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Glycine max.
1 2 1 3 4 5 6 7
Gallo , C.; França-Neto , J.B; Arango , M.; Gonzalez , S.; Francomano , V.; Carracedo , C.; Costa , O.; Alves ,
1
R.; Craviotto , R.
1
INTA, Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental Agropecuaria Oliveros, Oliveros, Argentina.
(gallo.carina@inta.gob.ar)
2
EMBRAPA Soja, Londrina, Brasil
3
INIA, Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, La Estanzuela, Uruguay
4
Francomano & Picardi SRL, Laboratorio de Semillas, Buenos Aires, Argentina
5
LEA, Laboratorio de Especialidades Agronómicas, Colón, Argentina
6
Sementes Adriana, Rondonopolis, Brasil
7
COCARI Seed, Mandaguari, Brasil.
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
La tinción de las semillas de soja muestra la actividad respiratoria de los diferentes tejidos.
Como consecuencia de la condición de vitalidad de las estructuras seminales, aparecen
diferentes colores e intensidades, reflejando las diferencias en la actividad respiratoria de
cada estructura. Por lo tanto, de acuerdo a su condición fisiológica, se produce una imagen
topográfica de las semillas sobre sus superficies externas e internas (Moore, 1985; Craviotto
et al., 2008; França-Neto et al., 1998).
El objetivo de este estudio fue demostrar que la Prueba de Tetrazolio es una método de
vigor para Glycine max, repetible dentro de laboratorios y reproducible entre ellos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon muestras de tres lotes de semillas de Glycine max convencionales las cuales
fueron provistas por la Estación Experimental Agropecuaria Paraná del Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria de Argentina. Todos los lotes de semillas tuvieron una germinación
estándar superior al 80% (lote 1: 92%; lote 2: 89% y lote 3: 80%). Las muestras de los lotes
de semillas se codificaron y fueron enviadas desde Oliveros, Argentina a los laboratorios
participantes: Laboratorio de Semillas Francomano y Picardi, Argentina; Laboratorio de
Semillas LEA, Argentina; EMBRAPA Soja, Brasil; Semillas Adriana, Brasil; Semillas COCARI,
Brasil; Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Uruguay e Instituto Nacional de
Tecnología Agropecuaria, Argentina.
Los laboratorios participantes de Argentina, Brasil y Uruguay están acreditados por las
Reglas MERCOSUR. Además, los laboratorios de Argentina y Uruguay están acreditados por
el Instituto Nacional de Semillas de ambos países. Los Institutos Nacionales de Semillas de
Argentina y Uruguay están acreditados por ISTA. Los laboratorios privados participantes
fueron seleccionados por su prestigio, su gran entrenamiento, responsabilidad y experiencia
en la Prueba de Tetrazolio, especialmente en semillas de soja.
Los tres lotes de semillas seleccionados, identificados por los números expresados en la
Tabla 1, fueron enviados a todos los laboratorios participantes por el Laboratorio de
Semillas del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina en Diciembre de
2013. Los resultados fueron recibidos en Febrero de 2014. Cada laboratorio recibió los tres
lotes codificados con un número de lote de semillas con el correspondiente protocolo sin
ninguna mención sobre los valores de germinación ni sobre el nombre de los demás
participantes.
Las muestras de los tres lotes de semillas se enviaron en sobres cerrados, los cuáles fueron
almacenados en contenedores a prueba de humedad (bolsas de polietileno) a baja
temperatura (10ºC) antes de comenzar el análisis de las semillas.
Método de la Prueba
Tinción: Las semillas embebidas intactas se colocaron en una solución de 2,3,5 cloruro de
trifenil tetrazolio al 0.1%, durante 3 horas a 35ºC ± 2ºC.
Evaluación: Las semillas teñidas se observaron interna y externamente. Las semillas con
tegumento fuertemente adherido al eje embrionario y cotiledones se relacionaron
directamente con tejidos sanos y vigorosos, lo cuáles siempre aparecen turgentes y rosados,
tanto externa como internamente (Figura 5). En este tipo de semillas, la solución de
tetrazolio penetró superficialmente, e internamente este tipo de semillas mostró una
coloración blanco brillante rodeada por un área de color rosa (Figura 6).
Los tejidos deteriorados siempre aparecieron de color rojo y los tejidos muertos de color
blanco mate (Figura 7).
