Universidad Técnica Federico Santa María

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental

Laboratorio de Introducción a la Microbiología

Práctico N° 4

“RECUENTO BACTERIANO Y ANÁLISIS DE AGUA”

Objetivo
Los objetivos de este práctico son:
 Conocer técnicas de recuento bacteriano en poblaciones, tanto en células vivas, como
en muertas, comprendiendo su fundamento y aplicación.
 Aplicar las técnicas de recuento en muestras de agua y relacionar su número con la
seguridad para el consumo.

CRECIMIENTO BACTERIANO

Introducción
Crecimiento es el incremento ordenado de todos los componentes de un organismo. La
multiplicación celular es una consecuencia del crecimiento; en organismos unicelulares la
multiplicación conduce a un aumento en el número de individuos, dando lugar a una
población o a un cultivo.
El crecimiento microbiano puede medirse en términos de concentración celular (número
de células por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de las células por
unidad de volumen de cultivo), estos dos parámetros no siempre son equivalentes, debido a
que el promedio de peso seco de la célula varía en las distintas etapas de la historia del cultivo.

Cinética exponencial
Durante la fase exponencial del crecimiento, la tasa de incremento de la masa bacteriana
en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente:

𝑑𝐵
= 𝛼𝐵 (1)
𝑑𝑡

Donde:
B: Masa Bacteriana.
t: Tiempo.
: Tasa constante de crecimiento bacteriano para cada cultivo concreto (es decir el aumento
relativo por unidad de tiempo).

Luego:
𝑑𝐵
= 𝛼𝑑𝑡 (2)
𝐵

Integrando se obtiene que:

ln(𝐵𝑡 ) = ln(𝐵0 ) + 𝛼𝑡 (3)
𝐵𝑡
ln ( ) = 𝛼𝑡 (4)
𝐵0

𝐵𝑡 = 𝐵0 𝑒 𝛼𝑡 (5)

Por tanto, durante esta fase, la representación gráfica del logaritmo natural de B frente al
tiempo da lugar a una línea recta. Esta gráfica semilogaritmica suele ser la que se emplea
para representar curvas de crecimiento bacteriano. Suele ser útil expresar la tasa de
crecimiento como tiempo de duplicación (𝑡𝐷 ), denominado también tiempo medio de
generación (TMG), este valor se obtiene asignando a Bt el valor 2Bo en la ecuación 4 (es
decir, el doble):
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𝐵𝑡
ln ( ) = ln(2) = 𝛼𝑡𝐷
𝐵0

1 1
𝑡𝐷 = ( ) ln(2) = 0,69( )
𝛼 α

1
= 𝜇 = 1,45𝛼
𝑡𝐷

El valor recíproco del TMC, 𝜇 = (1/𝑡𝐷 ), es la tasa constante de crecimiento

exponencial, expresada en generaciones por hora, su valor es 1,45 veces mayor que la tasa
constante de crecimiento instantáneo ; de esta forma el valor de B, y por tanto el de B,
aumenta continuamente durante el crecimiento exponencial, cuando se duplica la masa
bacteriana, la tasa de síntesis celular se duplica con respecto al instante inicial (ver Figura de
gráfica).

RECUENTO DE MICROORGANISMOS

El recuento es un procedimiento que permite conocer el número de microorganismos

que hay en una muestra. Para este propósito, existen diferentes métodos mediante los cuales
se pueden contar microorganismos vivos (recuento de viables), o bien vivos y muertos
(recuento de totales). A su vez todos los tipos de recuento, se pueden clasificar en directos e
indirectos. Un recuento directo es aquel en el que se cuentan las células por observación
directa al microscopio, y el recuento indirecto es aquel en el que se determina el número por
crecimiento o alguna propiedad de los microorganismos.

