PRODUCTOS LÁCTEOS
La ingestión de yogur que contiene Lactobacillus acidophilus
y Bifidobacterium para potenciar la inmunoglobulina A Las respuestas a la
toxina del cólera en ratones
‡ Departamento de Microbiología de la Universidad del Estado de Michigan, East Lansing 48824
RESUMEN
Las bacterias ácido lácticas se han informado que tienen beneficios
para la prevención y el tratamiento de algunas formas de diarrea y
enfermedades relacionadas. Para determinar si estos efectos podrían
implicar la estimulación directa de la respuesta inmune gastrointestinal,
administramos yogur para tratar de mejorar la mucosa y los anticuerpos
sistémicos contra un inmunógeno presentado por vía oral, la toxina del
cólera. Yogures fueron fabricados con cultivos iniciadores que contienen
diferentes especies y cepas de bacterias del ácido láctico. Los ratones
fueron alimentados con estos yogures durante 3 semanas, durante el cual
también se inmunizaron por vía oral dos veces con 10 metro g de toxina del
cólera. La sangre se recogió en d 0 y 21, y los pellets fecales se recogieron
semanalmente. Los ratones que fueron inmunizados por vía oral con la
toxina del cólera respondido mediante la producción específica intestinal y
suero de inmunoglobulina (Ig) Una toxina anti-cólera. Las respuestas de
anticuerpos del isotipo IgA aumentaron significativamente en los ratones
alimentados con yogures hechos con entrantes que contienen las bacterias
del yogur convencionales Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus
thermophilus suplementado con Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium
bifidum, y Bifidobacterium infantis. El yogur que fue fabricado con entrantes
que contienen sólo las bacterias del yogur convencional producido menos
toxina IgA anti-cólera que el grupo de control sin grasa alimentados con
leche seca. Aunque las respuestas fuertes se observaron también para la
toxina anti-cólera IgG en el suero, las respuestas no difirieron entre los
bilis (24), L. acidophilus
grupos. Así, la administración de yogur suplementado con L. acidophilus y Bifidobacterium
spp. mejorada de la mucosa y respuestas de IgA sistémicas para el
inmunógeno toxina del cólera. ( palabras clave: bacterias del ácido láctico,
la toxina del cólera, el yogur, la inmunidad)
Recibido el 10 de junio de 1998. aceptan las
24 noviembre de 1998.
1 Autor correspondiente.
1999 J Dairy Sci 82: 649-660
MV Tejada-SIMON, JH * LEE, Z. * USTUNOL, *
y JJ Pestka *, †, ‡, 1
* Departamento de Ciencia de los Alimentos y Nutrición Humana,
† Centro Nacional para la Seguridad Alimentaria y Toxicología, y
clave Abreviatura: ABTS = 2,2 '- azino-bis (3-
ethylbenz-tiazolina-6-sulfónico), = CT la toxina del cólera, IFN = interferón,
IL = interleuquina, LPS =
lipopolisacárido.
INTRODUCCIÓN
Las bacterias ácido lácticas se han documentado a tener beneficios
en la prevención y el tratamiento de algunas formas de la diarrea y
condiciones relacionadas, así como en la mejora de la función inmune
(50). La preservación de la integridad de la flora intestinal normal,
resistencia a la colonización, la adhesión, y la producción de sustancias
antibac- terial parece ser importante para estos efectos. Aunque los
mecanismos exactos de acción aún no están claros, el consumo de
yogur se ha incrementado significativamente en los últimos años,
probablemente en parte debido a estos beneficios para la salud
percibidas (59). yogur convencional es una leche fermentada producida
por la adición de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus a
la leche. Basado en evidencia creciente de que otras bacterias de ácido
láctico tales como Lactobacillus acidophilus y las bifidobacterias tienen
propiedades terapéuticas, estas especies también se han añadido al
yogur convencional o, de forma alternativa, se han utilizado como el
principal cultivo iniciador para la producción de nuevos tipos de yogur o
leches fermentadas (26, 48). Aunque las bacterias del yogur
convencionales tienen una muy pobre resistencia intrínseco al ácido y la
y Bifidobacterium puede tolerar un pH 3 y de 2 a 8% las concentraciones de
ácidos biliares (14). Tanto las bacterias se pueden añadir en una proporción
óptima antes de la inoculación que resulta en 8 × 10 8 a 9 × 10 8 células
acidophilus / ml y 5
× 10 8 a 8 × 10 8 células bifidobacterias / ml (1). Hay pruebas (37, 38,
39, 57) que la ingestión de bacterias del ácido láctico ejerce una
inmunomodulador EF- fect en el sistema gastrointestinal de los seres
humanos y animales. El sistema gastrointestinal posee elementos
especializados que reaccionan a la exposición a anti- gens
procedentes de la dieta y que resultan en reacciones inmunes (41).
Estos elementos constituyen el
649
650 Tejada-Simon et al.

Tabla 1. Composición de las bacterias de ácido láctico en los cultivos de yogur de arranque comerciales. cultivo de yogur

Bacterias de ácido láctico Proveedor

Sanofi
Ultra-Gro cultivo de yogur directa Streptococcus thermophilus Bio-Industries
Lactobacillus delbrueckii ssp.
bulgaricus Waukesha, WI
Sanofi
Sbifidus cultivo de yogur directa S. thermophilus Bio-Industries
L. delbrueckii ssp. bulgaricus Waukesha, WI
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium spp.
yogur PY-3 Redi-Set S. thermophilus Chr. Hansen Inc.
L. delbrueckii ssp. bulgaricus Milwaukee, WI
Lactobacillus acidophilus
Bifidobacterium bifidum
DPL yogur inicio rápido DBY-2C S. thermophilus Rhône-Poulenc
Lactobacillus bulgaricus Madison, WI
L. acidophilus Bifidobacterium
infantis