Los tejidos que presentaron coloraciones amarillentas, y/o grisáceas y/o violáceas y verde
fueron consideradas como tejidos no vivos (Figura 8).
b
c
a
a
b
Vigor Alto: Semilla completamente turgente y teñida de color rosa (Figuras 5 y 6).
Vigor Medio: Presencia de áreas menores de color rojo, sin tinción, con tejidos
necróticos o flácidos con una extensión limitada y de poca profundidad en cualquier
lugar de la semilla (incluyendo eje embrionario y área de unión del eje embrionario y
los cotiledones) (Figuras 9 y 10).
Vigor Bajo: Presencia de mayores o múltiples áreas de color rojo, sin tinción, tejidos
flácidos o necróticos con una extensión desde 1/3 hasta 3/3 del área cotiledonar el
extremo distal del cotiledón(es); y una profundidad de 1/2 del cotiledón hasta un
cotiledón entero (Figuras 9 y 11).
Otras Tinciones: Esta categoría incluye a las Semillas Viables-No Vigorosas (Figura
12 A-E): Radícula con hasta 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (A);
área de unión del eje embrionario y cotiledones con tejidos deteriorados rojos (B);
cotiledones con más de 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (C);
cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (D);
cotiledones con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (E).
Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o
perdidos (Figura 12F); área de unión del eje embrionario y cotiledones sin tinción
(Figura 12G); plúmula deteriorada o perdida (Figura 12H); cotiledones con 1/2 o más
de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (Figura 12I); cotiledones con más de
1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (Figura 12J); cotiledón con
más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (Figura 12K); semilla
entera sin tinción (Figura 12L).
A A A B
Figura 11. Semillas de Bajo Vigor: mayores o múltiples áreas de color rojo, sin tinción,
tejidos flácidos o necróticos con una extensión de 1/3 del área cotiledonar (A) hasta 3/3 del
área cotiledonar en el extremo final del cotiledón(es) (B); y una profundidad de ½ del
cotiledón hasta un cotiledón entero.
A B C D E
J K L
F G H I
I
Figura 12. Otras Tinciones : Semillas Viables - No Vigorosas: Radícula con hasta 1/3 de tejidos
deteriorados, sin tinción o perdidos (A); área de unión del eje embrionario y cotiledones con tejidos
deteriorados rojos (B); cotiledones con más de 1/2 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos
(C); cotiledones con más de 1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (D); cotiledones
con más de 3/4 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (E).
Semillas No Viables: Radícula con más de 1/3 de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (F); área
de unión del eje embrionario y cotiledones sin tinción (G); plúmula deteriorada o perdida (H);
cotiledones con 1/2 o más de tejidos deteriorados, sin tinción o perdidos (I); cotiledones con más de
1/4 de tejidos deteriorados o sin tinción en profundidad (J); cotiledón con más de 3/4 de tejidos
deteriorados, sin tinción o perdidos (K); semilla entera sin tinción (12L).
Apéndice 1 muestra un ejemplo de la tabla empleada para registrar los resultados. En este
registro, el vigor de un lote de semillas es expresado como Vigor-TZ (%), el cuál es la suma
de las semillas en las tres categorías de vigor: A (vigor alto) + B (vigor medio) + C (vigor bajo),
expresado como porcentaje. La proporción de semillas en cada categoría puede ser usada
para evaluaciones complementarias del vigor de semillas. Sin embargo, este registro
focalizará solamente sobre la evaluación sobre el total (Vigor-TZ (%)).
Análisis estadístico
http://www.seedtest.org/upload/cms/user/ISO572511.zip
El rango de tolerancia (Apéndice 2) se usó para comparar el Vigor-TZ (%) para dos
repeticiones de 100 semillas analizadas para cada lote de semillas.
Los participantes no brindaron información sobre sus experiencias con respecto a las
muestras de semillas de Glycine max analizadas.
Los resultados de este método se reportaron como un único valor denominado: Vigor-TZ
(%).
RESULTADOS
Todos los laboratorios enviaron los resultados del análisis en tiempo y forma. En esta
validación no se incluyeron en el análisis datos de la muestra ni de los laboratorios
participantes.
Los resultados de todos los laboratorios fueron expresados como Vigor-TZ (%) (Tabla 2). El
lote 3 tuvo un bajo Vigor- TZ (5) (37, Tabla 2) comparado con los lotes 1 y 2 los cuáles
presentaron el mismo valor (66, Tabla 2).