1.- Recuento de Totales

a) Recuento de Breed

Es un método de recuento directo y se utiliza principalmente para recuento de

microorganismos en la leche. Consiste en depositar un inóculo de muestra homogenizada
sobre un área específica demarcada en un portaobjetos. Para ello se debe dibujar con un lápiz
un cuadrado de un centímetro cuadrado sobre el portaobjeto limpio y desengrasado, luego se
debe homogenizar la muestra problema y con una pipeta Pasteur y colocar una gota de la
muestra (aproximadamente 0,01 ml) sobre el cuadrado extiéndala bien sin salirse de él.
Posteriormente se realiza fijación con calor para luego realizar una tinción simple. Por medio
de un microscopio se realiza un conteo de microorganismos en distintos campos, no menos
de cinco, para luego calcular el promedio de microorganismos contados. Este resultado se
multiplica por 3000 (área del campo del microscopio) y por 100 (inverso del inoculo
colocado en el cuadrado).
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La ecuación para obtener el número de células por mL queda de la siguiente forma:

1
𝑁°𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 = 𝑋 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜 ∙ Á𝑟𝑒𝑎𝑐𝑎𝑚𝑝𝑜 ∙
𝐼𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑜

b) Recuento con cámara de Petroff-Hauser o Hemocitómetro.

Este método consiste en colocar una diminuta gota de cultivo en un portaobjetos

especial llamado Hemocitómetro (porque fue ideado originalmente para el recuento de
glóbulos rojos). La muestra queda depositada en un espacio de 0,02 mm entre el porta y el
cubreobjeto. La excavación completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16 cuadrados
más pequeños. Para calcular el número de células por ml de muestra, se debe hacer la
siguiente operación:

- Contar las células presentes en varios cuadrados grandes y sacar un promedio.

- Multiplicar el promedio por 25 (con esto se obtiene el Nº de células en un mm2).
- Multiplicar por 50 (esto entrega el número de células en un mm3).
- Multiplicar por 1000, para transformar todo a cm3.

Nº cel/ml = X cel x 25 x 50 x 1000

Este recuento representa la cantidad de células vivas y muertas. El método es

aplicable a cualquier suspensión de partículas microscópicas.

c) Recuento con sales de tetrasolium.

Las sales de tetrasolium son un compuesto que se agrega a la preparación, el cual se

reduce como producto del metabolismo y las células se tiñen de color rojo. Las células
muertas quedan sin teñir (el compuesto no es utilizado y queda insoluble).

d) Recuento por Microscopia de Fluorescencia.

Las bacterias se tiñen con naranja de acridina, compuesto que es capaz de integrarse
al DNA bacteriano por lo que las células vivas quedaran fluorescentes. Este método es
también un método de recuento de totales y directo.
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2.- Recuento de células viables.

En muchos casos queremos contar sólo las células vivas. Una célula viva se define como
aquella capaz de dividirse, y un conteo de la viabilidad celular generalmente se efectúa
determinando la cantidad de células de una población que son capaces de dividirse y formar
colonias. El método de conteo en placas es el más ampliamente usado y dos son las versiones
de esta técnica: la placa vertida y la placa extendida.

a) Método de la placa extendida

En el método de la placa extendida, una muestra generalmente pequeña de 0,1 ml se

extiende asépticamente sobre la superficie de una placa de cultivo con el medio adecuado y
bien seco y se incuba hasta que las colonias son visibles a simple vista.
Se entiende que cada colonia se origina de una sola célula por lo tanto contando el número
de colonias se puede calcular la cantidad de células viables de la muestra.

b) Método de la placa vertida

Con el procedimiento de la placa vertida, la muestra se mezcla con el agar el cual debe
encontrarse a una temperatura de 45 a 50ºC colocándose posteriormente sobre la placa de
Petri estéril. Los microorganismos quedan entonces fijos dentro del agar y forman colonias.
Con las placas servidas se pueden emplear volúmenes de muestra de 1,0 ml o más, siendo
posible el recuento de lodos o suspensiones como las que se obtienen de alimentos o medios
homogeneizados. Una desventaja importante de esta técnica es que los microorganismos
dañados por el breve calentamiento del agar fundido no pueden contarse.

