Departamento de Ciencias Básicas

2019 Laboratorio de Bioquímica

PRÁCTICO N°2
Aminoácidos

INTRODUCCIÓN

Los aminoácidos son compuestos que poseen un grupo amino (-NH2) y un grupo ácido carboxílico (-COOH) en su
estructura. Los aminoácidos son los precursores de los péptidos y las proteínas y en ellos, el grupo amino y el grupo
carboxilo se encuentran unidos al mismo átomo de carbono conocido como carbono  (-aminoácidos). La
estructura general de los -aminoácidos (a excepción de la prolina, que es cíclica) se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Estructura química de un aminoácido.

Las proteínas son las biomoléculas más abundantes de la materia viva. Sus propiedades fisico-químicas pueden
diferir drásticamente, y así una queratina del pelo se parece escasamente a una proteína plasmática o a la insulina.
Sin embargo, todas tienen en común su composición, basada en -aminoácidos unidos por enlaces peptídicos
dando lugar a cadenas lineales.

En todos los aminoácidos, excepto la glicina, el átomo de carbono  tiene cuatro sustituyentes diferentes por esta
razón este carbono se considera un centro quiral o carbono asimétrico.

Figura 1. Estructura química del aminoácido glicina.

El –R de los veinte aminoácidos puede diferenciarse en: tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de
hidrógeno o por su reactividad química. Para su denominación se usan las tres primeras letras de su nombre común,
por ejemplo glicina, Gly, etc.

Es necesario recordar que la mayor parte de la bioquímica se produce en el margen de pH fisiológico próximo a la
neutralidad. En estas condiciones el grupo carboxilo habrá perdido un H+ y el grupo amino habrá captado un H+, para
dar la forma zwitterion.
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Curvas de Titulación

La representación gráfica de la variación del pH de una solución, debida a la adición de una base o un ácido se
denomina curva de titulación. La curva de titulación surge entonces de la relación entre la cantidad de ácido o base
agregada a una solución y la variación del pH de la misma.
A pH ácido la mayoría de los aminoácidos se encuentran con sus grupos funcionales totalmente protonados y a pH
básico sobre 12 la mayoría de los aminoácidos se encuentran con sus grupos funcionales totalmente desprotonados.
Por lo tanto, son posibles dos ionizaciones: la del grupo carboxilo (a pH ácido) y la del grupo amino (a pH básico).
A pH 1 el 100% de las moléculas de aminoácido están como ion positivo (grupo amino protonado y con carga
positiva y grupo carboxilo protonado y sin carga) y en pH 14 las moléculas del aminoácido se encuentran como
100% ión negativo (grupo carboxilo desprotonado y con carga negativa y grupo amino desprotonado y sin carga). En
pKa1 el 50% de moléculas como ión positivo y 50% como zwitterion o dipolo y en pKa2 el 50% como ión negativo y
50% como zwitterion o dipolo. El valor de pH en el cual el 100% del aminoácido se encuentra como dipolo o
zwitterion, se denomina punto isoeléctrico (pI) donde los grupos aminos están protonados y con carga positiva y los
grupos carboxilos desprotonados y con carga negativa.

Reacción de la Ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un agente oxidante poderoso que reacciona con todos los -
aminoácidos a un pH entre 4 y 8 para dar un compuesto de color púrpura. Esta reacción se efectúa también con
aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO2. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina también
reaccionan con la ninhidrina, pero en este caso se obtiene un color amarillo en vez del púrpura. un
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reacción
disponer
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sensible y es la ideal para la detección de aminoácidos en cromatogramas y su determinación cuantitativa en
fracciones de columnas.

Reacción de Millon.
Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno reaccionan con el reactivo Millon formando compuestos
rojos. Los únicos aminoácidos fenólicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reacción positiva.
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El reactivo original de Millon consistía en una solución de nitrato mercúrico en ácido nítrico 50% v/v, pero
actualmente se usan modificaciones menos suceptibles a la interferencia de las sales inorgánicas.

Prueba de Pauly.

El ácido sulfanílico diazotizado se une con las aminas, fenoles e imidozales para dar compuestos azo fuertemente
coloreados. Los compuestos de diazono se forman únicamente en frío, así que las soluciones deben enfriarse en
hielo antes de la diazotización.

REACTIVOS y MATERIALES

Baño termorregulado a 100°C

pH-metro calibrado
Solución de NaOH 1,0M
aminoácido Glicina de pH ácido (entre 2-2.5)
20 tubos de ensayo en gradilla
Pipetas y propipetas
2 Vasos precipitados de 250 ml
Bureta de 50mL con soporte universal
Probeta y bagueta
Pizeta y gotarios plásticos
Pinzas de madera para tubos de ensayo
Papel absorbente y hielo

PARTE EXPERIMENTAL

Actividad 1: Titulación de un aminoácido.

