(ASPECTOS CELULARES Y MOLECULARES DEL NUCLEO SUPRAQUIASMATICO EL RELOJ CIRCADIANO DEL MAMIFERO La adecuada coordinacién en el tiempo de los distintos procesos que mani- fiestan los seres vivos, desde el nivel molecular hasta el conductual, es un requisito para mantener en condiciones éptimas su equilibrio interno y en Sltima instancia su adaptacién al ambiente que los rodea. Dicha coordinacién cen el tiempo no se refiere tan solo a una adecuada secuencia de eventos fisio- logicos concatenados entre 0s fisiolégicos complejos —relativamente independientes ino a la anticipacién y coincidencia de proce- tre si— de los que dependen los cambios de estado conductual y de manejo energético, tales ‘edad. Asi, el orden temporal de los procesos fisiolégicos resulta de una organiz ‘én temporal codificada en el genoma de los organismos. Hemos propuesto el concepto de cronostasia para referimos a los procesos de regulacién fisiolégica que mantienen dicha organizacién temporal. La manifestacién més conspicua de la organizacién temporal de los organismos son los ritmos bioldgicos, los cuales se presentan en un amplio rango de frecuencias relacionadas @ ciclos geofisicos. Los ritmos biolégicos se denominan con el prefijo circa y el sufijo del fenémeno al que se relacio- + El reloj circadiano del mamifero + El sistema circadiano + Los niicleos supraquiasmaticos como oscilador circadiano + Las aferentes al niicleo supraquiasmatico y la sin- cronizacion + Las eferentes al nucleo supraquiasmatico y las salidas del reloj + La Pineal como integrador de fase de los ritmos circadianos + Aspectos moleculares del oscilador + El mecanismo de oscilador del reloj + Sefializacién intracelular en la sincronizacién a la luz + @Cuales son los genes blanco sobre los que acttia pCREB? + Los engranes de salida del oscilador + Bibliografia AGUILAR-ROBLERO, RADL. MERCADO, CLARA, GUADARRAMA, PARMENIDES y CHAVEZ, JOSE LUIS. En: Hernandez, M.E. y Ortega, A. (Eds.). Fisiologia celular y molecular Principios y con- ceptos. Unversdad Veracruzana, 2004, pp. 181-192| 184) Figura 1. Esquema de los principales ‘elementos del sistema circadiano en roedores: IGL, hojuela intergeniculada; SPVz zona subparaventricular; PYN, hipotalamo paraventricular; ILC, columna intermedio lateral; SCG, ganglio cervical superior; PVT, ‘alamo paraventricular; NRD, ncleos del Rafe. FISIOLOGIA CELULAR ¥ MOLECULAR | PRINCIPIOS Y CONCEPTOS nian (cireamareales, citcadianos, citcalunares y cireanuales). De interés para el presente capitulo son los ritmos circadianos, es decir, aquellos que se pre- sentan con una periodicidad cercana a un ciclo por dia, Los procesos cronosidticos que regulan los ritmos circadianos involu- can un sistema, denominado circadiano, spaz de medir el tiempo biologico ¥y ajustarlo al tiempo geofisico derivado de la rotacién de la tierra, EI sistema circadiano esta formado por oseiladores euyo periodo es cercano a 24 h, que sirven para medir el tiempo biolégico; viay de sincronizacién que ajustan la fase de los osciladores a fendmenos derivados del ciclo dia-noche, vias de transmision que comunican la fase del ciclo circadiano a los sistemas efec~ tores para que el organismo exprese los ritmos circadianos, y mecanismos de entre los distintos ‘acoplamiento encargados de ajustar el periodo y la fase osciladores del organism. En el presente capitulo revisaremos el sistema circadiano en los mamiferos desde un punto de vista integrativo, y resumiremos el conoci- miento acerca de las bases celulares y moleculares de los osciladores eitea- dianos en vertebrados. Como se apreviara alo largo del desarrollo del texto, nos referiremos fundamentalmente a los procesos de oseilacién y sincronizacién Por luz por ser los mejor conocides, mientras