Los lotes 1 y 2 también mostraron similares valores medios para el porcentaje de semillas en
las categorías A,B y C en los seis laboratorios: Lote 1 - A, 14.1; B, 25.9; C, 24.3; Lote 2 – A,
8.0; B, 29.9; C, 27.0. Dado que los datos para las categorías A, B y C no son reportados, por
lo tanto el análisis se limitó al Vigor-TZ (%). El Apéndice 3 muestra los datos de la Prueba de
Tetrazolio de los tres lotes de semillas obtenidos por los seis laboratorios.
El cálculo de los valores z-scores (Tabla 2) reveló que todos los datos para el Vigor-TZ (%) no
excedieron el valor 2, por lo tanto todos los resultados se consideraron satisfactorios.
La repetibilidad y la reproducibilidad se analizaron con la herramienta estadística
desarrollada por S. Grégoire, basada en ISO 5725-2; esto permitió el cálculo de los valores h
y k. Los valores h muestran la tendencia de un laboratorio para sobreestimar o subestimar
resultados comparada con la media general de todos los resultados disponibles para cada
lote. Por otro lado, los valores k brindan una medida de la variabilidad de las repeticiones.
Valores altos indican mayores sub o sobreestimaciones (valores h) o mayor variabilidad
entre repeticiones (valores k).
La Figura 14 muestra la variabilidad entre las repeticiones para cada lote. Los resultados
obtenidos para el lote 1 y lote 2 en el laboratorio A fueron significativamente mayores que
la variabilidad para los mismos lotes en los otros laboratorios. Aún así, las repeticiones
estuvieron en tolerancia para todos los lotes y todos los laboratorios (Proceedings of the
ISTA Tetrazolium Workshop, Edinburgh, 1997).
DISCUSIÓN
La prueba reveló claramente que el lote 3 tenía un nivel de vigor más bajo, expresado como
Vigor-TZ (%), que los lotes 1 y 2 los cuáles tenían valores similares de vigor. Un trabajo
previo mostró que tales diferencias se relacionan estrechamente a la capacidad de las
semillas para emerger en el campo (França-Neto et al 2004). Así, el Vigor-TZ (%) predice una
de las expresiones de vigor en un lote de semillas: la capacidad de emergencia a campo.
El Vigor-TZ (%) expresa el nivel de vigor entre las semillas vigorosas; semillas no vigorosas y
semillas no viables son excluidas. Sin embargo, la separación de los lotes de simientes con
similar Vigor-TZ (%) puede ser realizada in-house para la determinación de la proporción de
semillas dentro de cada categoría (A, B, C). Sin embargo, como la separación de las semillas
dentro de estas categorías puede estar sujeta a la experiencia del analista, estas categorías
no son reportadas.
REFERENCIAS
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Testing, Association of Official Seed Analysts, NE, USA.
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Brasileira de Tecnologia de Sementes, Comite de Vigor de Sementes. Londrina:
ABRATES. 218 p.
Tabla 1: Resultados de Vigor-TZ (%) de dos repeticiones de la Prueba de Tetrazolio para cada uno
de los tres lotes de simientes, obtenidos en seis laboratorios.
LABORATORIO
Repetición A B C D E F
Lote 1 1 68 58 63 63 76 65
2 55 59 64 60 72 67
Media 62 59 64 62 74 66
Lote 2 1 70 66 61 57 67 66
2 73 65 62 58 67 66
Media 72 66 62 58 67 66
Lote 3 1 26 43 27 37 32 38
2 27 44 27 36 30 36
Media 27 44 27 37 31 37
Tabla 2: Comparación de medias, desvíos estándar (DS) y valores z-score de valores de Vigor-TZ
para tres lotes de semillas analizados por seis laboratorios empleando la Prueba de Tetrazolio.
Figura 14: Valores de Vigor-TZ (%): valores k para tres lotes de semillas de Glycine max analizadas
empleando la Prueba de Tetrazolio en seis laboratorios.
Tabla 3: Valores de Vigor-TZ (%) para resultados de repetibilidad y reproducibilidad en la Prueba
de Tetrazolio.
Apéndice 1. Ejemplo de los resultados de dos repeticiones de la Prueba de Tetrazolio para ilustrar
como se obtiene el valor final de Vigor-TZ (%).
LOTE Nº 1
Repeticiones
Media Media
Vigor-TZ (A + B + C) 86 82 84 84
Otras Tinciones 14 18 16 16
Apéndice 2. Rangos de Tolerancia.