sistema inmune de la mucosa; Esencialmente son tejido linfoide que
contiene el conjunto completo de células inmunes necesarias para la
inducción de una respuesta inmune, es decir, células B, células T,
macrófagos y células accesorias. Los tejidos que representan la
inmunidad de la mucosa intestinal son las placas de Peyer, nódulos
linfáticos mesentéricos, lámina propia, y linfocitos intraepiteliales (17).
El compartimiento inmune sistémica está formado por todos los tejidos
implicados en la defensa del medio interno de los microorganismos
invasores y consta de bazo, timo, médula ósea y ganglios linfáticos por
todo el cuerpo. La mucosa y compartimentos inmunes sistémicas
pueden superponerse en algunas de sus actividades específicas. Esta
conexión está mediada a través de la circulación de la sangre y la linfa,
donde las células B y T pueden migrar de un compartimento a otro.
En este estudio, el efecto de la ingestión de yogur sobre el sistema
inmunológico gastrointestinal del ratón se evaluó mediante CT
inmunización como modelo. los individuos se alimentan con diferentes
tipos de yogur a base de
L. bulgaricus, S. thermophilus con o sin L. acidophilus, y Bifidobacterium
spp. y el uso de CT como un antígeno de proteína oral, hemos sido
capaces de demostrar los actividad adyuvante de yogur que contiene L.
acidophilus y Bifidobacterium spp. Los resultados indicaron que la
ingestión de yogures suplementado con
L. acidophilus y Bifidobacterium spp. mejorado la mucosa y respuesta
de IgA sistémica a la CT.
MATERIAL Y MÉTODOS

Yogur Preparación

Cuatro cultivos iniciadores de yogur comercial se obtuvieron de

Una potente antígeno que estimula tanto la mucosa y
compartimentos sistémicos es la toxina del cólera ( CT) ( 31). La toxina
del cólera induce una respuesta de IgA secretora intestinal a sí mismo y
a los antígenos coadministrados adicionales (11, 47). Un fuerte
respuesta local de IgA ha sido reportado en el intestino delgado como se
demuestra por la detección de anticuerpos contra CT en las secreciones
intestinales (55). Una respuesta de anticuerpos IgG en suero fuerte
también es inducida por la CT de la inmunización, y parece estar situado
en parches, el bazo y lámina propia de Peyer las células secretoras de
este isotipo. La toxina del cólera se sabe que actúa como un adyuvante
intestinal para muchas proteínas, virus o polisacáridos bacterianos
comunes y por lo tanto media una fuerte respuesta de memoria IgA (31).
Sanofi Bio-Industries (Waukesha, WI), Chr. de Hansen Laboratories
Inc. (Milwaukee, WI), y Rhône-Poulenc, Inc. (Madison, WI). La Tabla 1
resume el tipo de cultivo presente en cada arranque y su fuente. Los
cuatro yogures se hicieron usando NDM pasteurizada 12% (peso / vol)
(Michigan Milk Asociación de Productores, Ovid, MI) de acuerdo con la
instrucción de los proveedores de cultivo. El NDM se inoculó con el
motor de arranque y se mezcló. Las mezclas inoculadas se dividieron
en alícuotas en 50 ml tubos de centrífuga de polietileno cónica estériles
y IN- cubated durante 6 a 8 horas a 37 ° C para desarrollar una
consistencia típica yogur. Yogures se enfriaron rápidamente y se
almacenaron a 4 ° C y se ingiere dentro de 21 d. fibras mero de
aerobios totales, estreptococos y las bifidobacterias se determinaron
durante el almacenamiento.

