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1024201792.química Biológica PDF
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PROTEÍNAS
Funciones de las proteínas. Niveles de organización en las proteínas. Propiedades de
las proteínas. Extracción de proteínas. Cuantificación de proteínas.
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Manual teórico práctico de Química Orgánica y Biológica
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Manual teórico práctico de Química Orgánica y Biológica
diferentes métodos adecuados para cada caso particular y para cada etapa de
este proceso, tales como, lisis celular, destrucción mecánica o técnicas de
congelación-descongelación, a fin de romper las células y extraer las
proteínas.
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Manual teórico práctico de Química Orgánica y Biológica
protege las proteínas de la oxidación, pero se debe tener cuidado porque estos
agentes, en algunos casos pueden activar a las proteasas.
3.3 Métodos de purificación y caracterización
Por otro lado, para separar o purificar una proteína a partir de una
mezcla de proteínas se aplican habitualmente métodos cromatográficos que
aprovechan diferentes propiedades de la molécula proteica, como su masa
molecular (en la cromatografía de filtración por gel), su carga (en la
cromatografía de intercambio iónico) o su afinidad por determinados grupos
químicos (cromatografía de afinidad). El análisis de la proteína o proteínas
aisladas, como la determinación de su peso molecular o la existencia de
subunidades (estructura cuaternaria), pI (punto isoeléctrico), se lleva a cabo
generalmente mediante técnicas electroforéticas en condiciones nativas o
desnaturalizantes e isoelectroenfoque. El análisis de la estructura de una
proteína se hace mediante RMN, dicroísmo cicular, espectrofluorimetría,
secuenciación, etc. Si la proteína es una enzima, se realiza el análisis de su
actividad biológica y estudio de su comportamiento cinético.
Técnicas utilizadas en el estudio de proteínas
Purificación Cuantificación Análisis de Análisis de
estructura actividad
Fraccionamiento Espectrofotometría Espectrofluorimetría Actividad
subcelular por enzimática
centrifugación
diferencial
Precipitación Espectrofluorimetría Dicroismo circular Análisis de
salina radioligandos
Diálisis ELISA RMN Complejos
Antígeno
Anticuerpo
Cromatografía de MALDI-MS
filtración por gel,
intercambio
iónico,afinidad
Electroforesis en Secuenciación de
geles aminoácidos
isoelectroenfoque Difracción de RX
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Absorbancia a 280 nm
Aunque ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas
absorbe luz en la región visible del espectro electromagnético, tres de ellos
(tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la región
del UV cercano a los 280 nm. Dado que las proteínas poseen restos de
aminoácidos aromáticos, las medidas de absorción a 280 nm constituyen un
método rápido para la determinación del contenido de proteína de una
solución. Este método es usado para determinar la localización de proteínas en
una o más fracciones procedentes de un proceso de separación
cromatográfica.
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Método de Lowry
Es un método espectrofotométrico de valoración cuantitativa de
proteínas. Se basa en la reacción de las proteínas con el reactivo de Folin-
Ciocalteau, que consiste en una solución de tungstato sódico y molibdato
sódico en ácido fosfórico y ácido clorhídrico. A una adecuada dilución de
proteínas se añade el Reactivo de Folin que forma un complejo coloreado con
ellas, siendo la intensidad de color resultante proporcional a la concentración
de proteínas, según la ley de Lambert-Beer (A= ε.L.C).
Fundamento: La reacción entre las proteínas y los reactivos empleados
por este método consta de dos etapas:
1ª) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas en los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos, formando complejos. Estos
complejos Cu2+-proteína, de un color azul pálido, provocan el desdoblamiento de
la estructura tridimensional de la proteína, exponiendo hacia la superficie a los
residuos fenoles de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la
reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
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Ventajas Desventajas
Grupos -Gran espectro de sensibilidad -Interfieren ácidos
Aromáticos -Método no destructivo nucleicos y otros
(280 nm) compuestos aromáticos.
Unión Peptídica -Proteínas con y sin grupos -Detección de otros
(205 nm) aromáticos compuestos químicos.
-Método no destructivo -Interfieren la mayoría
de los tampón.
