades únicas así
como presión de vapor despreciable, no inflamabilidad, amplia ventana
electroquímica, y buena estabilidad química y térmica. (p.872,873)
“También son caracterizados por su capacidad de diseño, no volatilidad,
reciclabilidad y solventes de excelentes propiedades para disolver solutos de
polaridad variada” (Raj et al, 2016). Olivier-Bourbigou, Magna & Morvan (2010)
afirman que “los mejores solventes para materiales lignocelulósicos se encuentra
que son el [Bmim][Cl] y especialmente el [AMIM][Cl] para madera dura y blanda”
(p.47).

También Olivier-Bourbigou et al. (2010) refieren que:

El líquido iónico es responsable de la ruptura de enlaces de hidrógeno de la matriz
del complejo lignocelulósico. Esto es mayormente atribuido a aniones de LI,
especialmente al anión cloruro. De la misma manera como celulosa, el catión puede
jugar un rol no despreciable en la solubilización. (p.48)
Así, Kilpelainen et al (citado por Olivier-Bourbigou et al, 2010) sugieren que
existen interacciones π- π entre el catión LI y los compuestos aromáticos de
lignina (p.48).
Otro pretratamiento que permite una hidrólisis enzimática con rendimientos de
azúcar altos es aquel trabajado con alcóxidos (alcoholatos).

Zhang et al (citado por Huang et al, 2016) afirma que:

Son bases más fuertes que las correspondientes bases de hidróxido de sodio e
hidróxido de potasio. Además, cuando los alcoholatos se disuelven en agua, se
producen etanol o metanol, los cuales tienden a actuar como solventes orgánicos
que ayudan al rompimiento de la estructura compleja de la biomasa lignocelulósica.
(p.465)
Según Huang et al (2016), teóricamente hablando, el pretratamiento con
CH3ONa, CH3OK y C2H5ONa, trabajando como una combinación de álcalis y
solventes orgánicos, pueden tener un mejor efecto sobre la remoción de lignina
y el mejoramiento de la eficiencia enzimática que un pretratamiento solo con
álcalis o órgano-solv (p.465).

Además, Sanchez et al (citado por Huang et al, 2016) indica que “los alcoholatos,
tales como CH3ONa, CH3OK y C2H5ONa, usualmente son usados como
catalizadores en producción de biodiesel por catalizar la reacción de
transesterificación entre aceite y metanol” (p.465).

Por consiguiente, en esta investigación se evaluará la influencia que tiene el

pretratamiento, ya sea por líquidos iónicos o por alcóxidos, sobre el rendimiento
de la hidrólisis enzimática.
2. JUSTIFICACIÓN

Los pretratamientos de los residuos lignocelulósicos se han convertido en un

punto clave para incrementar la eficiencia de los procesos de sacarificación
enzimática; debido a las limitaciones que tiene este proceso, la más importante
es la solubilidad limitada de la lignocelulosa compuesta principalmente de
lignina, hemicelulosa y celulosa.

Dentro de los pretratamientos funcionales se encuentran los pretratamientos con

líquidos iónicos y con alcóxidos, los cuales por su mayor efecto en remoción de
lignina, mejoramiento de la eficiencia en la hidrólisis enzimática, posibilidad de
reuso y bajo impacto ambiental hacen de éstos, alternativas ecológicas y
eficientes para el aprovechamiento de los residuos agroindustriales.

3. PROBLEMA

¿Cómo influyen el pretratamiento con un líquido iónico y un alcóxido sobre el

rendimiento en la hidrólisis enzimática de la paja de arroz?

4. HIPÓTESIS

Se espera que el líquido iónico Cloruro de 1-Butil-3-metilimidazolio (BmimCl)

siguiendo el proceso descrito por Raj et al (2016), remueva la mayor cantidad
de lignina y disminuya el nivel de cristalinidad de la paja de arroz por debilitación
de enlaces hidrógeno intra-/inter-molecular (Kim, Ahn & Kwak, 2016), lo cual es
mayormente atribuido a los aniones del líquido iónico, especialmente al anión
cloruro (Olivier-Bourbigou, Magna & Morvan, 2010).

Asimismo, se espera que el alcóxido Etóxido de Sodio (EtONa) según el proceso

descrito por Huang et al (2016); remueva la mayor cantidad de lignina, ya que
tienden a actuar como solventes orgánicos que ayudan al rompimiento de la
estructura compleja de la biomasa lignocelulósica (Huang et al, 2016).
 De esta forma contribuyen a mejorar el rendimiento de azúcares obtenidos en la
sacarificación enzimática con la enzima Celluclast 1.5L, el rendimiento esperado
siguiendo el proceso descrito en la hidrólisis enzimática es de 99% (Poornejad
et al, 2013).