Journal of Dairy Science Vol. 82, No. 4, 1999

 La producción de inmunoglobulina en ratones FED YOGUR
La enumeración de las bacterias del
yogur
células totales aeróbicas, estreptococos, y los recuentos de
bifidobacterias se realizaron a 0, 1, 2, 3, y 4 semanas de almacenamiento
para determinar la viabilidad de los cultivos. El medio MRSL [MRS (3) más
5% (peso / volumen) de lactosa] placas de agar, modificado S. thermophilus agar
(agar de Lee)
(20), y sulfato de NPNL (neomicina,
sulfato de paromomicina, ácido nalidíxico, y paseo cloruros de litio) agar
(58) se utilizaron para el total aeróbica, S. ter- mophilus, y Bifidobacterium spp.experimentales en el estudio [control, Ultra-Gro directos (Sanofi
conteos, respectivamente. Después se hicieron las diluciones apropiadas,
las muestras se colocaron en placas utilizando los medios de
comunicación mencionados y se incubaron durante 48 h a 37 ° C
aeróbicamente durante aeróbico total y Estreptococo y anaeróbicas
utilizando jarras anaerobias y un anaeróbico Gas Pak • ( sistema de Becton
Dickinson Co, Cockeysville, MD) bacteria bífido. Las colonias se contaron
usando un contador de colonias Quebec (Fisher Scientific, Pittsburgh,
PA.).
Modelo animal y la dieta
ratones hembra B6C3F1 (C57BL / 6 hembra × C3H / HeN macho), 8
semanas de edad, se obtuvieron de Charles River Laboratories (Raleigh,
Carolina del Norte). Se usaron diez ratones por grupo experimenta- tal. Los
experimentos fueron diseñados para reducir al mínimo el número de
ratones necesarios para probar adecuadamente la hipótesis propuesta, y el
protocolo experimental fue aprobado por el comité de la Michigan State
University Research Laboratory Animal. Los ratones se llevaron a cabo 5
por jaula en una habitación sin ventanas en el 25 al 27 ° C con un ciclo de
luz-oscuridad de 12 h de luz seguido de 12 h de oscuridad en un área
ventilada de presión negativa. Se alojaron en jaulas con el medio protegido
(Nalgene, Rochester, NY) que incluye un cuerpo ent policarbonato transpa-
con la cubierta del filtro y la tapa alambre de acero inoxidable. Se
proporcionó agua para el acceso ad libitum y se cambió cada 3 d.
Los ratones se aclimataron a la vivienda y fueron alimentados con una
nutricionalmente completa, la dieta semipurificada modificado (AIN-93G)
como se describe por el Instituto Americano de Nutrición (46) durante al
menos 1 semana antes de que se iniciaron los experimentos. El estudio duró
21 días. Yogur o NDM de control se mezcló (1: 1, peso / peso) con AIN-93G
(ICN nutricionales bioquímicos, Cleveland, OH). Yogur y de control de las
dietas se prepararon fresco y proporcionan diariamente durante el
experimento en los alimentadores de polvo limpias con rejillas de acero
inoxidable y tapas para reducir el derrame. horarios ING y tratamiento Feed-
durante el periodo experimental se resumen en la Figura 1. Se registraron
los cambios de peso, y las muestras fecales se recogieron semanalmente.
bolitas fecales se procesaron inmediatamente y se almacenaron a -80 ° C
hasta el análisis.
651
Toxina del Cólera Inmunización
Los ratones fueron privados de comida durante 2 h antes de la
inmunización oral. Justo antes de la inmunización, se les gavaged con
0,5 ml de una solución que consta de 8 partes Hanks solución salina
equilibrada (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y 2 partes 7,5% de
bicarbonato de sodio para neutralizar la acidez del estómago. Treinta
minutos más tarde, 10 metro g de CT (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO) se administra en 0,25 ml de PBS esterilizado por filtración. Grupos
de ratones se inmunizaron en el día 0 y se utilizaron 14. Cinco grupos
Bio-Industries, Waukesha, WI), Sbifidus directa (Sanofi Bio-Industries),
PY-3 Redi -Set (Chr. Hansen Inc., Milwaukee, WI), y DPL Yogur de
inicio rápido DBY-2C (Tel-Poulenc, Madison, WI). Alimentos y agua
fueron restaurados inmediata- mente después de la inmunización.
Fecal Pellet y Suero
Preparación
Las muestras fecales se prepararon como se ha descrito previa- mente (10).
Brevemente, se recogieron heces, asépticamente pesaron, y se colocaron en
tubos de centrífuga. Se añadieron diez mili- litros de PBS / g de heces (vol / peso),
y la mezcla se incubó durante 15 min a 25 ° C. Las muestras se mezclaron
mediante agitación con vórtex hasta que suspendido, de izquierda a SET- TLE
durante 15 min, se mezcló de nuevo, y después se centrifugó a
22000 × sol durante 10 min. El sobrenadante se retiró y se almacenó a
-80 ° C para la medición de Ig.
Se obtuvo sangre de ratones anestesiados desde el plexo
retroorbital. se obtuvo el suero después de la incubación durante la
noche a 4 ° C y centrifugación a 1000 × sol durante 15 min. Las
muestras de suero se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 ° C
antes de controlar la respuesta de anticuerpos IgA e IgG anti-CT.
cultivo de linfocitos
Los ratones fueron asesinados 1 semanas después de la segunda
Inmunización con CT por dislocación cervical bajo anestesia suave. Cultivos de
bazo y placas de Peyer fueron elegidos para representar las respuestas
inmunitarias sistémicas y de la mucosa, respectivamente.
parches de Peyer se eliminaron asépticamente, colocado en una
pequeña placa Petri que contenía 5 ml de medio RPMI 1640 (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO) suplementado con 10% (vol / vol) de
suero bovino fetal (Gibco Laboratories, Chagrin Caídas,
ILLINOIS), 2-
mercaptoetanol (50 metro METRO) , amino ácidos no esenciales (1 m M) ( Gibco
BRL, Life Technologies, Gran Is- tierra, NY), piruvato de sodio (100 m M)
( Gibco), 100 U / ml de penicilina, y 100 metro g / ml de estreptomicina
(Sigma Chemical Co.) y objeto de burlas utilizando dos cubreobjetos
estériles. La suspensión celular se pasó a través
Journal of Dairy Science Vol. 82, No. 4, 1999
652 Tejada-Simon et al.

Figura 1. Diseño experimental para evaluar los efectos de la ingestión de yogur sobre la respuesta de inmunoglobulina a la toxina del cólera. AIN-93G fue de ICN nutricionales bioquímicos,
Cleveland, OH.

un 70- metro membrana m nylon que se fijó en la parte superior de un tubo de
centrífuga estéril de 15 ml. Se añadieron cinco mililitros de medio RPMI fresco
1640 para lavar la placa y mem- brana. Las células se centrifugaron a 450 × sol de Laboratories Inc., Chantilly, VA) se recubrieron con 100 metro l de CT (5 metro
8 a 10 min, se resuspendieron en 2 ml de medio fresco, y se contaron usando
tinción de 0,4% de azul de tripano (Sigma de Sustancias y cal Co.) y un
hemacitómetro. Las suspensiones celulares se mantuvieron en hielo en todo
momento.
Se extrajeron los bazos asépticamente, se colocó en una placa de Petri
que contiene 10 ml de RPMI 1460 medio como se describe, y objeto de
burlas a fondo; suspensiones de células se pasaron a través de un tamiz 85
de malla estéril para volver a mover restos de tejido. Los linfocitos se
colocaron entonces en un tubo de centrífuga estéril de 50 ml, de izquierda a
conformarse con 5 min en hielo, y después se transfirió a otro tubo estéril. La
suspensión se centrifugó a 450 × sol de 8 a 10 min, y el sobrenadante se
descartó. Los eritrocitos se lisaron durante 3 min a 25 ° C en 5 ml de un
tampón que contenía 9 partes 0.16 METRO de cloruro de amonio, más 1
parte de 0,17 METRO tampón Tris (pH 7,2). Se añadió RPMI fresco 1,640
(10 ml), y se mezclaron las células, cen- trifuged a 450 × sol durante 10 min,
se resuspendieron en 20 ml de medio fresco, y se contaron. Las células se
mantuvieron en hielo en todo momento.
como se describe por Jackson et al. (16) con algunas modifi- caciones.
Immunolon IV Removawell Las tiras de microtitulación (Dynatech
g / ml) en 0,1 METRO
tampón carbonato, pH 9,6. Las placas se incubaron durante la noche a 4 ° C
en una atmósfera húmeda y se lavaron tres veces con PBS más Tween
80 (PBS-Tween). Las placas se bloquearon con 200 metro l de 1% de BSA
en PBS durante 1 h a 37 ° C. Las placas se lavaron de nuevo tres veces
con PBS-Tween. Alícuotas de cincuenta microlitros de diluciones en serie
de suero (1:50 a 1: 6400, vol / vol), extractos fecales (1: 2 a 1: 320, vol /
vol), o sobrenadantes en 1% BSA-PBS se añadieron en duplicar, y las
placas se incubaron durante 75 min a 37 ° C. preinmune suero y extractos
fecales a diluciones similares fueron utilizados en las mismas placas
como controles. Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween. El
anticuerpo secundario consistía en 50 metro l / pocillo de peroxidasa de
rábano picante conjugado con cabra fracción de IgG anti-ratón de IgA una
la cadena (26 metro g / ml) o IgG sol la cadena (40 metro g / ml) (Cappel,
ICN Pharmaceuticals, Inc., Aurora, OH) en 1% BSA-PBS. Las placas se
incubaron a continuación a 37 ° C durante 75 min y después se lavó seis
veces con PBS-Tween. peroxidasa unida se determina añadiendo 100 metro
l de

