En el aislamiento del DNA, una gran dificultad es el de mantener una molécula tan larga y rígida físicamente intacta.

Se
ha demostrado que las fuerzas de fricción que se establecen cuando una solución de DNA es agitada vigorosamente, son
suficientes para romper la larga y rígida molécula de DNA. Las moléculas se rompen primero cerca de la parte media,
después en cuartos y así sucesivamente hasta que se alcanza un tamaño lo suficientemente corto para que la molécula
sea relativamente insensible a la ruptura por fricción. Es difícil extrapolar el peso molecular del DNA encontrado en una
solución, con respecto al peso molecular real que existe in vivo por la gran facilidad de degradación por fricción durante
la extracción o por la inadvertida acción de enzimas hidrolíticas. Quizás las mejores estimaciones se deriven del trabajo
radioautográfico en el cual el DNA es marcado con tritio. Por ejemplo, en E. coli, Cairns pudo detectar moléculas de DNA
de hasta 1.1mm de longitud. Esto corresponde a un peso molecular de 2.8X109 . De manera similar, el DNA del
bacteriófago T2 tiene una longitud promedio de 49 µ, lo cual corresponde a un peso molecular de 108 . Un bacteriófago
bastantemente más pequeño, llamado λ, tiene un DNA de 23 µ de longitud. Pero aún en la muestras más cuidadosamente
preparadas de DNA extraído siempre hay 0.1 a 0.2% de proteínas ligadas al material. Por lo tanto, existió la posibilidad
que una molécula de DNA esté hecha por cadenas más pequeñas unidas por materia proteico o peptídico. A pesar de
esto, la síntesis exitosa in vitro, conocida como reacciones de la cadena circular doblemente cerrada del DNA ΦX 174 en
su forma replicativa, capaz de infectar células huésped, hace probable que dichas moléculas de DNA estén compuestas
de nucleótidos. Un método para aislar DNA casi libre de proteínas y RNA fue publicado, por ejemplo, por Marmur. Las
paredes celulares bacterianas son digeridas con la lisozima o se rompen con un detergente. El perclorato de sodio es
utilizado para disociar el ácido nucleico y las proteínas, y la solución es desproteinizada por agitación con una mezcla de
cloroformo y alcohol isoamílico. El RNA es removido con ribonucleasa o por centrifugación en un gradiente de densidad
de cloruro de Cesio. En este gradiente, el RNA, el cual tiene una densidad mucho mayor que el DNA, es precipitado en el
fondo del tubo de centrifugación. El DNA puede ser precipitado selectivamente con alcohol isopropílico. La actividad de
la desoxirrobonucleasa puede ser minimizado si las fases se llevan a cabo en presencia de agentes quelantes o en
presencia de un detergente como dodecil sulfato de Sodio. Este procedimiento ofrece DNA biológicamente activo como,
por ejemplo, DNA transformante. Sin embargo, el DNA obtenido es de alguna manera degradado por las fuerzas de
fricción desarrolladas durante la agitación. Un procedimiento alternativo para el aislamiento de DNA altamente
polimerizado a partir de tejidos animales es el método de extracción con Fenol de Kirby, en el cual las proteínas son
desnaturalizadas en la interface fenol-agua y los ácidos nucleicos son extraídos en la capa acuosa. El RNA será removido
como se menciona para el método anterior y el DNA será precipitado. Para la examinación con el microscopio electrónico,
las soluciones de DNA son pulverizadas sobre la malla y se secan rápidamente. El DNA nativo da claramente moléculas
largas, rígidas y en forma de vara, mientras que el DNA desnaturalizado por calor, o por alguna otra forma de
desnaturalización (espiral aleatoria), moléculas en forma de “charcos”. Casi todas las moléculas nativas de DNA en
solución, provenientes de una gran variedad de fuentes tienen estructura de doble hélice como se demuestra por el efecto
hipercrómico, que ocurre cuando una solución de DNA es calentada. Por otra parte, el DNA desnaturalizado es una cadena
flexible, pobremente enroscada y de cadena polielectrolítica, muy dependiente de sus propiedades hidrodinámicas en un
ambiente iónico. De hecho, el DNA desnaturalizado en solución es bastante similar al RNA de alto peso molecular, el cual
muestra cierta estructura secundaria, sin significar que esta este completa. También, son estrechamente similares los
polirribonucleótidos sintéticos de cadena sencilla, sintetizados por la polirribonucleótido fosforilasa. En general, la
estructura secundaria del DNA nativo depende del contenido de sus bases nitrogenadas Guanina y Citosina (G + C). Entre
mayor sea el contenido de G + C, mayores serán las fuerzas que mantienen juntas a las dos cadenas. Esto es posible debido
a que la Guanina y la Citosina pueden formar tres puentes de Hidrógeno cuando se encuentran apareadas en la estructura
de DNA, mientras que Adenina y la Timina pueden formar solo dos (ver Fig. 2.3). El efecto hipercrómico es el incremento
en la absorbancia observado cuando el DNA de doble hélice es desnaturalizado a la forma de cadena sencilla.