Método de -10 veces más sensible que UV -Interferencia de varias
Lowry (5 a 100 µg) sustancias.
(745-750 nm) -Aconsejable para mezclas -Inestabilidad de los
complejas (tisulares) reactivos
-Desviación de la
linealidad a altas
concentraciones
Método de -5 veces más sensible que el de -La sensibilidad
Bradford Lowry depende del contenido
(595 nm) -Pequeñas interferencias se de lisinas y argininas.
compensan con el control -El complejo deja
restos azules en las
cubetas.
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Experimentación
Proteínas
Objetivos
• Extraer, concentrar y purificar proteínas de origen animal y vegetal.
• Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las proteínas.
• Determinar el punto isoeléctrico de una proteína.
• Estudiar el efecto de solventes orgánicos sobre las proteínas.
• Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalización reversible e
irreversible de las proteínas.
• Emplear un método colorimétrico para el análisis cuantitativo de las
proteínas presentes en una muestra desconocida.
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Procedimiento:
Titular una fracción alícuota del suero y una del suero
desproteinizado, ambos diluidos 1/5 con agua destilada. La titulación se
realiza en presencia de 10 gotas del indicador rojo de metilo que al mezclar
con el suero se torna de color amarillo,.agregando HCl 0,01 N hasta cambio
de color a rosado pálido. Se mide el volumen de HCl gastados.
Procedimiento:
- Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de ácido
acético 1 N y 6,8 ml de agua destilada, mezclar.
- Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.
- Tomar 5 ml de la solución del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y
repetir la operación hasta el último tubo. Descartar los 5 ml finales.
- Medir el pH a cada solución (rango de pH esperado 3,5-5,9).
- Agregar 1 ml de caseína a cada tubo de la escala de pH y mezclar
inmediatamente por agitación.
- Observar la solubilidad de la caseína a distintos pH a tiempo cero (T0) y a
los 30 minutos (T30) de contacto.
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Reactivos:
- Etanol de 95°
- Acetona
- Hidróxido de sodio conc.
- HCl conc.
- Solución de ovoalbúmina: separar la clara de huevo, medir su volumen y
batir durante unos minutos, mezclar con cinco volúmenes de agua destilada y
filtrar la mezcla a través de doble gasa.
Procedimiento:
• Precipitación de ovoalbúmina con solventes orgánicos: agregar
volúmenes iguales de alcohol y acetona a la solución de ovoalbúmina.
• Coagulación de ovoalbúmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,
colocar en cada uno 2 ml de solución de ovoalbúmina y proceder a:
Tubo 1: calentar.
Tubo 2: agregar unas gotas de ácido clorhídrico concentrado (HCl).
Tubo 3: agregar solución concentrada de hidróxido de sodio (NaOH).
Tubo 4: usar como control.
• Explicar el fenómeno observado.
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ENZIMAS
Definición de enzimas. Nomenclatura y clasificación. Actividad enzimática.
Velocidad de reacción. Cinética enzimática.
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Actividad enzimática
El estudio o investigación de una actividad enzimática involucra dos
aspectos: uno cualitativo y otro cuantitativo.
Análisis cualitativo:
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Análisis cuantitativo:
Consiste en determinar la cantidad de enzima presente en un sistema;
para ello se recurre a la medida de la velocidad de la reacción catalizada por la
enzima que se ensaya. Esto es posible debido que, en condiciones adecuadas,
la velocidad de una reacción enzimática es directamente proporcional a la
cantidad de enzima presente.
Velocidad de reacción:
Se entiende por velocidad de una reacción química a la variación de la
concentración de reactivos o de productos en función del tiempo. Así, la
velocidad de una reacción enzimática puede medirse como la velocidad de
utilización del sustrato o bien como la velocidad de formación de uno de los
productos. De esta manera, se puede expresar la cantidad de enzima en
términos de unidades enzimáticas, entendiéndose por Unidad de Enzima a la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de un micromol de
sustrato por minuto bajo condiciones definidas de temperatura y pH .
Cuando la actividad de una enzima se relaciona con el contenido
proteico de la preparación enzimática, se la denomina Actividad Específica y
se expresa como el número de unidades de enzima por miligramo de proteína
(UE/mg). La actividad específica de una enzima indica el grado de pureza de
la preparación enzimática y es máxima cuando la enzima se encuentra pura.