células de los parches y de bazo de Peyer (1 × 10 5 / ml) fueron

2,2 '- azino-bis (3-ethylbenz-tiazolina-6-sulfónico) ( ABTS) sustrato [0,4 m METRO
cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado en fondo plano de 48
ABTS, 50 m METRO tampón de citrato (pH 4,0), y 1,2 m METRO peróxido
pocillos (1 ml) placas de cultivo tisular (Fisher Scientific Co., Corning,
de hidrógeno] como se describe previamente por Pestka et al. (42). Se
NY) a 37 ° C en un 7% de CO 2 midió la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas cinético
incubadora humidificada. cultivos duplicados se lated esti- con o sin 20 metro
Vmax (Molecular Devices, Menlo Park, CA). De punto final títulos se
g / ml de lipopolisacárido ( LPS) desde Salmonella typhimurium ( Sigma
expresaron como la última dilución que dio una absorbancia a 405 nm
de Sustancias y cal Co.). El sobrenadante se recogió a los 7 d y se
de ≥ 0,2 unidades por encima de la absorbancia del suero preinmune y el
almacenó a -80 ° C hasta el análisis.
extracto fecal.

ELISA
Las concentraciones de CT-específicas de IgA e IgG se cuantificaron en el
Los títulos de anticuerpos en el suero, extractos fecales, y los sobrenadantes del suero, extractos fecales, y los sobrenadantes de cultivo de células como se
cultivo de células se determinó mediante un ELISA describe por Pestka et al. (43). Estafa-

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 La producción de inmunoglobulina en ratones FED YOGUR 653

Actualmente con el elisa50 metro se añadieron l de suero de referencia

murino estándar diluido en serie a anti- pozos de Ig que flanqueaban pozos
CT para su uso en las curvas de referencia de isotipo. Cincuenta microlitros
de muestra de suero o fecal (1:50 y 1: 3, dilución vol / vol, respectivamente)
se añadieron a los pocillos recubiertos con CT. Las placas se incubaron a
continuación y se lavaron como se ha descrito para la titulación. La Ig unido
a CT fueron asignados concentraciones (nanogramos por mililitro) basados
​en la comparación de la absorbancia a los valores obtenidos en las curvas
de referencia isotipo que se ejecutaron en paralelo.

Análisis estadístico

Los datos se resumieron utilizando estadística descriptiva como la

media y el error estándar de la media. Las comparaciones estadísticas
del tratamiento frente al grupo con- trol fueron analizados por el
estudiante de t prueba usando SigmaStat • Sistema de Análisis
Estadístico (Jandel Scientific, San Rafael, CA); P < 0,05 se consideró
estadísticamente significativo.

RESULTADOS

Viabilidad de la Refrigerated Yogurt durante

el almacenamiento

Cuando viabilidad del yogur se evaluó durante un período de 4

semanas (Figura 2), que cuenta para el total teria BAC- aeróbico y Estreptococo
spp. varió de 1 × 10 9 a 5
× 10 8 ufc / g de yogur. El número de bifidobacterias viables se
redujeron más rápidamente. Para DPL yogur, inicio rápido DBY-2C, y
PY-3 Redi-Set yogur, Bifidobacterium
conteos se redujo de 1,2 × 10 8 a 2.3 × 10 6 ufc / g y de 6,9 × 10 7 a 3,7 × 10 6 ufc
/ g, respectivamente, durante un período de 3 semanas. Para Sbifidus directa
yogur, los recuentos se redujeron de 2,5 × 10 8 a 1,1 × 10 7 ufc / g. Neverthe-
menos, la viabilidad de bacterias del ácido láctico y bifidobacterias en el yogur
se mantuvieron por encima 1 × 10 6 ufc / g, que está dentro de los valores
normales informó de la leche comercial o yogur (53).

El peso corporal y la ingesta de alimentos

Todos los ratones permanecieron sanos durante el ensayo de

alimentación. La diarrea no se observó en ningún grupo de tratamiento o
control. No hay diferencias en el peso inicial medio cuerpo entre los grupos
(20,5 ± se detectaron 0,4 g). Después de 3 semanas, los pesos corporales de
los grupos de tratamiento fueron comparables con los del grupo de control
(Figura Figura 2. Total aeróbicas, estreptococos, y los recuentos de bifidobacterias en
3). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en los yogures fabricados para la alimentación de ensayo. UG = Ultra-Gro cultivo de yogur
directa, SB1F = Sbifidus cultivo de yogur directa, AP3 = AP3 Redi-Set yogur y DBY = DPL
pesos corporales entre los grupos de tratamiento y el grupo control en yogur de inicio rápido DBY-2C. Yogures se describen en la Tabla 1.
cualquier momento durante el estudio.