El recuento en placa es muy sensible debido a que, en principio, cualquier célula viable,
si se pone en medio de cultivo adecuado, dará lugar a una colonia. Además de su sensibilidad,
el recuento en placa permite también la identificación positiva del organismo que se va a
contar, en vista de que la colonia formada puede servir como inoculo para un cultivo puro
puede a su vez ser identificado taxonómicamente. Más aun, puesto que organismos diferentes
frecuentemente producen colonias diferentes en forma, textura, tamaño y color, diferentes
tipos de organismos pueden contarse en una mezcla. Una de las principales suposiciones en
los procedimientos para el recuento en placa es que cada colonia se origina de una sola célula,
pero sin por el azar dos células quedan dispuestas muy cerca de una de la otra, durante la
incubación, pueden dar origen a una sola colonia fusionada, que no puede diferenciarse de la
que se originó de una sola célula.
La experiencia práctica ha determinado que debe haber menos de 300 colonias por cada
placa de cultivo para minimizar el problema.

c) Método de las diluciones y plaqueo (viables).

Se toma un inóculo de 0,1 ml de un cultivo problema bien homogeneizado el cual se

diluye progresivamente en tubos con 9 ml de solución salina estéril al 0,8% de NaCl.
Las disoluciones se anotan de la siguiente manera: 10-1 , 10-2........ 10-9, 10-10
Se siembra homogéneamente en placas de petri inóculos provenientes de las últimas tres
disoluciones, estas se incuban a temperatura adecuada durante 24-48 horas. Una vez
incubadas las placas, se cuenta el número de colonias que aparecen en cada una de ellas para
obtener un promedio. Tome en cuenta las placas que contengan entre 30 y 300 colonias
solamente. Luego para obtener el número de células por mL se utiliza la siguiente expresión:

1 1
𝑁°𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿 = 𝑋 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 ∙ ∙
𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑠𝑖ó𝑛 𝐼𝑛𝑜𝑐𝑢𝑙𝑜

d) Método Turbidimétrico.

Un medio de cultivo estéril, que ha sido inoculado va presentando turbidez a medida que
la población celular va en aumento. Este fenómeno puede ser medido en un
espectrofotómetro.
Se coloca un volumen medido de cultivo, en un tubo especial de vidrio transparente de
diámetro conocido. Este es interpuesto entre una unidad de foco luminoso, y otra unidad
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fotoeléctrica, la cual está acoplada a un galvanómetro o disco de lectura, el cual registra el

porcentaje de la luz transmitida a través de la suspensión de células. El porcentaje de
tramitancia de la luz a través del tubo se relacionará de manera inversa con la turbidez del
tubo.
Este método es rápido, sencillo y puede determinarse el número de células
correspondiente a cada lectura por recuento en placa. Con él se puede confeccionar la curva
de crecimiento de un cultivo bacteriano, información necesaria cuando se desea trabajar con
cultivos en fase exponencial.

Figura El espectrofotómetro. (a) El espectrofotómetro mide la turbidez, es decir, la cantidad

de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La célula bacteriana
dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a la luz. (b) El tubo de
la izquierda no tiene células bacterianas y está transparente. El de la derecha contiene
alrededor de mil millones (109) de células por mililitro y, por lo tanto, está turbio. (c) La
curva patrón relaciona la absorbancia con el número de células bacterianas por mililitro. Una
vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir cualquier medida de absorbancia
en número de células. Por ejemplo, a partir de esta curva, una lectura de 1,6 unidades de
absorbancia significa que el cultivo contiene 100 millones (108) de células por mililitro

e) Número más probables de microorganismos.