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Cinética enzimática
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas. Los estudios cinéticos proporcionan información directa acerca
del mecanismo de la reacción catalítica y de la especificidad de la enzima. La
velocidad de una reacción enzimática puede determinarse midiendo la
aparición de los productos o bien la desaparición de los reactivos como
función del tiempo. Al medir la aparición de producto (o la desaparición del
sustrato) en función del tiempo se obtiene la llamada curva de avance o de
progreso de la reacción (Figura 1), o simplemente, la cinética de la reacción.
A medida que la reacción transcurre, la velocidad de aparición del
producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va
consumiendo el sustrato de la reacción.
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10
6
[P] Mm
Concentración
[S]O = 1 KM
4
vo
2
(mM)
0
0 100 200 300 400 500 600
TIEMPO (min)
Tiempo (minutos)
E+S P+E
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202
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Km representa:
1. Constante de equilíbrio de disociación del complejo ES
2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato
3. Concentración de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad
de La máxima (V 0.5)
4. Se define para un dado complejo enzima-sustrato
5. Se mide en unidades de concentración
Km
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Experimentación
ENZIMAS
Objetivos
• Determinar la actividad de una enzima hidrolítica (invertasa ácida soluble
de Ricinus communis) mediante métodos espectrofotométricos.
• Determinar la velocidad inicial de la enzima (efecto del tiempo de
incubación).
• Determinación del pH óptimo de enzima mediante el ensayo del efecto del
pH sobre la actividad de enzima.
• Determinar la KM y la Vmax de la enzime mediante el estudiao del efecto de
la concentración de sustrato.
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INVERTASA
SACAROSA GLUCOSA + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
INVERTASA
RAFINOSA GAL-GLU + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
INVERTASA
ESTAQUIOSA GAL-GAL-GLU + FRUCTOSA
No Reductor Reductores
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Reactivos:
a) Reactivo cúprico de Somogyi. Se prepara en el momento de usar
mezclando 1 volumen de la solución A con 9 volúmenes de la solución B:
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ÁCIDOS NUCLEICOS
Definición de ácidos nucleicos. Composición. Bases nitrogenadas. Estructura de los
nucleósidos, nucleótidos y polinucleóticos. ADN conformación. ARN. Tipos. Función
INTRODUCCION
Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la
información genética. Tienen una estructura polimérica, lineal, cuyos
monómeros son los nucleótidos. Son moléculas formadas por centenares de
millones de nucleótidos en una sola estructura covalente. El nucleótido está
formado por un fosfato esterificado a una pentosa, la que a su vez está unida
por un enlace β-glicosídico a una base nitrogenada.
De la misma manera que las proteínas son polímeros lineales
aperiódicos de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo son de nucleótidos. La
aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia de
información. Los ácidos nucleicos constituyen el depósito de información de
todas las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de la célula. Existe
una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que ácidos
nucleicos y proteínas son colineares; la descripción de esta correlación es lo
que llamamos Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de
tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una
proteína. Además hay ácidos nucleicos implicados en la transmisión y
procesado de la información genética, otros con funciones catalíticas
(ribozimas), y hay secuencias regulatorias que controlan la expresión de
diferentes genes (hormonas, factores de crecimiento, señales químicas en
general).
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Bases nitrogenadas
Las bases nitrogenadas de los ácidos nucleicos son bases heterocíclicas
que pertenecen a una de dos familias:
Unas están basadas en el Anillo pirimidínico, las Pirimidinas que
constituyen un sistema plano de seis átomos, cuatro carbonos y dos
nitrógenos. Los átomos del anillo pirimidínico tienen la siguiente numeración:
N1: C2: N3: C4: C5: C6:
N3 4 5
2 6
1
N
Las distintas bases pirimidínicas se obtienen por sustitución de este
anillo con grupos oxo (=O), grupos amino (-NH2) o grupos metilo (-CH3).
