Guatemala, 6 de Junio de 2,018 José Fernando Moreno

Ing. Carmen Garcia

Ingeniería Química Carnet: 1198814
Bioquimica
Práctica No. 1
Post laboratorio

Separación e Identificación de Aminoácidos

por cromatografía de capa fina
Índice
Abstract ............................................................................................................................................... 2
Resultados........................................................................................................................................... 3
Discusión de resultados...................................................................................................................... 5
Conclusiones ....................................................................................................................................... 7
Referencias ......................................................................................................................................... 7
Apéndice ............................................................................................................................................. 8
 Abstract
La práctica no.1 del laboratorio de Bioquímica se llevó a cabo el día miércoles 30 de mayo
del 2018, la cual se titulaba “separación e identificación de aminoácidos por cromatografía
de capa fina”. Esta práctica tubo como objetivos específicos determinar el factor de
retención Rf de los aminoácidos Lisina, cisteína, Metionina, acido glutámico y una muestra
problema, utilizando la técnica de cromatografía en capa fina, siendo la fase estacionaria
una placa de silica gel y como fase móvil una solución de n-butanol: agua: ácido acético
(60:20:20). También se buscó determinar los aminoácidos presentes en la muestra
problema, en comparación de los factores de retención de los aminoácidos puros.

Para desarrollar la práctica se utilizó la placa cromatográfica de silica gel ya activada, se

saturo la cámara cromatográfica utilizando la solución de n-butanol: agua: ácido acético; se
punteo con un capilar las soluciones de aminoácido en la placa para desarrollar la
cromatografía. Se colocó la placa en la cámara cromatográfica, permitiendo que el eluyente
subiera a lo largo de la placa hasta una altura considerada adecuada y se esperó a que este
secara. La placa se colocó en el horno y posteriormente se revelo con ninhidrina y se calculó
el Rf de cada recorrido.

Los Rf obtenidos para la Cisteina, lisina , Acido Glutamico, metionina y muestra problema
fueron 0.485,0.151, 0.288, 0.454, 0.424 respectivamente. Y se determinó que el aminoácido
presente en la muestra problema fue cisteína, con una variación en su Rf de 14.38%.
 Resultados

Tabla no.1 Rfs calculados

Aminoácido Rf Calculado
Cisteína 0.485
Lisina 0.151
Acido Glutamico 0.288
Metionina 0.454
Muestra no.2 0.424

Tabla no.2 Porcentaje de variación de cada Rf respecto a la muestra

Rf De aminoácidos % de variación respecto a
muestra
0.485 (cisteína) 14.38%
0.151 (Lisina) 64.38%
0.288 (ácido glutámico) 32.07%
0.454 (metionina) 7.07%

Tabla no.3 Aminoácidos presentes en la muestra analizada

Muestra analizada Aminoácidos
Muestra no.2 Cisteína

Tabla no.4 Observaciones

Procedimiento Observaciones
Cromatografía en capa fina  La cromatografía se comenzó
agregando la solución de n-butanol:
agua: ácido acético en la cámara
cromatográfica y se observó la
saturación de la misma.
 Al agregar las muestras de
aminoácidos en la placa de cilica
gel, estos fueron incoloros.
 Al desarrollarse la cromatografía el
eluyente ascendió por la placa de
forma lenta, por capilaridad.
 Al revelar la placa con ninhidrina los
aminoácidos presentaron
coloraciones, violetas, amarillas y
rosadas, lo cual permitió
determinar sus Rf.
Tabla no.5 Reacciones
 Discusión de resultados

La práctica realizada consistió en determinar el/los aminoácidos presentes en una muestra

de problema en la cual se encontraba presente un aminoácido desconocido, la
identificación de dichos aminoácidos se realizó mediante la aplicación de la técnica de
cromatografía en capa fina. Para esto se determinó el valor de Rf de la muestra desconocida
y el valor de Rf (referirse a tabla no.9) de 4 aminoácidos distintos: cisteína, lisina, acido
glutámico, metionina. El valor de Rf de los aminoácidos se comparó con el valor de la
muestra para determinar poder determinar a cuales se hallaban presentes en la muestra
problema.
Para la práctica se utilizó como fase móvil una solución de n-butanol: agua: ácido acético
(60:20:20) y como fase estacionaria una placa de silica gel.