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654 Tejada-Simon et al.

cultivo de yogur directa, PY-3 Redi-Set cultivo de yogur, yogur y DPL

inicio rápido DBY-2C que en el control (Tabla 2). Curiosamente, el
yogur convencional grupo (Ultra-Gro directo) exhibió significativamente
menor IgA específica que el grupo de control correspondiente y
también con respecto al resto de los grupos de tratamiento yogur.

Los ratones que se inmunizaron por vía oral con CT también

Figura 3. Media ( ± SEM) el aumento de peso para los ratones alimentados con leche
descremada o yogur hecha con bacterias lácticas y bifidobacterias durante 3 semanas (n = 10). Los
ratones se pesaron al inicio de la prueba de alimentación y los cambios en el peso corporal se
controlaron semanalmente hasta el final del experimento. Yogures se describen en la Tabla 1.
La producción de Ig específica
respondieron con respuestas de anticuerpos en suero específicos de IgA e
IgG isotipos. Al igual que con coproantibodies, las concentraciones antiCT
de IgA en suero fueron significativamente mayores en los grupos de
tratamiento yogur que en el grupo de control, excepto de nuevo para el
cultivo de yogur directa Ultra-Gro, que carecía L. acidophilus y Bifidobacterium
spp. (Figura 5). Como era de esperar, las estimaciones gravimétricos de
estos anticuerpos específicos fueron más altos en suero que en muestras
fecales (Tabla 2). Los ratones también suscitó una fuerte respuesta de IgG
anti-CT (Figura 6), pero los títulos fueron más bajos para IgG que para IgA,
y no hubo diferencias significativas entre los grupos de ratones yogur o la
dieta de control alimentados, con excepción de cultivo de yogur
convencional, que mostró IgG significativamente menos específico que el
grupo de control y otros grupos de tratamiento de yogur (Tabla 2). En
conjunto, estos

respuestas anti-CT intestinales y en suero se midieron en ratones

que fueron inmunizados por vía oral con 10 metro g de CT dos veces (d
0 y 14) y, simultáneamente, alimentado con los yogures
experimentales. Para medir la respuesta Tinal intes-, bolitas fecales se
recogieron de los diferentes grupos experimentales, y los extractos se
ensayaron por ELISA para IgA específica anti-CT (Figura 4). De punto
final títulos de CT de todos los grupos de ratones antes de la
inmunización y la alimentación yogur eran muy bajos (Figura 4A). Los
niveles de anti-CT IgA aumentaron ligeramente 1 semana después los
ratones en el control o tratamiento recibieron la primera dosis de CT,
pero no se encontraron diferencias significativas entre los grupos
(Figura 4B). Niveles AP- peared a disminuir durante la segunda
semana para los cuatro grupos de tratamiento, y el grupo control
presentaron un nivel ligeramente más alto (Figura 4C). Una semana
después se le dio una segunda dosis de CT, de punto final anti-CT
títulos de IgA difería marcadamente entre todos los grupos (Figura 4D).
Sobre la base de mediciones de absorbancia, L. acidophilus y Bifidobacterium
spp.) exhibió títulos significativamente más altos que el grupo de
control, pero el yogur grupo alimentado hecho con Gro Ultra-cultivo de
yogur directa (es decir, bacterias de yogur convencionales) exhibió una
disminución del nivel de IgA específica con respecto a la dieta control.
valores gravimétrico para CT-IgA específica fueron significativamente
Figura 4. Media ( ± SEM) Los valores para la toxina IgA anti-cólera específico en muestras
mayores para los grupos alimentados Sbifidus fecales (coproantibodies). bolitas fecales frescas fueron recogidos de cada ratón en cada grupo
(n = 10; 5 grupos) en los tiempos indicados: d 1 de alimentación (A), 1 sem después de la
primera inmunización con la toxina del cólera y la alimentación de yogur (B), 2 semanas después
de la primera inmunización con la toxina del cólera y el yogur de alimentación (C), y 1 semanas
después de la segunda inmunización con la toxina del cólera y el yogur de alimentación 3 sem
(D). Los extractos se analizaron por ELISA para la específica toxina IgA anti cólera. El asterisco
indica diferencia significativa del grupo de control ( PAG ≤ 0,05). Yogures se describen en la
Tabla 1.

Journal of Dairy Science Vol. 82, No. 4, 1999

 La producción de inmunoglobulina en ratones FED YOGUR 655

TABLA 2. Estimaciones gravimétricos de la toxina del cólera (CT) específicos de Ig después de 3 semanas de la administración oral de yogur. 1

IgA anti-CT IgG anti-CT

tratamiento de
yogur 2 Heces 3 Suero 3 Suero 3

( metro g / g) ( metro g / ml)

X SE X SE X SE
Controlar 2.4 0.1 28.8 0.2 1.1 0.1
UltraGro 1.6 ab 0.0 25.1 1.0 0.4 ab 0.0
Sbifidus 4.5 una 0.5 53.3 una 6.1 0.8 0.2
PY-3 Redi 7.0 una 0.7 71.8 una 19.5 1.2 0.2
DBY-2C 3.1 una 0.8 48.0 una 2.4 0.8 0.3

1 Grupos de 10 ratones se inmunizaron por vía oral con 10 metro g de CT en d 1 y 14 de alimentación de yogur. Las muestras de suero
y heces se ensayaron en d 21.
2 Véase la Tabla 1 para la descripción de los yogures.