O O NH2
CH3 H
H N N N
O N O N O N
H H H
TIMINA URACILO CITOSINA
2,4 di oxo 5 metil pirimidina 2,4 di oxo pirimidina 2 oxo 4 amino pirimidina
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N
N1 6
5 7
8
2 4 9
3
N N
H
PURINA
NH2 O
H N
N N
N
N N N
N NH2
H H
ADENINA GUANINA
Nucleósidos
La unión de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los
compuestos llamados nucleósidos. Obsérvese el sufijo ósido, característico de
todos los glicósidos. La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en
cuyo caso hablamos de Ribonucleósidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (D-
desoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonucleósidos. Todos los
nucleósidos son del tipo anomérico beta. Esto nos introduce a la distinción
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Nucleótidos
Cuando un ortofosfato se esterifica a alguno de los -OH de la pentosa
de un nucleósido, la estructura resultante se llama nucleótido. En los
ribonucleósidos, el ortofosfato puede esterificarse en tres posiciones distintas:
2', 3' y 5'. En los desoxirribonucleósidos, la esterificación con grupos fosfato
se da en 3´, 5´ de la pentosa.
La pentosa se une a la base nitrogenada por un enlace N-glicosídico que
se establece entre el átomo de C1´ del azúcar y el átomo de N9 de las bases
púricas o el N1 de las bases pirimidínicas. El grupo fosfato se halla unido por
un enlace éster al átomo C5´ de la pentosa.
NH2
N
- N
O
5' N N Nucleótido de ADN
- O
O P O CH 2 Desoxiadenosina 5´monofosfato (AMP)
4' H H 1'
O
H H
3' 2'
OH H
NH2
- - N
N Adenosina 5´difosfato (ADP)
O O
5' N
ON
-
O P O P O CH 2
4' H 1'
O O H
H H
3' 2'
OH OH
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Polinucleótidos
Dos nucleótidos pueden unirse a través de un enlace fosfodiéster. Un
nucleótido está fosforilado en 3' y este fosfato, a su vez, esterifica al 5'-OH del
siguiente nucleótido
El enlace así establecido se llama enlace
fosfodiéster, y es característico de los ácidos
nucleicos. A su vez, el grupo 3' -OH del segundo
nucleótido puede esterificarse a otro fosfato que
por su parte se esterifica al 5'-OH del siguiente
nucleótido y este último se une de la misma
manera a otro nucleótido y así sucesivamente.
Convencionalmente los polinucleótidos se numeran desde el residuo 5'
terminal, que es aquel que tiene un 5'-OH libre (extremo 5') el cual muy
frecuentemente aparece esterificado a un fosfato o polifosfato mientras que en
el extremo opuesto de la molécula hay un grupo 3' -OH libre que recibe el
nombre de extremo 3'.
Las enzimas que hidrolizan polinucleótidos, genéricamente llamadas
nucleasas, son, por lo tanto, fosfodiesterasas (su acción consiste en la
hidrólisis de un fosfodiéster).
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Conformación A
La conformación A del ADN aparece en cristales de baja hidratación y
menor grado de polimerización que el ADN-B. Se trata de una estructura más
ancha y corta que el ADN-B.
Conformación Z
La conformación Z del ADN aparece fundamentalmente en zonas
ricas en el par G-C.
Existen algunas diferencias entre la conformación Z y las otras dos. En primer
lugar las hélices son levógiras, es una doble hélice más estrecha y alargada
que el ADN-B.
También puede hallarse ADN en las mitocondrias o en los cloroplastos
(células eucariotas) o los plásmidos (células procariotas), virus y
transposones.
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reactivo de Schiff
• Reacción con orcinol
• Reacción con agentes intercalantes (acridinas)
• Resistencia a hidrólisis por álcalis.
• Metilación de purinas: por tratamiento con dimetil sulfato (DMS) y
calentamiento a pH neutro se produce la metilación de las purinas. El
tratamiento a pH bajo produce la ruptura del enlace glicosídico con
formación de un sitio apurínico. El tratamiento posterior con ácido
diluido rompe la cadena por el sitio apurínico.