que acerea de los procesos de transmisién y acoplamiento nuestro conocimiento es atin incipiente. EL SISTEMA CIRCADIANO El sistema cireadiano de mamiferos se ha estudiado principalmente en roe- dores y en relacién a la luz como estimuto sincronizador, aunque también se reconoce actualmente la existencia de otros osciladores que serian sin- eronizados por otros estimulos como la disponibilidad del alimento. Asi pues, el sistema sineronizable por la luz se ilustra en la Figura 1. El oscilador o mar- ceapasos citeadiano se localiza en fas miicleos supraquiasméticos (NSQ), sus aferentes y eferentes forman las vias primarias de sincronizacion y de trans- misién del ritmo generado por los NSQ, la ghindula pineal y la melatonina son elementos importantes, aunque probablemente no los tinicos, en el mecanismo de acoplamiento. Los nticleos supraquiasmaticos como oscilador circadiano En los mamiferos, los nicleos supraquiasmaticos se loealizan en la poreién ventral del hipotalamo anterior, ventrolateral al receso éptico del tercer ven- triculo y dorsal al quiasma éptico (Figura 2). Cada NSQ esti formado por aproximadamente 8,000 neuronas de tamaio pequeiio —entre 8 y 12 jum de didmetro—, empaquetadas en forma muy compacta lo que permite su ficilD) ‘CAPITULO XIV | EL RELOJ CIRCADIANO18 | AGUILAR-ROBLERO et al. identificacién en cortes coronales tefiidos con técnicas de Nissl. Las neuronas del NSQ expresan diversas sustancias neuroactivas, principalmente péptidos, que se distribuyen en dos poblaciones neuronales: una dorsomedial caracte rizada por la presencia de vasopresina, y una ventrolateral caracterizada por la presencia del péptido intestinal vasoactivo (VIP); la mayoria de las neuronas si no es que todas—sintetizan GABA, por lo que la colocalizacién de GABA. ¥ por lo menos otros dos péptidos son el comiin en las neuronas del NSQ. En estos miicleos se encuentran también un nimero abundante de astrocitos acti vvados, es decir que expresan proteina fibrilar écida de la glia (GFAP). La lesién bilateral de los micleos supraquiasmiticos produce la desor- ganizacién del patron citeadiano que caracteriza diversas conductas y parimetros fisiolégicos, mientras que el transplante del NSQ fetal en ani- males lesionados restablece algunos de los ritmos desorganizados por dicha lesion (Figura 3). Asimismo, la estimulacién eléetriea © quimica de estos micleos induce cambios de fase similar a los provocados por la exposicion ala uz. Una de las caracteristicas mas importantes del NSQ es que presenta un ritmo intrinseco de su actividad eléctrica y metabélica, cuyos valores maxi- mos ocurren durante el dia. Estos ritmos persisten aiin cuando los sujetos se exponen a condiciones de iluminacién constante ¢ incluso cuando el NSQ se registra en condiciones in vitro . El registro simultinco de varias neuronas en cultivo muestra que la capacidad de generar el patrén cireadiano de activi- dad es inherente a cada una de las neuronas del NSQ, aunque las interac ciones sinépticas dentro del niicleo parecen participar en el acoplamiento de Jos osciladores individuales. Las aferentes al nuicleo supraquiasmatico y la sincronizacion Las neuronas del NSQ sincronizan su actividad con el ciclo dia-noche. La informacién sobre el grado de iluminacion ambiental es necesaria para man- tener la sincronizacién, La cantidad de luz ambiental es detectada en la retina pero no exclusivamente por los fotorreceptores que se usan para la vision, ya que los animales ciegos por degeneracién congénita de los conos y los bas- tones atin son capaces de sineronizarse al cielo luz-obscuridad. Aparentemente, los fotorreceptores circadianos son un tipo especial de célula ganglionar de la retina, que se caracteriza por tener un campo receptivo visual