 Transfiera 100 mL de la solución del aminoácido Glicina de pH ácido (entre 2-2.5) a un vaso precipitado
de 250 mL. Mida el pH inicial de la solución.
 Adicione con una bureta alícuotas de 0,5 mL de NaOH 1,0 M (base fuerte) hasta completar un total
adicionado de 5 ml. Después de cada adición, mida el pH de la solución. Recuerde homogenizar la solución
(con bagueta) antes de cada medición de pH.
 Registre los resultados obtenidos en la Tabla 1. Calcule los moles de NaOH adicionados, considerando la
concentración 1,0 M como la concentración inicial de la solución stock. Luego grafique su curva de titulación
para este aminoácido en papel milimetrado indicando pH v/s moles de NaOH adicionados.

Tabla 1: Volumen de NaOH adicionado versus pH del aminoácido ácido glicina.

Volumen de 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
NaOH (mL)
Moles de
NaOH
adicionados
pH
aminoácido

 Investigue el procedimiento experimental a seguir para la elaboración de la curva de titulación de un aminoácido

cualquiera y realice un análisis teórico de la curva de titulación extraída de bibliografía para el aminoácido
glicina y compare con la curva obtenida experimentalmente. ¿Qué puede discutir sobre esta comparación?.
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 Esquematice según equilibrio ácido-base las estructuras del aminoácido glicina considerando valor de pKa1,
pI y valor de pKa2.

Actividad 2: Reacción de la Ninhidrina.

Materiales
 Aminoácidos (glicina, tirosina, histidina, triptófano, fenilalanina 1 g/L)
 Ninhidrina (2 g/L)
Método
 Prepare una batería con 5 tubos de ensayo y a cada uno de ellos deposite 1 mL de la solución del respectivo
aminoácido. En un tubo adicional (sexto tubo) agregue 1 mL de agua en vez de aminoácido.
 Agregue a cada tubo cinco gotas de solución de ninhidrina y deje hervir por dos minutos.
 Investigue sobre la reacción que se lleva a cabo.

Actividad 3: Reacción de Millon.

Materiales
 Aminoácidos (glicina, tirosina, histidina, triptófano, fenilalanina 1 g/L)
 Reactivo de Millon (solución de sulfato mercúrico 150 g/L en ácido sulfúrico 15% v/v)
 Fenol (1 g/L)
 NaNO2 Nitrito de sodio (10 g/L)
Método
 Prepare una batería con 5 tubos de ensayo y a cada uno de ellos deposite 1 mL de la solución del respectivo
aminoácido. En un tubo adicional (sexto tubo) agregue 1 mL de fenol en vez de aminoácido.
 Añada a cada tubo cinco gotas del reactivo de Millon y caliente en un baño de agua hirviendo por 10 minutos.
 Deje enfriar a temperatura ambiente y agregue cinco gotas de nitrito de sodio. La aparición de un color rojo
ladrillo indica un resultado positivo.

Actividad 4: Prueba de Pauly.

Materiales
 Aminoácidos (glicina, tirosina, histidina, triptófano, fenilalanina 1 g/L)
 Ácido sulfanílico (10 g/L en solución de ácido clorhídrico 1 mol/L)
 NaNO2 Nitrito de sodio (50 g/L)
 Na2CO3 Carbonato de sodio (10 g/L)
Método
 Prepare una batería con 5 tubos de ensayo y a cada uno de ellos deposite 2 mL de la solución del respectivo
aminoácido. Luego, adicione a cada tubo 1 mL de ácido sulfanílico. Agite cuidadosamente cada tubo.
 Enfríe en hielo por 5 minutos.
 Agregue 1 mL de solución de NaNO2, agite suavemente e incube en frío durante 3 minutos.
 Alcalinice la solución añadiendo 2 mL de solución de Na2CO3, agite suavemente y registre los colores que se
han formado.

ACTIVIDAD ADICIONAL (responder y dejar en resultados):

 ¿Qué indica el punto isoeléctrico de un aminoácido?. Explique.
 ¿Porqué en la reacción de ninhidrina se ocupó agua en vez de aminoácido?. Fundamente.
 ¿Porqué en la reacción de Millon se ocupó fenol en vez de aminoácido?. Fundamente.
 Traer esquema de estructura de los 20 aminoácidos presentes en proteínas. Revise la estructura de los
aminoácidos considerados en el práctico. Hecho a mano.