• El tratamiento de ADN con hidrazina rompe el enlace glicosídico de las
pirimidinas, quedando un sitio apirimidínico; el tratamiento posterior con
piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidínico
-
O O H H -
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P Sitio apurínico
- H3C H -
O O
O N N O
H
N
H2 C N N H2C OH
H
. O O
-
O O -
O O
P O P O
- -
O H3C H O H3C H
O N O N
pH bajo
H2 C N O H2C N O
O O
- O H - O H
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-
O O H H
-
O O H H
N N
P P
- -
O O
O N O N
H 2C N O H2C N O
O O
-
O O -
O O
P O P O
- H -
O H3C H
O N
O N N O N
H H
N N
H2C N H 2C N N
N
H H
O O
- O
O O
- H H
O O- H H -
O OO
N N
P
P P O DMS P
-
O
- -O -
O O
O H C HN H 3C O H N
O O 3 N O N
H 2C N O H 2C H 2C N O
H2C N O N O
O O O O
O -O O O
- H -
O O-O O H
H N H N
P P P P
- - -
O -O O
O O Sitio
N
N
apurínico OO O- N
N
H2CH C N H 2C N N
2 N
O OH O
O
O O
- O -
O O O-
P O P O
- -
O H 3C H Ácido diluído O H3C H
O O N
N
H 2C H 2C N O
N O
O O
-
O O H -
O O H
H N H N
P P
- -
O O N
O N O N
N
H 2C N H 2C N N
N
O O
O O
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-
O O
O O
P
- H H
O N N
O N O N
H H
N -
O P O CH2 N
H2C N N N
N O H
O H O-
OH
-
O O
H H H H
P N N
-
O
O
N N
O
H2C -
N O O P O CH2 N O
O O
O-
-
O O OH
P O O
- H3C H
O H3C H
O N N
O
-
H2C O P O CH2 N O
N O O
O O-
- O OH H
O H H N
H N
P
-
O N N
O N N
O
- N
H2C N O P O CH2 N
N O
O O-
O OH
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- N
O
5' O N
- O Nucleótido de ARN
O P O CH 2
Uridina 5´monofosfato
4' H 1'
O H
H H
3' 2'
OH OH
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Experimentación
Ácidos nucleicos: ARN y ADN
Objetivos
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CROMATOGRAFÍA Y ELECTROFORESIS
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Técnicas cromatográficas
Según la forma de llevar a cabo la separación cromatográfica, cabe
distinguir dos tipos de técnicas cromatográficas: en columna y plana.
Cromatografía en columna: se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se
coloca la fase estacionaria y a través de ella se hace pasar la fase móvil. El
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veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una
vez seca la mancha o banda, el extremo del plano próximo a la misma se pone
en contacto con la fase móvil, manteniendo todo el sistema cromatográfico en
una cámara cerrada. La separación se produce por migración diferencial de los
componentes de la muestra en la dirección en que se mueve la fase móvil.
Generalmente, a diferencia de la cromatografía en columna, en cromatografía
plana las sustancias analizadas no abandonan el lecho cromatográfico, de
forma que el proceso se detiene cuando la fase móvil ha alcanzado una
determinada zona del plano.
En la cromatografía en papel, la celulosa actúa como soporte de la fase
estacionaria que suele ser agua. No obstante, también existen en el comercio
papeles impregnados (gel de sílice o alúmina, silicona, intercambiadores
iónicos, etc.) o tratadas químicamente (grupos intercambiadores incorporados
al esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la aplicabilidad de esta
técnica.
En cromatografía en capa fina, un sólido o soporte de la fase
estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie
rígida, normalmente una capa de vidrio o polietileno o una placa de aluminio,
de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo de las
características del sólido utilizado, la cromatografía será de partición,
adsorción, intercambio iónico o exclusión.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la cromatografía en capa fina
(CCF) o Thin Layer Cromatography (TLC) era considerada una técnica
cualitativa simple y rápida, para separar mezclas no demasiado complejas,
pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras
técnicas cromatográficas. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios
introducidos en esta técnica (calidad de los soportes, equipos para aplicar
muestras y sistemas de detección), es considerada una técnica útil para separar
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son las que permiten el paso de dicha fase a través del lecho
cromatográfico. Por el contrario, en cromatografía en columna la velocidad
de la fase móvil puede controlarse regulando el gradiente de presión a
través de la columna (por ej. cromatografía de alta presión).
