RESUMEN

En todo lo que nos rodea podemos encontrar microorganismos, estos pueden ser tan pequeños
que simplemente no son visibles a ojo humano, pero aportan a que organismos de mayor tamaño
continúen con su existencia, ya que hacen posible que se cumplen diversas funciones esenciales
permitiendo que se desarrolle la vida. Gracias a esto, es importante que podamos interpretar los
resultados de las diferentes morfologías, agrupaciones y métodos más comunes para diferenciar
entre bacterias y hongos. Las diferentes morfologías y agrupaciones que posee cada
microorganismo es una de las rutas utilizadas para este fin, además uno de los métodos que más
se utilizan es la tinción de Gram, es empleada para entender la estructura de los microorganismos,
con eso se puede dar una idea del tipo de microorganismo que es, un ejemplo de esto E. coli el
cual presenta una tinción Gram negativa mientras que Bacillus sp presenta una Gram positiva.

PALABRAS CLAVES: Recuento, microorganismos, aislamientos, medio de cultivo

INTRODUCCIÓN
Conocer la estructura y composición de un determinado microorganismo es de vital importancia
dado que al estar presente en nuestro ecosistema deberemos saber cómo se relaciona con el
hombre o como pueda tener un uso a nivel industrial. Muchos de estos microorganismos han
podido ser utilizados por el ser humanos en diferentes industrias para lograr generar productos de
interés. Estos pueden ser para la fermentación en la industria cervecera, vacunas que pueden
significar el avance en medicina, elaboración de alimentos, industria textil, entre otras (Cifuentes
& Espinosa, 2008).

Aunque existan diferentes medios de cultivo, podemos agruparlos según su estado físico, en
sólidos, líquidos y semisólidos, pero también según su utilización. En práctica para hacer un
aislamiento de un cultivo de hongos es posible utilizar el agar Rosa Bengala o el Sabouraud, esto es
posible ya que estos solo permiten el crecimiento de hongos y esporas debido a que poseen
cloranfenicol, un pH neutro y altas concentraciones de glucosa (INSTRUCCIONES DE USO - Medios
en placa listos para usar, 2013).

Mientras que, para realizar cultivos de bacterias es posible utilizar agares como lo son: MRS,
MacConkey, Casoy, XLD, Almidón, Cetrimide y Leche. El agar MRS, el agar Casoy es un medio
enriquecido debido a que además de tener sustancias indispensables para el crecimiento del
microorganismo, el agar MacConkey es por su parte, un inhibidor, ya que inhibe el crecimiento de
bacterias Gram positivas pero no el inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas, el medio
XLD, el Cetrimide y el XLD son medios selectivos porque permiten el crecimiento de colonias de
una población polimicrobiana. Por último el agar de leche es un medio de cultivo enriquecido.

Las bacterias pueden clasificarse en Gram positivas o en Gram negativas dependiendo de la

composición de su pared celular. Las Gram negativas poseen una capa delgada de péptido glucano
y una membrana externa, mientras que las Gram positivas poseen una capa gruesa de péptido
glucano y carecen de membrana externa. La tinción de Gram es una técnica diferencial que
permite hacer la clasificación descrita anteriormente, para ello, la muestra es puesta en contacto
con cristal violeta, el cual tiene afinidad con el péptido glucano y tiñe la pared de color morado,
después se adiciona lugol para formar un complejo cristal violeta-yodo y así evitar la salida del
cristal violeta. Posteriormente se añade una mezcla alcohol-acetona la cual deshidrata la pared
bacteriana y cierra sus poros. Las bacterias Gram positivas retienen el complejo cristal violeta-
yodo debido a que presentan en mayor proporción péptido glucano, mientras que las bacterias
Gram negativas se decoloran al no poseer gran cantidad de esta estructura. Finalmente, se añade
safranina, el cual es un colorante secundario, que tiñe de rosado las bacterias que se decoloraron
previamente (Gram negativas).

Por medio de esta práctica se busca reconocer las diferencias macroscópicas y microscópicas de
las bacterias y hongos. Para lo anterior es necesario conocer las diferentes técnicas de siembra y
aislamiento de estos microorganismos, utilizando cultivos enriquecidos, selectivos y diferenciales
para dicho fin.

MATERIALES Y MÉTODOS
1.1) Materiales: Para llevar cabo la siembra de las bacterias Staphylococcus aureus, E. coli,
Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis se utilizaron los agares Casoy, XLD, MacConkey,
MRS, Leche, Almidón, Cetrimide. Para la siembra por estrías se utilizó 90ml de caldo Casoy
esteril y una muestra de agua. Para realizar las fijaciones se utilizaron diferentes láminas,
mechero y para su tinción su utilizó el kit de tinción de Gram, Para las diluciones se utilizó
una micro pipeta de 1000μL y tubos de ensayo de 16x150. Finalmente, para realizar la
caracterización y observar los detalles es preciso contar con un microscopio.

1.1.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Casoy, MacConkey
y MRS con los nombres de los diferentes lugares en los cuales se dejarían abiertos
durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una temperatura de 35°C ±
2°C durante 48 horas.

1.1.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los
diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas,
reportando el número de colonias en UFC/30 min

1.1.3) Siembra por estrías en superficie: adicionar la muestra de agua en 90mL caldo de
Casoy estéril, incubar durante 30 min. Transcurrido este tiempo, sembrar por
agotamiento en los diferentes medios. Posteriormente, volver a incubar a 35°C ±
2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas.