3 Las diluciones usadas para la cuantificación de Ig específica de antígeno por comparación con una curva de referencia estándar para el suero de
ratón eran 1:50 para el suero y 1: 3 para las muestras fecales.
una Significativo ( P < 0.05) con respecto al tratamiento de control (12% de leche desnatada + AIN 93G [1: 1]).

segundo Significativo ( P < 0,05) con respecto a otros tratamientos de yogur.

resultados mostraron que este protocolo de inmunización oral era eficaz
en la obtención de respuestas CT-anticuerpo y sugirieron que el yogur
hecho con L. acidophilus y
Bifidobacterium spp. mejorada de la mucosa y respuestas de IgA
sistémicas.
cultivos que contienen solamente L. bulgaricus y S. ter- mophilus. Por lo
tanto, las bacterias presentes en el cultivo iniciador parecían ser de
importancia crítica para la respuesta inmune hu- moral estudiado aquí, lo
que sugiere que varios factores relacionados específicamente con una
especie bacteriana, podría afectar el grado en que el yogur altera la
función inmune.

La producción de Ig específica en
Para ejercer una influencia máxima sobre la función gastrointestinal y ser
cultivos celulares
capaz de actuar como probióticos, bacterias del ácido láctico pueden necesitar
Los efectos del consumo de yogur en la producción de Ig se determinaron estar presentes en gran número en las leches fermentadas y de sobrevivir el
en cultivos preparados a partir de los parches y el bazo de Peyer, que son de proceso digestivo
la mucosa representativa y tejidos linfoides sistémicos, respectivamente.
células de los parches y de bazo de Peyer (1 × 10 5 / ml) se estimularon con o
sin 20 metro g / ml de LPS de Salmonella typhimurium, y los sobrenadantes se
recogieron y se analizaron después de 7 d para IgA e IgG específicas.
concentraciones específicas de IgA fueron similares en cultivos de células de
los parches de Peyer para todos los tratamientos con respecto al control. Se
observó una tendencia hacia el aumento de los niveles de IgA anti-CT en
cultivos de células de bazo estimuladas con LPS de los grupos tratados con
el yogur comparación con los niveles en el grupo de control, pero estos
efectos no eran no puede signifi- (datos no mostrados). Se obtuvieron
resultados similares cuando se analizaron para CT-IgG específica.

DISCUSIÓN

Este estudio demostró que la administración de yogur afectada

diferencialmente de la mucosa y respuestas de IgA sistémicas a la TC en
vivo. Específicamente, los cultivos de yogur iniciadores que presentan L.
acidophilus y cualquier tipo de Bifidobacterium spp. tenido un efecto en los
ratones que se reflejaba por la producción de anticuerpos específicos anti-CT
IgA en comparación con la de arranque yogur convencional
Figura 5. Los valores medios de la toxina IgA anti-cólera específico en muestras de
suero. Las muestras de suero se recogieron 1 semana después de la inmunización final y
se analizaron por ELISA para la específica toxina IgA anti-cólera. absorbancia suero
preinmune = 0,12. El asterisco indica diferencia significativa del grupo de control ( PAG ≤ 0,05).
Yogures se describen en la Tabla 1.