5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO PRINCIPAL:
 Determinar la influencia del tipo de pretratamiento en el proceso de
hidrólisis enzimática con la paja de arroz

5.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

 Caracterizar la composición fisicoquímica de la paja de arroz.
 Determinar las mejores condiciones del pretratamiento con un
Líquido Iónico (Cloruro de 1-Butil-3-metilimidazolio).
 Determinar las mejores condiciones del pretratamiento con un
Alcóxido (Etóxido de Sodio).
 Comparar los rendimientos obtenidos en la hidrólisis enzimática con
cada uno de los pretratamientos.
 Desarrollar un protocolo de identificación de azúcares obtenidos en
la hidrólisis enzimática mediante cromatografía líquida UHPLC.

6. METODOLOGÍA DE TRABAJO
El desarrollo de este proyecto está dividido en 3 etapas consecutivas de distinta
duración cada una con objetivos cuantificables.

6.1. MATERIAL DE ESTUDIO

Como material de estudio se usará paja de arroz, residuo generado en
la producción de arroz, el cual se ha obtenido de las ciudades de
Pacasmayo y Chepén por ser de mayor accesibilidad.
6.2. METODOLOGÍA DE ESTUDIO

6.2.1. Molienda y caracterización química de la materia prima

La paja de arroz con la que se trabajará, será llevada a sequedad en

una estufa a 60 °C por 24 horas. Luego estos serán molidos y
después tamizados hasta pasar por malla 40 y ser retenido en la malla
70, consecuentemente se procederán a guardar en bolsas
herméticas para su conservación y posterior uso. En esta etapa
además se realizará la caracterización química (α – celulosa, β –
celulosa y ϒ- celulosa, lignina soluble e insoluble, cenizas y
extractivos) según la metodología: Determination of acid-insoluble
lignin in biomass (NREL & MRI, 1995) y Determination of acid-soluble
lignin in biomass (NREL & MRI, 1996), Standard Method for Ash in
Biomass, Standard Method for the Determination of Extractives in
Biomass (NREL & MRI, 1994), Alpha-, beta- and gamma- cellulose in
pulp de acuerdo a TAPPI (2009).

6.2.2. Pretratamiento

Para el pretratamiento de la paja de arroz se procederá a utilizar 2

métodos: uno mediante el uso de líquidos iónicos y el otro mediante el
uso de alcóxidos.

a. Pre tratamiento con Líquidos Iónicos (LI)

La metodología dada por Raj et al (2016), servirá como guía en el

proceso de pretratamiento con líquidos iónicos.

Se preparará una solución de biomasa al 10% p/p, mezclando 0.5 g

de biomasa (paja de arroz en base seca) con 4.5 g de Cloruro de 1-
butil-3-metilimidazolio (BmimCl) en un balón de dos bocas con cuello
esmerilado de 50 ml a temperatura ambiente (25°C). Luego, se
 precalentará en un baño controlado a la temperatura deseada (80 y
100°C) con agitación magnética (300 rpm). Se continuará con el
pretratamiento para los periodos de tiempo deseados (2 y 5h)
después se añadirá lentamente 17.5 ml de agua desionizada caliente
(50 – 60°C) para precipitar la biomasa disuelta. Se enfriará la mezcla
hasta temperatura ambiente y se centrifugará a 9 500 rpm por 10 min
para separar la fase sólida (biomasa recuperada) y líquida (LI y
agua). La biomasa recuperada se lavará 5 veces con agua caliente
(5 x 40 ml) para remover el exceso de LI. Se verificará la ausencia de
LI en el agua de lavado por medio de la medición de absorbancia a
240 nm.
Se analizará la composición química de la biomasa pretratada y el
porcentaje de biomasa recuperada se hallará por diferencia de pesos.

b. Pretratamiento con Alcóxidos

Se seguirá la metodología descrita por Huang et al (2016), con las

modificaciones que sean necesarias.