Es posible hacer determinaciones de conteo de viabilidad empleando sólo cultivos

líquidos, con la técnica del Número Más Probable (NMP). En esta técnica, la muestra que va
a ser contada se diluye hasta que la densidad celular sea de menos de 1 célula por ml. En
estas condiciones ya no es apropiado hablar de concentraciones de células, sino más bien de
la probabilidad de encontrar una célula. Por ejemplo, si existen 5 células en 10 ml, la
concentración puede expresarse como 5 x 10-1 células por ml. Sin embargo, las células
viables son desde luego individuales, por lo tanto, decimos que en este ejemplo existe una
probabilidad de 0,5 por cada ml del tubo de que contenga una célula viable. Si el tubo se
vaciara tomando 10 muestras de 1 ml cada una, 5 de ellas se esperaría que contuvieran una
célula y 5 que carecieran de ella. Este concepto es la base del procedimiento del NMP. Se
toma una cantidad de muestra pequeña por duplicado (generalmente 1 ml), de una muestra
diluida, y cada una de ellas es inoculada en un tubo separado de medio fresco de crecimiento,
que posteriormente es incubado para permitir la proliferación del microorganismo. Los tubos
que reciben una célula mostrarán crecimiento (proliferación) y los que no la tienen no
mostrarán crecimiento. La proporción de tubos inoculados que muestran crecimiento es una
medida de la probabilidad que se acaba de mencionar. Esta probabilidad puede convertirse
nuevamente a concentración celular en la muestra, considerando el número de diluciones y
el empleo de las tablas del NMP. Las tablas del NMP son una derivación estadística del
número más esperado o más probables de células que producirá el patrón de crecimiento
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observado. Para que llegue a ser útil es procedimiento del NMP, la muestra debe diluirse lo
suficiente, sino se hace esto, todas las muestras contendrán células viables y todos los tubos
inoculados mostrarán crecimiento cuando se incube. Por el contrario, si la muestra ha sido
muy diluida, ninguno de los tubos inoculados mostrará crecimiento.
El método está diseñado para trabajar con series de 3, 5 y 10 tubos por cada dilución.
Cuando mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor será la precisión del método.

El método del número más probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al

aumentar el factor de dilución, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen sólo
un organismo y los otros, ninguno. A partir del número, determinado por los tubos que
presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede determinarse el
número más probable de células. Este valor, multiplicado por el factor de dilución nos
proporciona el número de células viables de la muestra.

El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar
en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto
que pueden crecer en un medio líquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para
determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que
pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean
Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en
el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

f) Recuento en filtro de membrana.

f.1) Introducción

En 1955 la décima edición de los Standar Methods for Examinacion of Water, incluía
como método tentativo en la determinación de coliformes la técnica de filtración por
membrana. En las ediciones siguientes de esta publicación, éste método se hizo oficial para
la determinación de coliformes. Actualmente, está siendo utilizada como un método
normalizado. Cada laboratorio deber realizar pruebas comparativas con la técnica de los
tubos múltiples con la finalidad de poder aplicarla mejor.
Esta técnica permite examinar volúmenes muy variables de agua y ofrece resultados
directos de la concentración de bacterias coliformes en lugar de un estimado estadístico,
como es el caso de la técnica de los tubos múltiples. Ciertos tipos de muestras no pueden ser
filtradas debido a la presencia de turbiedad, poblaciones excesivamente altas de bacterias no
coliformes, o metales pesados. Estas dificultades pueden encontrarse al examinar muestras
de algunas aguas de pozos, lagos pequeños o efluentes industriales.
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f.2) Resumen del método

El procedimiento de filtración consiste en pasar con ayuda del vacío la muestra de agua
a través de una membrana de celulosa de 0,45 micrones. La limitación con los volúmenes
depende también de la presencia de turbiedad. Cuando se trata de aguas contaminadas es
necesario diluir previamente las muestras. Para efectuar la dilución se debe tener en
consideración que el número ideal de colonias en el filtro de membrana está entre 20 y 60.
La muestra se filtrará a través del filtro de membrana convenientemente colocado en el
soporte de filtración.
El filtro es colocado en una placa de petri conteniendo un medio con agar adecuado para
el crecimiento de la bacteria que se desea estudiar.

Ventajas
 Los resultados son obtenidos más rápidamente, principalmente para bacterias del
grupo coliformes.
 Volúmenes mayores de muestra pueden ser examinadas
 Los resultados son más precisos que los esperados por la técnica de los tubos
múltiples
 Los equipos y materiales necesarios ocupan menor espacio con relación a la técnica
de los tubos múltiples.

Limitaciones
 En las muestras con bajo recuento de coliformes y relativamente gran cantidad de
sólidos en suspensión, el crecimiento bacteriano se puede constituir a veces en una
película continua sobre la superficie de la membrana, imposibilitando el recuento.