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656 Tejada-Simon et al.
Figura 6. Media ( ± SEM) valores para la toxina anti-cólera IgG específica en muestras
de suero. Las muestras de suero se recogieron 1 semana después de la inmunización final
y se analizaron por ELISA para IgG toxina específica cólera anti-. absorbancia suero
preinmune = 0,10. Asterisco indi- cates diferencia significativa del grupo de control ( PAG ≤ 0,05).
Yogures se describen en la Tabla 1.
(18). En este experimento, la viabilidad de las bacterias en todos los
yogures se mantuvo alta y dentro de los valores normales para las
leches fermentadas comerciales (53). Este resultado es importante
porque la capacidad de las L. bulgaricus y S. thermophilus a persistir en
el intestino después de la administración en ratones es cuestionable y
porque hay un consenso general de que se necesita ción ingestión
continua para mantener la colonización en modelos animales (13). La
capacidad de tolerar pH bajo y las altas concentraciones de bilis es
ventajoso para la supervivencia de L. acidophilus y Bifidobacterium
bifidum
en el interior del intestino (1). Es posible que los cultivos iniciadores que
contienen L. acidophilus y Bifidobacterium spp. fueron capaces de persistir
en el intestino del ratón; las bacterias clásicos yogur, L. bulgaricus y S.
thermophilus,
se lavaron a cabo más rápido.
ratones B6C3F1 fueron escogidos para este estudio debido al aumento
de características resistencia y longevidad de heterosis y porque la
diversidad genética más amplia es más característico de las poblaciones
humanas (12). Esta resistencia es especialmente crítico para la realización
de estudios de alimentación, y el uso de ratones genéticamente idénticos
minimiza la variabilidad encontrada en los experimentos inmunológicos. Sin
diarrea, rechazo del alimento, o malestar se observó en cualquier momento
durante la prueba de alimentación. Hemos demostrado previamente que el
consumo de alimento media para el yogur producido con estos mismos
entrantes osciló desde 5,4 hasta 5,8 g / d por ratón (C. Ha y J. Pestka,
1999, datos no publicados).
Los ratones NDM o yogur alimentados se les proporcionó una dieta
semipurificada polvo (AIN-93G) en una relación 1: 1 (peso / peso)
Journal of Dairy Science Vol. 82, No. 4, 1999
ratio, y la ganancia en el peso corporal no fue significativamente diferente
entre los grupos control y de tratamiento. Puri et al. (45) han encontrado de
manera similar ninguna diferencia en la tasa de crecimiento de los ratones
alimentados con- yogur TaiNing las culturas clásicas ( L. bulgaricus y S.
thermophilus) o leche durante 4 semanas. En este último estudio, la dieta de
yogur también se preparó mezclando yogur con gránulos de polvo en una
proporción de 1: 1. En contraste con estos últimos resultados, se observó
un mejor crecimiento en ratas alimentadas yogur liofilizado (15) y el yogur
clásico (25) que en las ratas leche alimentados. Esta discrepancia entre los
estudios se podría explicar por la diferente modelo animal empleado y
porque el estudio presentado yogur aquí utilizado mezclado con un
alimento en polvo, pero algunos otros (15, 25) alimenta el yogur solamente
sin suplementar o leche.
Cabe señalar que los ratones inmunizados por vía oral tres veces a
intervalos semanales con 10 metro g de CT producido máximas
respuestas de IgA anti-CT en muestras fecales y IgG anti-CT en suero en
d 21 (60). Hemos reducido la frecuencia de la inmunización, conociendo
la capaci- dad de la TC para actuar como un antígeno potente de la
mucosa, y se administra sólo dos dosis porque nuestro objetivo no era
lograr una máxima respuesta de anticuerpos a la TC, sino más bien para
determinar si un tratamiento yogur mejorado la respuesta.
La observación de que los niveles de IgA anti-CT fecales y de suero
fueron mayores en los ratones alimentados con yogures con bifidobacterias y
L. acidophilus que en los ratones alimentados con el yogur de control es
probable que esté relacionada a la estimulación mejorada del sistema
inmune mucosa intestinal. En apoyo de esta afirmación, se encontró que la
alimentación de ratones con L. casei aumenta IgA a enteropatógenos (35) e
induce un efecto protector contra Escherichia coli, Listeria monocytogenes ( 29,
30), y Mycobacterium bovis ( 49). Otros estudios han informado de que los
ratones alimentación de leches fermentadas que contienen L. casei
(33), L. acidophilus, y cultivos de yogur ( L. bulgaricus y S. thermophilus) ( 36)
ejerce una efecto protector contra los patógenos intestinales mediante la
activación de los folículos linfoides y aumentar la producción de
inmunoglobulinas (2). Además, las concentraciones séricas de IgA después de
la provocación con Salmonela spp. eran significativamente mayores en los
ratones alimentados con el yogur clásico que en los ratones alimentados con la
leche (45). Portier et al. (44) prepararon sueros de ratones alimentados con el
yogur fermentada por L. bulgaricus y S. thermophilus, el producto idéntico pero
calentada, o una
L. casei leche fermentada y luego vacunados con CT parcialmente
purificada (tres veces por vía intraperitoneal [40, 100, y 200 metro g por
ratón] y una vez por vía oral [100
metro g por ratón]) a intervalos semanales. Cuando se analizó mediante una
prueba de vibriocida para anticuerpos específicos contra dos serotipos altamente
correlacionados (cepa Ogawa e Inaba
 La producción de inmunoglobulina en ratones FED YOGUR
cepa) de Vibrio cholerae, diferencias significativas ( P>
0,05) para el serotipo Ogawa pero no al serotipo Inaba se encontraron.
Por lo tanto, en algunos casos, parece que el yogur clásico tiene
propiedades adyuvantes y la capacidad de estimular el sistema inmune
sistémica, lo que contrasta con nuestros resultados que Yogur hecho
con L. bulgaricus y S. thermophilus no tuvo efecto sobre anti-CT IgA a
nivel sistémico. Esta contradicción podría atribuirse a la diferente
extracto de la toxina utilizada, la diferente dosis o inmunización tocol
pro- siguió, y los diferentes ensayo utilizado para medi- anticuerpos
específicos ure.
Los mecanismos por los que Yogur hecho con fidobacterium bi- spp.
o L. acidophilus estimular el sistema inmunitario intestinal no están claros.
El sistema inmune de la mucosa tiene linfoblastos B derivados de la gut-
tejido linfoide asociado (41). Las placas de Peyer son el foco central para
la inducción de respuestas T y de células B después de una
inmunización oral. Estos órganos se encuentran debajo de una capa
especializada de células epiteliales denominadas células M. Una vez que
el antígeno ha atravesado las células M, las células presentadoras de
antígeno dentro de la placa de Peyer pueden ocupar el antígeno y
presentarlo a los linfocitos T cercanas. Hay dos clones diferentes de
células T: células T auxiliares pueden ser clasificados como Th1
[productores interleucinas ( ILLINOIS)- 2, IL-3 e interferón ( IFN) - sol] y Th2
(productoras de IL-6, IL-4, IL-5, IL-10) (32). Algunas de estas citoquinas
son capaces de activar las células B y mediar la proliferación, de
conmutación, y la diferenciación de estas células a ser comprometida
para secretar IgA (52). Las células B dentro de los folículos que expresan
IgM o IgD sobre su superficie tras la estimulación pueden proliferar y