muy amplio y codificar la cantidad de luz (lumini el movimiento de objetos en el espacio. A diferencia del resto de células gan- sglionares de la retina, estas neuronas poseen el fotopigmento Melanopsina, <1 cual es necesario para la adecuada sineronizacién de los ritmos a la luz. Los axones de estas células ganglionares forman el tracto retino-hipotali- cencia) y no la posicion o 185 A 3 ventriculo NSO Hipotélamo Anterior Figura 2. A. Esquema de un corte coronal del Inipotélamo de rata que muestra las relaciones ‘anatémicas del ndcleo supraquiasmatico (NSQ), el nivel del corte esta indicado en la vista lateral del cerebro. B. Corte histol6gico tefido ‘con la técnica de Nissl, las tineas punteadas ‘indian et NSQ del lado derecho, 3Y, tercer ventriculo; QO, quiasma dptico,186 FISIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR | PRINCIPIOS Y CONCEPTOS Figura 3. La lesfén del NSQ abole el ritmo circadiano de locomocién en el hamster, mientras que el transplante del NSQ fetal lo restablece. A. Micrografia en campo obscura ‘que muestra el transplante temtido por Jnmunohistoquimica contra el péptido intestinal vasoactivo. La barra de calibracin es de 200 ium, 8. Esquema que muestra la reconstruccién del sitio lesionado y la ubicacion det transplante. El érea mostrada en A se indica en ‘el recuadro. C. Registro de un animal con lesién del NSQ dos semanas antes el dia en que recibié Un transplante de NSQ fetal se indica por la G. LD, luz obscuridad; DD, obscuridad continua; Sk fotoperiodo esqueteto. mico que Hega a la porcién ventrolateral del NSQ, estos axones liberan un aminoicide excitador, probablemente glutamato © N-acetylaspartylglutama- to, y el péptido hipofisiario activador de la adenilato ciclasa (PCAP). Como era le esperarse, la seeciGn selectiva del tracto retino-hipotakimico impide la sineronizacién de los ritmos circadianos al ciclo de iluminacién ambiental sin afectar la visiGn espacial Diversos aspectos del proceso de sineronizacién a la luz han sido estu- diados a través de la curva de respuestas de fase. Esta estrate te en determinar el efecto que tienen estimulos breves aplicados a diferentes ‘momentos de un ciclo eircadiano en libre curso, sobre una fase de referencia del ritmo en estudio, La curva de respuestas de fase se caracteriza por tres regiones: una zona donde la aplicacién de pulsos de luz no producen respues- tas (dia), una zona en la que el estimulo avanza el reloj (inicio de la noche), Yy una zona en la que el estimulo atrasa al reloj circadiano (final de la noche). Mediante el uso de la curva de respuestas de fase, se ha determinado que los pulsos de luz actian en las neuronas del supraquiasmatico a través n glutamatérgicos, tanto NMDA como AMPA, en todas las fases del ciclo. No Stores obstante, las neuronas del niicleo supraquiasmitico activan diferentes vias de sefializacién intracelular en forma dependiente del momento del ciclo en que se presentan los estimulos, Como veremos mas adelante, fico de segundos mensajeros que es activado determina la direceién en que el reloj cambiari su fase. Algunas colaterales del tracto retino-hipotalimico proyectan bilateral- mente a una regién del cuerpo genieulado lateral del télamo llamada hojuela intergeniculada (IGL). A partir de la hojuela se origina otra aferente del NSQ denominada tracto geniculo hipotalimico, Otras a cias al supraquik mitico se originan del complejo del rafe y el nucleo paraventricular delCAPITULO XIV | EL RELOJ CIRCADIANOTE | AGUILAR-ROBLERO et al. tilamo, Tanto Ia hojuela intergeniculada como el niicleo del rafé proyectan a la res mn ventrolateral del NSQ con fibras ‘que contienen neuropéptido-Y y serotonina respectivamente, Estas aferentes también participan en ta integracién de la