Mediante la técnica de cromatografía en capa fina permite separar los distintos compuestos
presentes en una muestra en base a su polaridad. En base a Kurman (2001) el adsorbente
(fase estacionaria) utilizado en la práctica, silica gel, posee propiedades polares que
permiten fijar moléculas polares en su superficie al darse interacciones dipolo-dipolo entre
la superficie de la placa y las moléculas, de manera que los aminoácidos que se quedan
retenidas con mayor facilidad y rapidez en la placa son aquellas que presenten un dipolo en
su cadena lateral R (es decir un enlace entre un átomo más electronegativo a otro).
En la cromatografía de capa fina el eluyente (fase móvil) que se utiliza suele ser menos polar
que la fase móvil. Para la practica el eluyente utilizado fue una solución de n-butanol: agua:
ácido acético, dicha solución presenta solventes polares (agua, acido acitico) y un solvente
relativamente polar (n-butanol).
En base a Casares (2006) el eluyente a utilizar debe de ser lo suficientemente polar para
poder desplazar los componentes polares presentes en las muestras a analizar, pero
también debe tener cierto carácter polar para poder desplazar aquellos compuestos no
polares presentes en la muestra; en el caso de utilizar un eluyente muy polar aquellos
solutos presentes en las muestras que sean apolares no serán transportados a lo largo de
la placa cromatográfica, por otro lado en el caso de utilizar un eluyente que sea
completamente apolar únicamente los solutos no polares serán transportados a lo largo de
la placa cromatográfica. El eluyente seleccionado para la práctica tiene la característica de
tener una propiedad polar por parte del agua y el ácido acético, pero también permite
movilizar y separar los compuestos no polares gracias a las ligeras propiedades no polares
que posee el n butanol, como consecuencia de su cadena de hidrocarburos.

Para el desarrollo de la práctica se buscó saturar la cámara cromatográfica con el eluyente,

lo cual se logró al colocar un papel filtro rodeando el interior de la misma y permitiendo que
el eluyente se adhiriera a esta por capilaridad, esto permitió que la cámara se encontrara
llena de vapores del eluyente y que la cromatografía fuera más eficiente. Para obtener una
visualización clara de los resultados se tomaron en consideración ciertos parámetros, como
el tamaño de la muestra colocado en la placa y la distancia a las cuales fueron colocadas, ya
que si las muestras tenían un radio muy grande o se encontraban muy cercas unas de otras
se hubieran podido haber torcido durante el recorrido de separación y hubieran traslapado
entre ellas, razón por lo cual esta técnica es propensa al error humano y dependerá de las
observaciones del analista.

Para poder determinar los aminoácidos presentes en la muestra desconocida (muestra

no.2) se analizaron y determinaron los valores de Rf (referirse a tabla no9) de una serie de
aminoácidos estándares (cisteína, lisina, acido glutámico, metionina) para asi compararlos
con el valor obtenido para la muestra. En base a Skoog (2015) el Rf es una relación entre la
distancia recorrida por la fase móvil de la cromatografía con respecto a la distancia recorrida
por los componentes (solutos) separados. El valor de Rf también permite analizar la afinidad
de cada componente por el solvente (eluyente o fase móvil), a mayor afinidad del
componente por el solvente mayor será su valor de Rf. Esta afinidad también puede ser
interpretada como la solubilidad del componente (soluto) por el solvente.