1.1.4) Métodos de tinción: Tinción de Gram

Se deben marcar las diferentes láminas con los nombres de los microorganismos,
adicionar una gota de agua destilada a la lámina portaobjetos y con un asa
desechable tomar una pequeña porción de la muestra del cultivo y homogenizarla
con el agua destilada de la lámina. Seguido a esto, dejar secar empleando un
mechero, adicionar 10 gotas de cristal violeta sobre la homogenización y dejar
actuar durante 1 min, retirar el exceso de colorante con agua destilada y agregar
 10 gotas de Lugol sobre la homogenización, dejar actuar esperando por 1 min,
después retirar el exceso nuevamente con agua destilada, a continuación,
adicionar 10 gotas de Alcohol acetona y dejar actuar durante 30seg retirando el
exceso posteriormente con agua destilada. Finalmente, adicionar 10 gotas de
Fucsina sobre la lámina y dejar actuar durante 1 min, retirando con agua destilada,
fijar la muestra a la lámina para obsérvala con un microscopio y detallar sus
características.

1.2) Materiales: Para llevar cabo la siembra de hongos en las muestras de cascara de naranja,
agua residual, hojas y manos se utilizaron los agares de Sabouraud con cloranfenicol y
Rosa de Bengala.

1.2.1) Técnica de sedimentación: Se marcaron las cajas de los agares Sabouraud con
Cloranfenicol y Agar Rosa de Bengala con los nombres de los diferentes lugares en los
cuales se dejarían abiertos durante 30 min, transcurrido este tiempo, se incubo a una
temperatura de 35°C ± 2°C desde 48 horas a 5 días.

1.2.2) Recuento: Al pasar las 48 horas realizar el conteo de colonias obtenidas en los
diferentes medios, realizando además una observación macroscópica de estas, reportando
el número de colonias en UFC/30 min

1.2.3) Técnica de dilución: adicionar la muestra de agua en 90mL de agua peptonada

0,1%(p/v) estéril, agitar y realiza diluciones 1/10 hasta tener una dilución de 10-5.

1.2.4) Siembra en superficie: Marcar las cajas Petri, tomar 0,1 ml de cada dilución y
realizar la siembra en cada agar, después de esto incubar a 28°C ± 2°C desde 48 horas a 5
días.

1.2.5) Recuento: Pasado este tiempo, observar las diferentes siembras y seleccionar las
que tengan un rango de colonias entre 25-250, reportar el número de colonias en
UFC/gmL.

1.2.6) Recuento en cámara de Nuebauer: Con la ayuda de un capilar rellenar la cámara y

hacer el conteo de las células que se encuentren en los cinco cuadrantes principales,
después calcular el número de células.

1.2.7) Siembra por estrías en superficie: Realizar siembra masiva en ¼ de la caja agar de
Sabouraud y Rosa de Bengala, relizar siembra por agotamiento. Posteriormente, volver a
incubar a 35°C ± 2°C durante 48 horas y realizar la descripción de las colonias obtenidas.

1.2.8) Caracterización Microscópica de Mohos:

Con ayudad de una cinta, tomar una muestra ejerciendo presión sobre el cultivo, luego
presionarla contra una lámina previamente con azul de lactofenol en su superficie, realizar
la descripción microscópica de los cultivos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para la técnica de sedimentación se emplearon tres medios de cultivo y se dejaron expuestos al

medio ambiente durante 30 minutos dentro de un carro. Los resultados obtenidos en cada agar, es
decir, las características macroscópicas de las colonias, se describen a continuación en la Tabla 1.

CONCLUSIONES
A partir de los resultados obtenidos en la tinción de Gram se puede comparar las diferentes
estructuras que componen la pared celular de las bacterias, E. coli y Klebsiella son bacterias Gram
positivas por lo que presentan una pared celular con gran porcentaje de péptido glucano, mientras
que, Bacillus y S. aureus son bacterias Gram negativas es decir presentan una pared celular
compuesta de membrana externa y en menor cantidad por peptidoglicano.

Las técnicas macroscópicas y microscópicas hicieron posible la diferenciación de bacterias y

hongos, en el caso de las bacterias la técnica de aislamiento permitió describir morfológicamente
las colonias y con esto se puede concluir que el medio de cultivo influye en la morfología colonial
de las bacterias, esto debido a que cada medio tiene componentes nutricionales diferentes.

Por otro lado, se evidencio la presencia de hongos y levaduras en ambientes comunes, algunos de
estos microorganismos son patógenos o pueden producir infecciones como Alternaría y Mucor,
mientras que otros conviven con nosotros sin generar ningún daño, y por el contrario son
microorganismos de gran importancia biotecnología, como A. niger, S. cerevisiae, Penicillium sp y
E. coli.

A partir de los resultados obtenidos al realizar el recuento de células en hongos se puede

evidenciar que la levadura crece más rápido que la suspensión de esporas.

Referencias
Benavides, H. A. (2007). Guía De Aplicación De Técnicas de Microbiología (Bacterias y Hongos)
Para Ser Utilizado En Microbiología General. Trabajo de Grado, Universidad de El Salvador,
Facultad de Química y Farmacia, San Salvador.

Brown, V. I., & Lowbury, E. J. (1965). Use of an improved Cetrimide Agar Medium and of culture
methods for Pseudomonas aeruginosa. Journal of Clinical Pathology, 18(6), 752-756.

Buitrago, S., Sánchez, E., & Guerrero, H. (Ener-Junio de 2014). Aislamiento de microorganismos
amilolíticos, celulolíticos y lignolíticos a partir del suelo de humedales de Bogotá.
SENNOVA, I(1), 148-155.

Cabello, R. R. (2007). Microbiologia y parasitologia humana . medica panamericana .