informacién del nivel de ifuminacién en el ambiente para ajustar el inicio de ta actividad de los ritmos cireadianos con cl inicio de la obscuridad. También se ha propuesto que la IGL puede ser un relevo —junto con el PVT— para transmi- tir informacién no-fética hacia el NSQ, es decir informacién de indole sensorial diferente a la luz, como pueden ser ruidos, temperatura 0 movimiento. A través de estas vias se posibilita que diversos estimulos también puedan ejercer influencia ‘como sineronizador de los ritmos circadianos. EI niicleo paraventricular del tilamo (PVT) presenta abundantes conexiones reciprocas eon los NSQ. Las termi- nales del PVTT que aleanzan el NSQ se distribuyen tanto en la regién dorsomedial como en la ventrolateral —a diferencia del resto de aferencias al NSQ mencionadas anteriorment. PVT participa como modulador de la respuesta del NSQ a la luz, principalmente durante el final de a noche; ademas de ser una via de entrada de informacién visceral y de modalidades sensoriales no faticas hacia el NSQ. La lesién del PVT ante- rior invierte el efecto de pulsos de luz aplicados al final de noche, mientras que su estimulacién eléctrica © quimica induce cambios simi res a los producides por pulsos de luz. ‘Como era de esperarse, la estimulacién eléctrica del PVT SQy su respuesta a la estimulacién de la via retino-hipotakimica ‘modifica la actividad espontinea de las neuronas de! ccon pulsos de luz, Las eferentes al nucleo supraquiasmatico y las salidas del reloj Uno de los aspectos menos comprendidos del sistema circa- diano es e6mo se transmite la sefial de tiempo generada por el NSQ haci sindptica es en principio la via natural de comunicacién en el cl resto del organismo, Aunque Ia transmisién sistema nervioso, debido a s 's caracteristicas de largo plazo por su naturaleza cireadiana, también se ha considerado a la transmisién quimica por via neuroendécrina © por trans- misién de volumen como posible mecanismo de transmisién. Existen datos que apoyan la participacién de Jos distintos pro- 187 cesos de -omunicacién intercelular antes mencionados, por lo que lo mis probable es que el proceso de transmisién de la seftal de tiempo desde el oscilador hasta el resto del organismo involucre una mezcla de los mecanismos antes mencionados. Las vias efer tes del NSQ se onganizan en tres grupos Prineipales: un grupo de fibras se dirige rostralmente e inerva la region ventrolateral del rea predptica y el septum: otro grupo de fibras cursa dorsal 0 lateral y se dirigen hacia télamo, las fibras dorsales inervan el niicleo paratenial y el tilamo paraventricular (ambos del grupo de nicleos intrala- ‘minares), mientras que las fibras laterales cursan hacia el cuerpo geniculado ventrolateral y especialmente hacia la hojuela intergeniculada; finalmente el tercer grupo de fibras se dirige caudalmente hacia el neuropito en el borde ventrola~ teral del ndcleo paraventricular del hipotilamo —una regién pCREB), Se cree que la interac- cidn de pCREB sobre el elemento de respuesta al AMPe (CRE) localizado en la regién promotora de diversos genes blanco modificaria su expresion para adelantaro reirasar la maquinaria molecular del relojcircadiano La via intracelular entre el aumento del Ca** y-la formacién de pCREB ain es sujeto a intensa investigacién y debate. Por una parte existen datos que indican que el Ca" se une a la calmodulina (CaM), el complejo Ca‘*/CaM funciona como una quinasa (CaMK-II) que fosforila la proteina de unién al CREB, Por otra parte, también se ha demostrado que a entrada de Ca* activa la via de las quinasas de proteinas activadas por mitgenos (MAPK), también llamadas quinasas. reguladas por seflales extracelulares (ERK). Se ha reportado que la activacién de la via MAPK/ERK