Analisismicrobiologicodeaguasreducido PDF

Análisis
Microbiológico
de aguas.
Laboratorio.
Dolores Garvi Higueras.

sedceroya@us.es
www.aguapedia.org
Índice .
1. Legislación
2. Toma de muestras
3. Medios de cultivo
4. Esterilización
5. Material
6. Preparación de la muestra
7. Filtración por membrana
8. Siembra
9. Incubación.
10. Recuento
11.Protocolos
Dolores Garvi Higueras, sedceroya@us.es , www.aguapedia.org

1. Legislación.

1.1 Aguas Potables
Parámetros microbiológicos definidos según Real Decreto 140/2003, de

7 de febrero, por el que se establecen los criterios sanitarios de la calidad
del agua de consumo humano.

1.2 Aguas de bebida envasadas
Parámetros microbiológicos definidos según Real Decreto 1799/2010, de 30 de

diciembre, por el que se regula el proceso de elaboración,
circulación y comercio de aguas de bebida envasadas.

Recuento de Bacterias Aerobias Clostridios Sulfito-Reductores
Enterococos Pseudomonas aeruginosa

Coliformes y Escherichia coli

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
2. Toma de
muestras

2.1 Recipientes de muestra.
2.1.1 Generalidades.

2.1.2 Esterilización de recipientes

2.2 Control de calidad de los recipientes de muestra.
2.2.1 Ensayo de esterilidad.
2.3 Procedimiento de llenado

2.3.1 Aguas residuales

2.4 Transporte
2.5 Tiempo y Temperatura
Las muestras no deben superar las 6 horas desde la

toma de muestra, una vez lleguen al laboratorio deben
guardarse en frigorífico a 4º+-2ºC

Índice.
Legislación
Toma de muestras
Esterilización
Material
Preparación de la muestra
Filtración por membrana
Incubación.
Recuento
Protocolos
3. Medios de
cultivos
deshidratado.

3. Medios de cultivo deshidratados
3.1 Preparación
Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo CULTIMED se disuelven por agitación y
calentando ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante se suelen hervir
durante 1 minuto para conseguir su disolución. Aunque en la mayor parte de los medios hay que calentar,
se deben evitar sobrecalentamientos innecesarios.
Algunos medios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo la Base de Caldo Tetrationato.
Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que el precipitado quede bien repartido.
Posteriormente a la disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casos existen
componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratado y que será necesario su
esterilización por separado y una posterior incorporación de forma aséptica para obtener el medio
completo.
El método más comúnmente utilizado para la esterilización es el Autoclavado. Sin embargo, hay
ingredientes en algunos medios que no mantienen sus propiedades si se someten a altas temperaturas.
Para ellos existen diferentes procesos de esterilización que están descritos en el apartado de preparación
de cada uno de ellos en este manual.

3.2 Esterilización
En la etiqueta de los productos CULTIMED se indican las condiciones de

esterilización. De todas formas se describen unas pautas de carácter general.
• Autoclavado: Exposición durante 15 minutos a 121ºC. Con este tratamiento
mueren las células vegetativas y las endosporas bacterianas. Sin embargo, los
medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a
temperaturas no superiores a los 116-118ºC, para prevenir su
descomposición y la posible formación de compuestos tóxicos que inhiban el
crecimiento bacteriano.

3.3 Conservación de los medios recién preparados.
Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en

muchos casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y
el resto se guarda como medio preparado. El tiempo de vida del medio
preparado dependerá de la propia naturaleza del medio, de la hermeticidad de
los recipientes que lo contienen, de la temperatura de conservación y de las
condiciones medioambientales. Si la hermeticidad es buena y la temperatura
baja, 2-8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6 semanas. De todas
formas la refrigeración favorece la deshidratación y en algunos casos, como por
ejemplo, los medios para anaerobios, la conservación es mejor a temperatura
ambiente que en frigorífico.
Se deben evitar las condensaciones excesivas ya que el depósito de gotas de
agua podrá ser causa de una alteración del medio. Tampoco deben emplearse
medios preparados en los que se observe un efecto de deshidratación.