Las condiciones para el pretratamiento de la muestra seca con

Etóxido de Sodio (C2H5ONa) estarán establecidas en un rango de
concentraciones del alcóxido (1%, 3% y 5% p/v) con una carga del
sólido de 10% (p/v), siendo las temperaturas a usar 100 y 121°C con
un tiempo de pretratamiento de 1h. La muestra pretratada será lavada
hasta pH neutral con agua desionizada caliente (aprox 90°C) y
secada al aire.
Se analizará la composición química de la biomasa pretratada y el
porcentaje de biomasa recuperada se hallará por diferencia de pesos.
 6.2.3. Hidrólisis enzimática del residuo pretratado

En la hidrólisis enzimática se seguirá la metodología descrita por

Poornejad, Karimi & Behzad (2013), con algunas modificaciones:

Se someterá la muestra pretratada a una hidrólisis enzimática por un

periodo de 72 h.
Se añadirá 0.3 g de sustrato para 30 ml de buffer de citrato de sodio
50mM (pH 4.8). Por un periodo de 20 min a 121°C se mezclarán en
un autoclave, luego se añadirán 0.5 g/l de azida de sodio, como un
agente antibacterial.
La mezcla se dejará enfriar hasta temperatura ambiente.
Posteriormente se añadirá 20 FPU/g de la enzima (Celluclast 1.5 L,
Novozyme, Denmark) y la hidrólisis se llevará a cabo a 45°C y 100
rpm por 72 h, en una incubadora con agitación (Raj et al, 2016).
Finalmente, las muestras líquidas serán tomadas y analizadas
periódicamente (cada 8h) para cuantificar el contenido de azúcar,
utilizando la técnica de Miller o DNS (ácido dinitrosalicílico) (Miller,
1959), comprobándose mediante cromatografía líquida UHPLC.

6.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

Para la presente investigación se tiene:

- Población: Paja de arroz (residuo lignocelulósico) de la región La Libertad
- Muestra: 20 Kg de paja de arroz

Y se ha establecido dos diseños factoriales para la etapa de pretratamiento:

- Pretratamiento con [Bmim][Cl]: se usa un diseño factorial 22, teniendo

como factores A: Temperatura de pretratamiento; B: Tiempo de reacción
de pretratamiento, cada uno con 2 niveles denotados por A1: 80°C, A2:
100°C y B1: 2h, B2: 5h, respectivamente. Con 3 repeticiones haciendo un
total de 12 tratamientos los cuales se realizarán de manera aleatoria.
 Se mantendrá constante la concentración de la solución de biomasa
(residuo en base seca + LI).
Como variable dependiente se tiene el contenido de azúcar después de
la hidrolisis enzimática, y como variables independientes la temperatura
de pretratamiento y tiempo de reacción de pretratamiento.

FACTORES Temperatura de Tiempo de reacción

pretratamiento de pretratamiento
(A) (B)
NIVELES

1 A1 B1

2 A2 B2

- Pretratamiento con C2H5ONa: se usa un diseño factorial 2 x 3, teniendo

como factores C: Concentración de C2H5ONa; Y: Temperatura de
pretratamiento, con 3 niveles para C denotados por C1: 1%, C2: 3% y C3:
5% (p/v) y 2 niveles para Y denotados Y1: 100 °C, Y2: 121 °C. Con 3
repeticiones haciendo un total de 18 tratamientos los cuales se realizarán
de manera aleatoria.
Se mantendrá constante la concentración del residuo en base seca (10%
p/v) y el tiempo de pretratamiento (1h).
Como variable dependiente se tiene el contenido de azúcar después de
la hidrolisis enzimática, y como variables independientes la
concentración de C2H5ONa y la temperatura de pretratamiento.
 Concentración Temperatura de
FACTORES
de C2H5ONa pretratamiento

NIVELES (C) (Y)

1 C1 Y1

2 C2 Y2

3 C3

- Adicionalmente se realizarán 3 ensayos sin pretratamiento como muestra

blanco para evaluar el rendimiento de la hidrólisis enzimática sola.

Luego se analizará con ANOVA para determinar la diferencia significativa entre

los factores a ser evaluados y su efecto en el rendimiento de azúcares obtenidos
en la hidrólisis enzimática. Al finalizar se realizará el análisis de varianza
respectivo, mediante el método Dunnet usando un software estadístico.

7. POSIBLE CONTRIBUCIÓN E IMPACTO

Se espera determinar las mejores condiciones para los pretratamientos con LI y

alcóxidos para una hidrólisis enzimática eficiente.
Además, contribuir con la mejora del medio ambiente con el uso de estos
solventes en los pretratamientos, que con sus propiedades fisicoquímicas
permiten llamarlos “químicos verdes”, ya que pueden reemplazar a los
compuestos orgánicos volátiles y desarrollar procesos químicos limpios y
sostenibles.
Los LI se presentan como una alternativa económicamente rentable debido a
que pueden ser recuperados y reutilizados por destilación y extracción.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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