también par- ticipa en la fosforilacién de CREB, Finalment también se ha propuesto que durante la primera mitad de la noche subjetiva, el C que ingresa a la neurona activa directamente los canales de calcio ser ibles a la rianodina (RyR) localizados en el reticulo endoplasmico ¢ induce la movilizacién de los depésitos intracelulares de Ca°*, Esta liberacién del Ca"* intracelular eventualmente conduciria a la fos- forilacin de CREB y al retraso del reloj. Mientras que cuando los pulsos de luz se aplican en la segunda mitad de la noche subjetiva, la entrada de Ca cextracelular induce la sintesis de éxido nitrico el cual induce la formacion de sa G GMP ciclico. Este iiltimo indu activacién de la Proteina Q (PKG) que fosforila el CREB, y tiene como res tado el avance del reloj. yACAPITULO XIV | EL RELOJ CIRCADIANOIE | AGUILAR-ROBLERO et ol. Cabe resaltar que tas propuestas anteriores no son necesariamente excluyentes entre si, No obstante, la ima propuesta es sumamente atractiva porque ¢s fa tinica que trata de explicar las diferencias del efecto de la luz sobre el reloj cuando se aplica al inicio (retraso) o al final (avance) de la noche subjetiva, aunque no existe veri iin por grupos de investigacion diferentes al que la proponen. Las otras propuestas son mas sélidas ya que han sido verificadas —aungue slo sea parcialment por varios grupos independientes de investigacién 4Cuales son los genes blanco sobre los que acta pCREB? Una ver fosforilado, pCREB se une al elemento de respuesta, al AMPe (CRE), localizado en la regién promotora de diversos genes. En el easo par- ticular de las neuronas det NSQ existe gran debate aiin sobre la identidad del ‘© los genes blanco de pCREB. Entre los posibles eandidatos se ineluyen per, pery c-fos ¥ jut-b, con menor probabilidad también se han mencionados a fral. fra2, nur77y zif268. Todos estos genes presentan el elemento CRE en su promotor, su transcripeién es fotoinducible 1S minutos después de la apli- cacién de pulsos de luz, y la sensibilidad de la fotoinduccién de estos genes ¢ similar a la que induce adelantos y retrasos de los ritmos de conducta —con excepeién de nur77 y zif268 cuya sensibilidad de fotoinduccién es muchas veces mayor. Los estudios con animales manipulados genéticamente se han enfoca- do en c-fos y pery. Animales carentes de la proteina Fos atin son capaces de expresar cambios de fase aunque de amplitud disminuida, mientras que muta- cciones en per; varian en el fenotipo conductual de acuerdo con el sitio afec- tado dentro del gen entre periodos cortos con cambios de fase normales (exones 4 al 10 del dominio PAS), petiodo inestable con ausencia de avances de fase sin afectar los retrasos (exones 4 al 18) y patrones arritmicos en 2), La principal eritica a estos estu los sujetos con este tipo de mutaciones pueden haberse adaptado a través del desarrollo (0 desenmascaramiento) de funciones de las proteinas codificadas por genes relacionados. Tal es el caso de las proteinas Jun-B, Fra, Per y Cry. obscuridad continua (exone: ses que Una altemativa a las limitantes en la intempretacion de los experimentos con mutantes es ef uso de oligonucleotides antisentido (OAS) administrados localmente. Estos oligonucleotides bloquean transitoriamente la expresion de ‘genes especificos al impedir la traduccidn del RNA mensajero, y sélo aetiian en el sitio de su administracién, lo que permite analizar el efecto agudo de la inhibicién en la expresién de un gen en un sitio especifico del sistema nervioso. ‘Con esta herramienta se ha observado que la inyeccién de OAS para c-fos, jun by per, disminuye la expresion de las proteinas respectivas en el NSQ y blo-|92: | FISIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR | PRINCIPIOS Y CONCEPTOS \ ‘quea 0 disminuye los cambios de fase en Ia conducta inducidos por pulsos de luz, De lo expresado anteriormente queda claro que la identificacién de las vias intracelulares de sefializacién y los genes blanco involucrados en el proceso de sincronizacién a la luz dista ain de completarse. Los engranes de salida del oscilador Uno de los aspectos menos comprendidos de la maquinaria molecular del reloj en las neuronas det NSQ se refiere a las vias moleculates por las que el ‘oscilador molecular afecta el funcionamiento de la neurona. Se considera ‘que existe un grupo de genes controlados por el reloj (CCG) a través de los que cl asa de retroalimentacién de trascripcién-traduccién se conecta al resto de la célula. En principio estes CCG podrian presentar dominios E-Box, PAS, D-Box, HLH en su regién promotora, entre tales genes se ha identificado por lo menos al de Vasopresina. Por otra parte, con el uso de la técnica de microarreglos, que permite verificar simulténeamente la presencia de alrede- dor de 10,000 genes activados o inhibidos, se ha podido determinar que e ten un gran nimero de genes que presentan modulacién circadiana en su expresién (Tabla 1). Dichos genes se pueden agrupar en aquellos relaciona- dos con la sintesis de neurotransmisores y péptidos neuromoduladores; otto grupo lo forman genes relacionados a la regulacién del estado redox y la regulacién de la energia, genes relacionados con procesamiento y secrecién de proteinas. ‘Tenemos que enfatizar que hasta el momento todo este impresionante cdimulo de informacién es meramente descriptivo, sin embargo, forma el punto de partida para entender en qué consiste el proceso de transmision de la sefal de tiempo, desde el oscilador molecular hasta el ritmo en actividad eléctrica y metabstica que earacteriza a las neuronas del NSQ. Son estos patrones de neurosecrecién circadiana y de la generacion de un patrén de potenciales de accién modulado en forma circadiana, los que forman el primer engrane en la via de salida det reloj, al permitir la comunicacién entre las neuronas del NSQ y el resto de neuronas reguladoras en el Sistema Nervioso Central193 (CAPITULO XIV | EL RELOJ CIRCADIANO18 | AGUILAR-ROBLERO et al. ‘Tabla 1. Genes que presentan variaciones circadianas en su expresion. GENE DESCRIPCION ‘ACROFASE Control del citoesqueleto Kealfa-l ‘Tubulina alfal (citoesqueleto) 12:00 tub 5 Tubulina beta2(citoesqueleto) 21:49 pin Dineina citoplasmatica (ensambla proteinas del citoesqueleto) 12:00 tgoin2 Proteina de la red del Transgolgi ors4 Control energético ndufl Deshidrogenasa NADH(lavoprotefnal) coxéal Citocromo oxidadsa C subunidad VI ar6p2 Ribosilacién de ADP (factor 6) g6pt! Protefna I del transportador de glucosa-6-fosfato Regulacién de Ca?** cacng6 Canal de Ca?** voltaje-dependiente subunidad 6 19:10 Proteina P22 1830 Calmodutina 1 17:40 Calmodulina 2 05:40 Regulacién de proteinas G gpr27 Proteina G acoplada al receptor 27 18:52 dextas 1 Proteina inducida por dexametasona (afecta proteinas G) 15:00 csnklal Caseina —Kinasa alfa 1 06:19 calb2 Calbindina 20:57 Regulacién de receptores chrnb2 Polipetido 2 beta del receptor nicotinico 09:44 Gadi Descarboxilasa del écido glutimico 15:47 Cok Colecistokinina 15:56 gabarapll Proteina asociada al receptor GABA(a) 05:10 Via(avprla) Receptor arginina-vasopresina(|*) 22:20 oprst Receptor sigma opioide ne 0127 penkl Preproencefalina 1 O1:SI194 FISIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR | PRINCIPIOS Y CONCEPTOS \ BIBLIOGRAFIA “Agnes Gnuat, IM Deleado, C Escobar, R Aguilar Roblero. Los relojes que gobieman la via, SE todos/188), 2002, México, Fondo de Culturs Esonomies (la Ciencia para + Aguilar Roblero R, Escobar Briones C. 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