diferenciarse en lymphob- hormas expresan IgA en su superficie. Los
linfocitos de células B pasan a los vasos linfáticos eferentes a los nódulos
linfáticos mesentéricos y desde allí puede entrar en la circulación
sistémica a través del conducto torácico y entrar en sitios efectores
distantes como lámina propia del intestino. En estos sitios efectoras, las
células B proliferan y maduran en células plasmáticas de IgA en
respuesta a cierta señalización por citocinas producidas por las células T
y los macrófagos. Las células plasmáticas producen IgA poliméricas que
se secreta luego a través de la célula epitelial en el lumen (41). La IgA
que es secretada por las células B en la lámina propia puede ser liberado
al intestino a continuación del contenido del intestino o a la circulación
general, elevando las concentraciones de IgA de suero.
La CT se compone de la subunidad A (después de la traducción
escinde en toxigénicas péptidos A1 y A2) y la subunidad B. La subunidad
B es un homopentámero que sirve como un portador para la subunidad A
mediante la unión a monosialogangliósido GM1 presente en las células
intestinales. Un cambio conformacional en este GM1 permite al
657
péptido A1 penetre en la célula. El mecanismo es desconocido pero podría
implicar algún tipo de endocitosis (31) o la translocación directa del
componente A1 a través de la bicapa lipídica. Internalizada CT impulsa la
diferenciación de las células B a precursores efectuado por IgA. El CT
podría afectar células de los parches de Peyer B ya sea directamente por el
contacto o indirectamente por la activación de macrófagos y células T.
Un posible mecanismo por el cual ciertos yogures alteran la
respuesta inmune en el tejido phoid lym- asociado al intestino puede
implicar la generación de una señal local en la superficie de la mucosa
intestinal o por im- demostró translocación de antígeno a través de la
barrera mucosa. algunos bacteriana
componentes con im-
munomodulatory actividades parecen ser ácidos lipoteicoico, LPS
endotóxico, peptidoglicanos y, que son especies y cepa específica. En
relación a estas fracciones bacterianas, otros estudios (21, 22, 23)
llevadas a cabo por este laboratorio mostraron que, no viables células
de las bacterias de ácido láctico enteros y sus fracciones de pared
celular y citoplásmicos estimulan los macrófagos in vitro para liberar
citocinas y óxido nítrico (M. Tejada -Simon y J. Pestka, 1999, datos no
publicados).
Las bacterias ácido lácticas pueden activar los macrófagos directamente.
La administración de leches fermentadas con bacterias de ácido láctico ( L.
bulgaricus y S. thermophilus,
L. casei, L. acidophilus, y Bifidobacterium spp.) aparentemente mejora la
respuesta inmune en los estudios en animales por la activación de los
macrófagos y linfocitos (40). De acuerdo con nuestros datos, se ha
observado que el yogur clásico induce una menor actividad fagocítica
de los macrófagos que hizo L. acidophilus y Bifidobacterium leches
fermentadas (27, 28). La administración oral de L. acidophilus cepa La1
y B. bifidum colar Bb12 a dosis de 7 × 10 10 ufc / d (51) a los seres
humanos aumenta la actividad fagocítica en la sangre. rophages MAC-
activadas fueron importantes en la resistencia del huésped a las
infecciones y tumores (37, 38, 39). Si una mezcla de
L. casei y L. acidophilus se administra por vía oral, aumento de la
actividad linfocítica e in vitro de macrófagos peritoneal actividad
fagocítica se encuentran (37). Los macrófagos y los linfocitos también
se activan con la administración de L. acidophilus y S. thermophilus
(39). Cuando se administra a animales en una forma de yogur, estas
bacterias parecen aumentar el número de centros germinales de bazo
y linfocitos T y B y para disminuir preexistentes infecciones
enterobacterias (4,
5, 6, 8). En los seres humanos alimentados con yogurt, investigación (7, 8, 9) mostraron
un aumento de las células B y NK en los ganglios linfáticos y IFN- sol producción.
La administración de bacterias de ácido láctico o sus leches
fermentadas También se ha informado de afectar a la producción de
citoquinas. La administración de 1 × 10 8
Journal of Dairy Science Vol. 82, No. 4, 1999
658 Tejada-Simon et al.
ufc / d durante 15 d de L. bulgaricus y S. thermophilus
utilizado en la fabricación de productos lácteos fermentados, ya sea en
1 Alm, L., E. Ryd-Kjelle'n, G. Setterberg, y L. Blomquist. 1993. Efecto de un nuevo
ratones (56) o humanos (57), se tradujo en un aumento de las
concentraciones de IL-1 segundo, factor de necrosis tumoral- una, IFN sol. Este páginas 13-16 en Las bacterias del ácido láctico. EL Foo, HG Griffin, R. Mo¨llby, y
efecto fue aún mayor con leches fermentadas con L. casei, L. acidophilus, y
Bifidobacterium spp. (57).
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y
ácido neuramínico (componente importante de las paredes celulares
bacterianas) (34). Se encuentran en las membranas apicales de todas las
células epiteliales intestinales. La mayoría de los agentes patógenos,
incluidos Helicobacter pylori, son capaces de adherirse a superficies
epiteliales de células a través de estructuras específicas gangliósidos GM3
a saber, y dañar la capa de moco por la actividad de la proteasa (54). Lactobacillus y Escherichia coli. Dyn. Nutr. Res. 1: 57-65. 5 De Simone, C., M. Ferrazzi, M. Di
casei También fue encontrado que se unen en el tracto intestinal para
algunos glicoesfingolípidos específicos que poseen cadenas de azúcar
cortos y un resto galactosilo (61). También presente en la leche y otros
productos lácteos, los gangliósidos inhiben la actividad de la enterotoxina V.
cholerae y Escherichia coli in vitro e in vivo en estudios en humanos (19).
Yogures pueden presentar cantidades TiAl rencias de estos gangliósidos,
que pueden poten- ciar o atenuar inmunogenicidad de toxinas como CT.
CONCLUSIONES
En resumen, un modelo murino se ha establecido en la que la actividad
adyuvante de yogur que contiene L. acidophilus y Bifidobacterium spp. fue
demostrarse a través de la generación de una fuerte mucosa intestinal y
respuesta de IgA anti-CT sistémicos. Yogurt fabricado con entrantes que
contienen sólo las bacterias del yogur L. BUL- garicus y S. thermophilus producido
disminuyó IgA CT contra cuando se compara con ya sea el grupo de control
alimentados con la leche en polvo descremada o otros grupos alimentados
con diferentes tipos de yogur hechos con L. bulgaricus y S. thermophilus
suplementado con L. acidophilus y Terium Bifidobac- spp. debe
ampliarse la investigación de cómo estos cultivos lácticos modulan la
respuesta de IgA.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Lácteos
(Rosemont, ILLINOIS), el USDA National
Iniciativa de Ayuda de Investigación Competitiva 94-37200-0603 (Washington,
DC), el cultivo de la Universidad del Estado de Michigan y la Alimentación
Bioprocesamiento Center (East Lansing,
MI), y la Estación Agrícola Experimental del Estado de Michigan ción
(East Lansing, MI). MV Tejada- Simón era un beneficiario de una beca
de doctorado del Instituto Nacional de Investigacio'ny TECNOLOGI
una
Agraria y Alimentaria (Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacio'n,
Madrid, España).
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