En base a Skoog (2015) en la cromatografía de capa fina se presenta una separación de los
solutos presentes en una muestra como consecuencia de un equilibrio producido por la
afinidad del soluto tanto con la fase móvil (eluyente) como con la fase estacionaria
(eluyente). La atracción del soluto con respecto a la fase estacionaria o la fase móvil se
producirá por efecto de interacciones intermoleculares que se producen entre el soluto y
cada una de las fases.
En la práctica la fase móvil se desplazaba a través de la fase estacionaria por efecto de la
capilaridad, la cual depende de dos fuerzas principales la cohesión entre moléculas
semejantes y fuerzas de adhesión entre moléculas distintas.
A medida que la fase estacionaria se desplazó por la fase estacionaria y pasaba por la parte
de la placa en que se encontraban colocadas las soluciones de aminoácidos, estos fueron
separándose y movilizándose a lo largo de la palca a medida que lo hacia la fase móvil
(eluyente). Entre más polares fueron los aminoácidos estos tenían una mayor capacidad de
formar interacciones dipolo-dipolo con la placa cromatográfica, haciendo que estos se
retuvieran más rápido en la fase estacionaria y que no se desplazaran una distancia a lo
largo de la placa cromatográfica, mientras que aquellos aminoácidos menos polares
tendrán una mayor atracción a la fase móvil (la cual es menos polar que la estacionaria) y
recorrerán una mayor distancia respecto a la placa cromatográfica. Esta afinidad y
distribución de los aminoácidos entre las dos fases viene determinada por las cadenas
laterales (grupos R) de los mismos.

En base a Horton (2008) y como se puede esperar por sus estructuras (referirse a Tabla
no.12)los aminoácidos Lisina y acido glutámico son aminoácidos polares con carga, por
dicha razón, y como se puede confirmar con los resultados de la práctica (consultar tabla
no.9) se esperaría que estos aminoácidos tengan los valores de Rf más bajos debido que
además del hecho de ser polares, la presencia de carga conduce a que se produzcan
interacciones dipolo- dipolo e interacciones ion-dipolo más intensas, lo cual produciría a
que estos aminoácidos se retengan con mayor facilidad en la fase móvil más polar y que su
valor de Rf sea menor en comparación a los demás. Por otro lado los otros dos aminoácidos,
Cisteina y Metionina, son clasificados como aminoácidos polares neutros, los cuales debido
a que no presentan una carga no son retenidos con la misma facilidad que los otros dos
aminoácidos, dicha razón permite que se muevan una distancia mayor a lo largo de la placa.
Como se puede observar por su estructura y por lo que dice la teoría, La cisteína presenta
un Rf menor a la metionina debido a que la cisteína puede formar enlaces puentes de
hidrogeno, lo cual le hace tener una mayor interacción con un compuesto polar (en este
caso la placa de silica gel) y que se retenga dicho aminoácido con mayor rapidez que la
metionina. A pesar que valores teóricos de Rf no serán iguales a los obtenidos en la práctica,
se pueden tomar como referencia para comparar si dichos valores se encuentra en un
resultado aceptable para el experimento, lo cual se puede decir que si entran en un valor
considerablemente aceptable al evaluar la variación que tienen con respecto a los valores
teóricos (referirse a la tabla no.9)

Para poder concluir respecto a que aminoácidos se encontraban presente en la muestra

desconocida de aminoácidos (muestra no.2) se comparó el porcentaje de variación del Rf
de cada uno de los aminoácidos estándares con el Rf de la muestra, teniendo que el valor
de Rf con menor variación fue el de la metionina; a pesar que el valor de Rf con menor
variación al de la muestra fue la metionina, se concluyó que la muestra contenía cisteína,
no solamente en base al cálculo de variación del Rf (valor de 14.38%, referirse a tabla no.)
sino que también por la coloración que esta presento al reaccionar con la Ninhidrina el cual
es similar al de la cisteína (referirse a imagen no.2). Con base en Jorrin, J. (S.f.) la ninhidrina
reacciona con aminoácidos el grupo amino libre de los aminoácidos para dar una coloración,
la cual puede servir como método cualitativo para la determinación de aminoácidos. En la
práctica el uso de la ninhidrina fue requerido para dar coloración a los aminoácidos y que
así fuera posible identificar el recorrido que cada uno de ellos tuvo en la placa, ya que sin
ello estos eran incoloros.