• En la cromatografía plana, el tiempo que dura la separación está
determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente
llegue a una zona determinada del lecho cromatográfico y es independiente
del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografía
en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la
columna, por lo que el tiempo que dura la separación está determinado por
el tiempo que tarda el componente más lento en llegar al detector.
• En la cromatografía en columna la separación de varias muestras se realiza
de forma secuencial, es decir, cada muestra debe “sembrarse”, fraccionarse
y detectarse individualmente, mientras que en cromatografía plana, la
separación de varias muestras se realiza de forma simultánea, siendo todas
ellas sometidas al mismo tiempo a igual proceso separativo, lo cual supone
un ahorro de tiempo.
• Otra diferencia se encuentra en la forma de llevar a cabo la detección.
Mientras que en cromatografía en columna este es un proceso dinámico,
pasando cada soluto eluído por el detector (por ejemplo UV-visibles;
índice de refracción), en cromatografía plana es un proceso estático ya que
se analizan o revelan todas las fracciones de distintas muestras a la vez.
Aplicaciones de la Cromatografía
La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de
separación, ya que es aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. Las
técnicas cromatográficas se pueden emplear para la separación, aislamiento,
purificación e identificación de diversos compuestos (orgánicos, inorgánicos o
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Electroforesis
La electroforesis es una técnica para la separación de proteínas (y
también de aminoácidos, péptidos y ácidos nucleicos) que se basa en el
desplazamiento de las proteínas cargadas en un campo eléctrico. Si se coloca
a las proteínas en un campo eléctrico, el sentido en que se mueven las
moléculas depende del pH de la solución. Si el pH es igual al punto
isoeléctrico (pI) de una proteína, ésta no migra. A un pH por debajo de su pI,
predominan las cargas positivas y la proteína migra hacia el cátodo (polo
negativo). A un pH superior al pI, existe un predominio de cargas negativas y
la proteína migra hacia el ánodo (polo positivo). En general, se puede decir
que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá
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Dirección
Muestra
de la
migración
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Manual teórico práctico de Química Orgánica y Biológica
Experimentación
Cromatografía y electroforesis
Objetivos
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sílica gel. Dejar desarrollar la placa hasta que el disolvente alcance unos 5 cm
por encima del origen. Sacar la placa de la cuba, marcar el frente de
disolvente y dejar evaporar el mismo. Revelar con reactivo de Dragendorff’s
(solución acuosa de ácido tartárico, nitrato de bismuto y ioduro de potasio).
Determinar y comparar los valores de Rf para el alcaloide presente en el
extracto y el compuesto testigo.
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Ve
Ve
Número de fracción
Respuesta del detector= Abs 280 nm
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D. Electroforesis
Determinación de las proteínas del suero humano
-Preparación de la muestra: Por centrifugación de una muestra de sangre se
obtiene el suero humano.
-Separación e identificación: La separación se realizará mediante
electroforesis en membrana de acetato de celulosa.
Humedecer en tampón (Buffer Veronal sódico 0,04M pH=8,6)
membranas de acetato de celulosa gelatinizadas (CELLOGEL) durante 10
minutos. Eliminar el exceso de tampón poniendo las tiras entre dos hojas de
papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo. Cargar
la cuba del aparato de electroforesis con tampón. Extender las tiras sobre el
puente de la cubeta de electroforesis de modo que la cara mate de la tira de
acetato de celulosa quede hacia arriba, teniendo cuidado que ambos extremos
queden sumergidos en la solución buffer. Sembrar con ayuda de un aplicador
de plástico, la muestra de suero en la tira a 2 cm del cátodo. Conectar el
aparato de electroforesis dejando pasar la corriente durante 60 minutos a un
voltaje fijo de 200 V.
Una vez finalizada la electroforesis, depositar las tiras en una cubeta
con solución colorante (0,5% , p/v negro amido en metanol 45% + ácido
acético 10%), de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10
minutos. Seguidamente lavar las tiras en solución de lavado (metanol 45% +
ácido acético 5%) hasta que se observen bien las bandas de proteína (azules)
sobre un fondo blanco.
Dibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto
de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.
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Bibliografia
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