3.4 Refundido de medios sólidos
Existen presentaciones de medios listos para su uso que precisan de una manipulación previa a su
utilización. Son aquellas presentaciones que precisan refundir los medios sólidos, preparados y estériles
en frascos y tubos, para verterlos en placa.
Es aconsejable hacerlo en baño maría, en microondas o en autoclave a vapor fluente. En ningún caso
debe aplicarse calor directo.
Una vez fundidos se dejarán enfriar hasta unos 50ºC para añadir los aditivos, si fuera necesario, y para
distribuirlos o sembrarlos. Hay que tener en cuenta que los medios refundidos tienen una cierta
tendencia al oscurecimiento y precipitación, que aumenta cuando se mantienen fundidos durante
periodos de tiempo prolongados y a temperaturas entre 45-65ºC y que ello puede suponer una pérdida
de las características nutritivas o selectivas del medio, por lo que es aconsejable, no fundirlos más de
una vez y no mantenerlos en el calor durante largos periodos de tiempo.
En este sentido son recomendables los métodos rápidos como el que se obtiene con el fundido de
medios en el microondas, donde se debe dosificar la intensidad de la radiación y durante tiempos lo
más cortos posibles. Las fuertes intensidades de radiación, pueden provocar refundidos parciales,
ebulliciones súbitas con eventuales derrames del medio pudiendo alterar las cualidades del mismo.

3.5 Medios preparados, listos para su uso.
Estas presentaciones permiten la utilización del medio de forma

inmediata o bien con un previo tratamiento muy sencillo.
Son medios muy delicados, especialmente las presentaciones en placa.
Por ello se recomienda la revisión del material
inmediatamente después de su recepción para detectar cualquier
alteración del producto.

3.6 Información general
Destrucción y desinfección
Una vez realizados los cultivos, el medio debe ser autoclavado a 121ºC
durante 30 minutos antes de su desecho definitivo.
De igual manera se debe proceder con el material de laboratorio empleado
en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso.

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
4. Esterilización

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
5. Material.

Cámara de flujo laminar
Limpiar antes de usar.

Poner 10 minutos los
ultravioletas y quitar.
Encender flujo y luz.

Material toma de muestra.
Pipetas Pasteur graduadas de polietileno,

estériles
Material preparación de la muestra.
Tubos de ensayo sin reborde

Material preparación del medio de cultivo y agua
de peptona.
Balanzas

Material filtración
Tubos de ensayo
Bomba de vacío
Incubadora.

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
6. Preparación
de la muestra.

Para muestras de agua potable.
Muestra
10 ml

Para muestras de aguas residuales
(!!! contaminación) hay que diluir
en agua de peptona (9 ml).
Muestra
1 ml 10-1 10-1
1 ml
1 ml 10-2
1 ml 10-2
1 ml 10-3

Diluciones seriadas

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
7. Filtración
por membrana

7.1 Porción de ensayo.

7.2 Filtración.

7.3 Transferencia de la membrana

8. Siembra.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO PARA LA
OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS
A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a

través de la obtención de colonias aisladas. Cada colonia representa una
población de microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la cual
se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de
microorganismo.
Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento, basadas en diluir la

muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un
cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o
bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -70° C, en Nitrógeno líquido a
-173° C, o mediante liofilización.

Para obtener colonias aisladas por la técnica del agotamiento la muestra se
extiende sobre la superficie según se indica en la figura, de forma que al final
de dicha siembra “por agotamiento”, la cantidad de inóculo se espera sea lo
suficientemente bajo como para que se depositen células aisladas y
distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras
incubar, colonias aisladas.

Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se respecta al
método general para la siembra en placa y permite también obtener
colonias aisladas.

Técnica

Índice.
1.Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
9. Incubación.

8. Incubación.

Índice.
1. Legislación
2. Toma de muestras
4. Esterilización
5. Material
8. Incubación.
9. Recuento
10. Protocolos
10. Recuento
de colonias.

10. Recuento.
10.1 Generalidades
10.2 Recuento de las colonias

Índice.
Legislación
Toma de muestras
Medios de cultivo
Esterilización
Material
Preparación de la muestra
Filtración por membrana
Incubación.
Recuento
10. Protocolos
11. Protocolo
Coliformes
fecales.

FUNDAMENTO
Las bacterias coliformes de origen fecal son
aquellas comprendidas en el grupo anterior
(coliformes
totales), que además son capaces de
fermentar la lactosa, con producción de
ácido y de gas a 44ºC, en un
tiempo máximo de 24h.
El método consiste en la determinación del
nº de coliformes mediante filtración de
volúmenes
determinados del agua a analizar por filtros
de membrana e incubación sobre medio de
lactosa
enriquecido y una temperatura de 44,5ºC
(+/-0,2ºC).

TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO
Se utiliza la muestra de agua tomada para
el análisis de coliformes totales que se
encontraba guardada en
frigorífico a 4ºC.
INTERFERENCIAS
Para evitar la contaminación por
microorganismos aéreos se esteriliza el
material en autoclave (pinzas y
elementos del sistema de filtración que
vayan a entrar en contacto con el agua) a
121ºC durante 20min.
Todo el proceso de filtración, así como el
llenado de las placas de Petri se realizará
dentro de la
campana de flujo para evitar el contacto
con la atmósfera.
4. MATERIAL

Medio utilizado:
* El medio M-FC Agar, no hace falta autoclavarlo.
Este medio es selectivo para los Coliformes

fecales al
incubar a 44 ºC. Este medio suplementado
con Acido Rosólico hace que las colonias de
coliformes fecales aparezcan
de color azul y las demás de color gris.

PROCEDIMIENTO
Colocar un filtro de membrana estéril sobre el soporte de filtración, utilizando
pinzas estériles.
Adaptar el embudo.
Conectar el matraz a una bomba eléctrica de vacío.
Filtrar 100 ml de muestra si se trata de agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de
aguas no potables,
previamente homogeneizada, efectuando el vacío necesario.
Lavar con unos 30 ml de agua de peptona
Retirar el embudo.
Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante sobre el medio
de cultivo contenido en una placa de Petri, de modo que la superficie de filtración
quede hacia arriba.
Cerrar e invertir la placa e incubar a 44ªC (+/-1ºC ) durante 24h ( +/-2h ).

. LECTURA E INTERPRETACIÓN
La lectura de los resultados requiere el
examen de las colonias aparecidas sobre la
membrana y el
examen de los halos en la capa de agar
subyacente a la membrana.
Se consideran
Coliformes fecales aquellas colonias que
presentan color azul añil.
La densidad se estima como el total de
colonias de coliformes fecales por 100ml,
utilizando aquellos filtros de
membrana que tengan 20-80 colonias de
coliformes fecales.

Protocolo
Esteritchia
Coli.

TOMA DE MUESTRA Y ALMACENAMIENTO
Se utiliza la muestra de agua tomada para
el análisis de E. Coli que se encontraba
guardada en
frigorífico a 4ºC.
INTERFERENCIAS
Para evitar la contaminación por
microorganismos aéreos se esteriliza el
material en autoclave (pinzas y
elementos del sistema de filtración que
vayan a entrar en contacto con el agua) a
121ºC durante 20min.
Todo el proceso de filtración, así como el
llenado de las placas de Petri se realizará
dentro de la
campana de flujo para evitar el contacto
con la atmósfera.

PROCEDIMIENTO
Colocar un filtro de membrana estéril sobre
el soporte de filtración, utilizando pinzas
estériles.
Adaptar el embudo.
Conectar el matraz a una bomba eléctrica
de vacío.
Filtrar 100 ml de muestra si se trata de
agua potable, y 0,1 y 1 ml si se trata de
aguas no potables,
previamente homogeneizada, efectuando el
vacío necesario.
Lavar con unos 30 ml de agua de peptona
Retirar el embudo.
Mediante las pinzas esterilizadas, transferir
la membrana filtrante sobre el medio de
cultivo contenido en una placa de Petri, de
modo que la superficie de filtración quede
hacia arriba.
Cerrar e invertir la placa e incubar a 44ªC
(+/-1ºC ) durante 24h ( +/-2h ).

. LECTURA E INTERPRETACIÓN
La lectura de los resultados requiere el
examen de las colonias aparecidas sobre la
membrana y el
examen de los halos en la capa de agar
subyacente a la membrana.
Se considera E. Coli aquellas colonias que
presentan color azul añil. Las colonias de
color rosa son coliformes.
La densidad se estima como el total de
colonias de E. coli totales por 100ml,
utilizando aquellos filtros de
membrana que tengan 20-80 colonias de
coliformes.

Protocolo
Anaerobio
(clostridium).

Filtración por membrana.
Colonias de color negro son clostridium.
Cultivo de enriquecimiento.
Colonias de color transparente son clostridium.

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Análisis

Dolores Garvi Higueras.

7. Filtración por membrana

Dolores Garvi Higueras, sedceroya@us.es , www.aguapedia.org

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Parámetros microbiológicos definidos según Real Decreto 140/2003, de

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Parámetros microbiológicos definidos según Real Decreto 1799/2010, de 30 de

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Enterococos Pseudomonas aeruginosa

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7. Filtración por membrana

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2.3 Procedimiento de llenado

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2.5 Tiempo y Temperatura

Las muestras no deben superar las 6 horas desde la

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Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en

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Estas presentaciones permiten la utilización del medio de forma

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7. Filtración por membrana

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Limpiar antes de usar.

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Pipetas Pasteur graduadas de polietileno,

Tubos de ensayo sin reborde

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7. Filtración por membrana

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7. Filtración por membrana

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A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a

Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento, basadas en diluir la

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7. Filtración por membrana

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7. Filtración por membrana