Conclusiones
 Los Rfs obtenidos para la Cisteina, lisina , Acido Glutamico, metionina y muestra
problema fueron 0.485,0.151, 0.288, 0.454, 0.424 respectivamente.

 La muestra analizada se encontraba compuesta por cisteína, con la cual tuvo un

porcentaje de variación de 14.38% respecto a su Rf y una coloración más similar al
revelarse con ninhidrina.

Referencias

Bibliográficas

 Bier.M. (1999). Métodos de separación. México: Pearson. Recuperado de

http://www.bioquimica.dogsleep.net/Laboratorio/Plummer/Chp03b.pdf
 Casares, W. A. (2006). Análisis ultravioleta visible la teoría y la práctica en el ejercicio
profesional . México: Universidad autónoma de Yucatán .
  Kurman, L. G. (2001). Química Orgánica Fundamentos teóricos prácticos. México: EUDEBA.
 Skoog, D. (2015). Química Analítica (9na ed.). Australia: Cengage learning.
 Horton H., Robert; Moran, Laurencen A. (2008) Principios de la Bioquímico. Editorial
Pearson Educación, México ISBN 978970261056

En Línea
 Jorrin, J. (S.f.) Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina. Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Rabanales, Cordoba. Disponible en:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/11%20CROMATOGRAFOA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf

Apéndice
Diagrama de equipo

Imagen no.1

Datos Originales

Tabla no.6 Volumen agregado de eluyente

Eluyente Volumen añadido
Solución de n-butanol: agua: ácido acético 10±0.05 mL
(60:20:20)

Tabla no.7 Distancia recorrida por el eluyente y los aminoácidos sobre la cromatoplaca
Compuesto Distancia recorrida
Eluyente (solución n-butanol: agua :ácido 6.6 ± 0.05 cm
acético)
Cisteína 3.2 ± 0.05 cm
Lisina 1 ± 0.05 cm
Ácido Glutámico 1.9 ± 0.05 cm
Metionina 3 ± 0.05 cm
Muestra no.2 2.8 ± 0.05 cm
Tabla no.8 Valores teóricos de Rf para aminoácidos
Aminoácido Valor de Rf
Cisteína 0.37
Lisina 0.12
Acido Glutámico 0.31
Metionina 0.51
Valores obtenidos de: Reach Devices USA (2010-2017)

Datos calculados

Tabla no.9 Valores de Rf determinados para cada aminoácido y la muestra, y porcentajes de error
Aminoácido Rf Calculado % de error respecto al
valor teórico
Cisteína 0.485 31.1%
Lisina 0.151 25.8%
Acido Glutamico 0.288 7.1%
Metionina 0.454 10.9%
Muestra no.2 0.424 --------------------------

Tabla no.10 % de variación de Rf de cada Amino acido respecto a la muestra

Rf De aminoácidos Rf de muestra (muestra no.2) % de variación respecto a
muestra
0.485 (cisteína) 0.424 14.38%
0.151 (Lisina) 0.424 64.38%
0.288 (ácido glutámico) 0.424 32.07%
0.454 (metionina) 0.424 7.07%

Muestra de cálculos
Tabla no.11 Muestra de cálculos
Valor Formula Descripción Ejemplo
calculado
Relación de 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 Esta ecuación 3.2
𝑅𝑓: 𝑅𝑓:
frentes 𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 presenta la 6.6
relación entre la = 0.485.
distancia
recorrida por la
fase móvil y la
distancia
recorrida por la
muestra.

Tabla no. 12 Estructura de los aminoacidos a analizar

Imagen no.2 Cromatoplaca revelada (fuente propia)