LABORATORIO A
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 29 16 22,5
VIGOR MEDIO (B) 10 27 18,5
VIGOR BAJO ( C ) 29 12 20,5
VIGOR-TZ (A+B+C) 68 55 62
OTRAS TINCIONES 32 45 39
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 16 13 14,5
VIGOR MEDIO (B) 40 32 36
VIGOR BAJO ( C ) 14 28 21
VIGOR-TZ (A+B+C) 70 73 72
OTRAS TINCIONES 30 27 28
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 5 1 3
VIGOR MEDIO (B) 11 5 8
VIGOR BAJO ( C ) 10 21 15,5
VIGOR-TZ (A+B+C) 26 27 27
OTRAS TINCIONES 74 73 73
LABORATORIO B
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 2 2 2
VIGOR MEDIO (B) 24 20 22
VIGOR BAJO ( C ) 32 37 35
VIGOR-TZ (A+B+C) 58 59 59
OTRAS TINCIONES 42 41 41
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 3 2 3
VIGOR MEDIO (B) 32 31 32
VIGOR BAJO ( C ) 31 32 31
VIGOR-TZ (A+B+C) 66 65 66
OTRAS TINCIONES 34 35 34
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 1 0 1
VIGOR MEDIO (B) 11 9 10
VIGOR BAJO ( C ) 31 35 33
VIGOR-TZ (A+B+C) 43 44 44
OTRAS TINCIONES 57 56 56
LABORATORIO C
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 24 18 21
VIGOR MEDIO (B) 16 26 21
VIGOR BAJO ( C ) 23 20 21,5
VIGOR-TZ (A+B+C) 63 64 63,5
OTRAS TINCIONES 37 36 36,5
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 15 9 12
VIGOR MEDIO (B) 22 31 26,5
VIGOR BAJO ( C ) 24 22 23
VIGOR-TZ (A+B+C) 61 62 61,5
OTRAS TINCIONES 39 38 38,5
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 0 0 0
VIGOR MEDIO (B) 9 11 10
VIGOR BAJO ( C ) 18 16 17
VIGOR-TZ (A+B+C) 27 27 27
OTRAS TINCIONES 73 73 73
LABORATORIO D
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 3 4 4
VIGOR MEDIO (B) 20 23 22
VIGOR BAJO ( C ) 40 33 36
VIGOR-TZ (A+B+C) 63 60 62
OTRAS TINCIONES 37 40 38
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 0 0 0
VIGOR MEDIO (B) 12 12 12
VIGOR BAJO ( C ) 45 46 46
VIGOR-TZ (A+B+C) 57 58 58
OTRAS TINCIONES 43 42 42
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 1 1 1
VIGOR MEDIO (B) 10 5 8
VIGOR BAJO ( C ) 26 30 28
VIGOR-TZ (A+B+C) 37 36 37
OTRAS TINCIONES 63 64 63
LABORATORIO E
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 2 4 3
VIGOR MEDIO (B) 49 47 48
VIGOR BAJO ( C ) 25 21 23
VIGOR-TZ (A+B+C) 76 72 74
OTRAS TINCIONES 24 28 26
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 1 1 1
VIGOR MEDIO (B) 40 42 41
VIGOR BAJO ( C ) 26 24 25
VIGOR-TZ (A+B+C) 67 67 67
OTRAS TINCIONES 33 33 33
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 0 0 0
VIGOR MEDIO (B) 14 14 14
VIGOR BAJO ( C ) 18 16 16
VIGOR-TZ (A+B+C) 32 30 31
OTRAS TINCIONES 68 70 69
LABORATORIO F
LOTE 1
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 32 31 32
VIGOR MEDIO (B) 21 27 24
VIGOR BAJO ( C ) 12 9 10
VIGOR-TZ (A+B+C) 65 67 66
OTRAS TINCIONES 35 33 34
LOTE 2
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 18 18 18
VIGOR MEDIO (B) 32 31 32
VIGOR BAJO ( C ) 16 17 16
VIGOR-TZ (A+B+C) 66 66 66
OTRAS TINCIONES 34 34 34
LOTE 3
REPETICIONES
NIVEL DE VIGOR I II MEDIA (%)
VIGOR ALTO (A) 1 0 1
VIGOR MEDIO (B) 20 23 21
VIGOR BAJO ( C ) 17 13 15
VIGOR-TZ (A+B+C) 38 36 37
OTRAS TINCIONES 62 64 63