En un caso análogo (Fig. 2.11), los dos polirribonucleótidos ácido poliadenílico (ó Adenosin Polifosfato) y ácido poliuridílico
(ó Uridina Polifosfato), cuando se encuentran mezclados tienen una absorbancia menor a 260 nm que aquella calculada
para ambos polímeros medidos por separado. Esto es porque estos polirribonucleótidos pueden formar pares de bases
Adenina-Uracilo. En cuanto a los polidesoxirribonucleótidos, se espera que se comporten de manera similar. Otra forma
de observar el efecto hipercrómico es mediante la destrucción de la estructura de doble hélice a través de la acción
hidrolítica de una nucleasa (Fig. 2.12). Además, existe el efecto hipercrómico residual, el cual está presente aún en los
polímeros de cadena sencilla medidos de manera separada, y que sólo se pone de manifiesto cuando el polímero se rompe
en sus mononucleótidos. También los di y trinucleotidos presentan efecto hipercrómico residual. Esto se debe
presumiblemente a una interacción entre bases vecinas ligadas o unidas una a la otra como oligo o polinucleótidos. La
estructura nativa del DNA es estable a un intervalo de pH entre 2.7 a 12 y la molécula se desnaturaliza por encima o
debajo de estos valores de pH. La configuración del DNA es inestable a temperatura ambiente cuando la fuerza iónica es
menor a 10-4 M. Si la densidad óptica a 260 nm se lee a 25°C para el DNA T2 (ver la curva en la Fig. 2.13a), se observará
que no hay cambio en la absorbancia cuando dicha solución es calentada hasta que se alcanza una temperatura de
alrededor de 75°C. Si se continua el calentamiento, la densidad óptica de la solución de DNA incrementará en un 35%
aproximadamente, en un intervalo alrededor de 4°C. Eventualmente, la absorbancia se estabiliza a un valor característico
al del DNA desnaturalizado. El DNA desnaturalizado puede ser detectado mediante una observación al microscopio
electrónico o por el gran decremento en la viscosidad de la solución de DNA. Para describir el efecto hipercrómico
cuantitativamente, podemos definirlo en términos de una temperatura Tm (temperatura media de desnaturalización) a
la cual el proceso está parcialmente completo. El valor de Tm es característico para una clase particular de DNA y es
dependiente, a primera vista, del contenido de G + C en ese DNA a un pH y fuerza iónica específicos. De hecho, Marmur
y Doty han deducido una ecuación empírica:

Tm = 69.3 + 0.41 (G + C)

donde (G + C) es el contenido de Guanina más Citosina en porcentaje molar del total del contenido de bases. El cambio
en la absorbancia es característica y sorprendentemente brusco para el DNA, indicando que la fusión de la estructura de
doble hélice del DNA es un fenómeno cooperativo. En otras palabras, tan pronto como unos cuantos pares de bases
comienzan a separarse, hay una inmediata facilitación correspondiente de la fusión de los pares de bases vecinas. También
se deduce que la conformación del DNA original debe haber sido bastante perfecta y que la mayoría, si no es que todas,
las bases son complementarias de sus pares de Watson-Crick. Si la solución calentada es enfriada rápidamente se obtiene
la curva b (en Fig. 2.13a), a partir de la cual se puede observar que la densidad óptica no regresa a su valor original, aún a
25°C. En efecto, si existe un decremento en la absorbancia, pero es mucho menor que el incremento esperado si las
moléculas de DNA regresaran a su conformación original de doble hélice altamente ordenada. Las preparaciones de DNA
que fueron calentadas y enfriadas rápidamente, aún presentan una forma enroscada al azar a 25°C, como se puede
observar mediante la examinación al microscopio electrónico y por la medida de su viscosidad relativa.

Si, por otro lado, la muestra de la solución de DNA calentada ahora es enfriada extremadamente lento, tomando tal vez
3 horas para descender la temperatura desde 91°C hasta 48°C, la absorbancia del DNA a 25 ºC regresa casi a su valor
original; esto equivale a decir que la estructura de doble hélice, con su apareamiento de bases correcto, está altamente,
si no es que completamente, restaurado. Marmur, Doty y sus colegas, han mostrado que, si este calentamiento y
enfriamiento, este proceso de recalentado, se lleva a cabo con DNA transformante biológicamente activo de D.
pneumoniae, es posible recuperar una cantidad importante, tal vez un 70 %, de la actividad biológica original. Este alto
porcentaje de reactivación de la capacidad transformante indica que la estructura exacta de doble hélice se restaura bajo
estas condiciones, al menos en algunas regiones de la molécula de DNA. La temperatura óptima para la renaturalización
del DNA bacteriano es de aproximadamente 25°C por debajo de su Tm a una concentración de Na+ 0.4 M. La
concentración de DNA debe mantenerse baja (alrededor de 6 µg/mL) para minimizar la agregación.
La renaturalización del DNA es un proceso extraordinario, considerando la gran longitud de las dos cadenas sencillas
enroscadas al azar del DNA desnaturalizado, las cuales tienen que encontrar su posición exacta de apareamiento para
poder así restaurar una doble hélice correcta. La renaturalización se lleva a cabo mejor en moléculas pequeñas de DNA
fágico y con mayor dificultad en las grandes moléculas de DNA de organismos superiores. El DNA de E. coli ocupa una
posición intermedia, dependiendo del grado de fragmentación de la preparación de DNA. La facilidad de renaturalización
está relacionada con la probabilidad de que cualquier parte de una cadena sencilla de nucleótidos encuentre su secuencia
complementaria y se aparee con ella. Una vez que se ha logrado esto, el resto de las cadenas se renaturaliza rápidamente.
La probabilidad de este inicio de la renaturalización se incrementa en gran medida si el DNA es químicamente
entrecruzado antes de la desnaturalización o si las cadenas permanecen íntimamente entrelazadas después de la
desnaturalización.