MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN

E INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA

Integrantes:
 Omar Arias
 Carolina Panchana
NRC: 3292
Fecha: 10/01/2018
Contenido
Índice de Figuras ..................................................................................... 3
Índice de Tablas....................................................................................... 3
1. TEMA: MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN E
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA .................................................... 5
2. RESUMEN ....................................................................................... 5
3. OBJETIVOS .................................................................................... 5
3.1 Objetivo General ............................................................................................................... 5
3.2 Objetivos Específicos......................................................................................................... 5

4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................ 6
5. INTRODUCCIÓN ........................................................................... 6
6. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN...................................................... 7
I. MÉTODOS MECÁNICOS .............................................................. 9
I.1 MECANISMOS EN ESTADO LÍQUIDO ....................................................................... 9
I.1.2 HOMOGENIZACIÓN ....................................................................................................... 9
I.2 MECANISMOS EN ESTADO SÓLIDO ....................................................................... 10
I.2.1 MOLIENDA ................................................................................................................... 11
I.2.2 PRENSA FRANCESA ...................................................................................................... 11
I.2.3 MOLINOS DE BOLAS .................................................................................................... 11
I.2.4 SHOCK OSMÓTICO....................................................................................................... 11
I.2.5 TEMPERATURAS EXTREMAS ........................................................................................ 11
I.3 MÉTODOS FÍSICOS ...................................................................................................... 11
I.3.1 CAVITACIÓN HIDRODINÁMICA .................................................................................... 11
I.3.2 DESECACIÓN ................................................................................................................ 12

II. MÉTODOS NO MECÁNICOS................................................... 12

II. 1 QUÍMICOS ............................................................................................................. 12
II.1.1 pH EXTREMO .............................................................................................................. 12
II.1.2 DETERGENTES............................................................................................................. 12
II.1.3 SOLVENTES ORGÁNICOS ............................................................................................ 13
II.1.4 ANTIBIÓTICOS............................................................................................................. 13
II.1.5 AGENTES QUELANTES ................................................................................................ 13
II.1.6 AGENTES CAOTRÓPICOS ............................................................................................ 13
II.2 BIOLÓGICOS ................................................................................................................ 13
II. 2.1 ADICIÓN DE ENZIMAS ................................................................................................ 13

pág. 1
 II.2.2 AUTOLISIS ................................................................................................................... 13
II.2.3 INHIBIDORES DE PARED CELULAR .............................................................................. 14
II.2.4 LISIS INDUCIBLE .......................................................................................................... 14
III. SELECCIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN .............................................. 14
IV. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE ALGUNOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
15

7. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS ................................................... 16

7.1 CENTRIFUGACIÓN................................................................................................ 16
7.2 SEPARACIÓN POR LA SOLUBILIDAD.............................................................. 16
7.2.1 PRECIPITACIÓN POR SALES......................................................................................... 16
7.3 SEPARACIÓN POR EL TAMAÑO ....................................................................... 17
7.3.1 DIÁLISIS ....................................................................................................................... 17
7.4 CROMATOGRAFÍA ................................................................................................ 18
7.4.1 CROMATOGRAFÍA POR FILTRACIÓ EN GEL................................................................. 18
7.4.2 CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO.......................................................... 19
7.4.3 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD ................................................................................ 20
7.4.4 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) ................................ 21
7.5 ELECTROFORESIS ................................................................................................ 21
7.6 ULTRASONIFICACIÓN ......................................................................................... 22
7.6.1 Ultrasonificación a pequeña escala:.................................................................... 22
7.9.2 Ultrasonificación a gran escala:.................................................................................. 22
7.7 PARÁMETROS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS .................................... 23
7.8 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS DE PURIFICACIÓN .... 24

8. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS .............................................. 25

7.5 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN
FÍSICA ................................................................................................................................... 26
8.1.1 ATRAPAMIENTO ......................................................................................................... 26
8.1.2 INCLUSIÓN EN MEMBRANAS ..................................................................................... 27
8.2 INMOVILIZACIÓN POR UNION QUÍMICA............................................................ 29
8.2.1 UNIÓN POR SOPORTE................................................................................................. 29
8.2.2 RETICULADO ............................................................................................................... 33
8.3 EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN ...................................................................... 34
8.3.1 EFECTOS DE LA ESTABILIDAD ..................................................................................... 34
8.3.2 EFECTOS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ................................................................... 35
8.4 APLICACIONES DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS ....................................... 35

pág. 2
 8.5 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN
ENZIMÁTICA ...................................................................................................................... 37

8. CONCLUSIONES.......................................................................... 38
9. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................... 40
10. GLOSARIO ................................................................................ 43
11. ANEXOS ..................................................................................... 46
CUESTIONARIO ................................................................................................................. 46

Índice de Figuras
Figura 1. Métodos mecánicos y principios de ruptura celular...................................................... 8
Figura 2. Métodos no mecánicos y principios de ruptura celular................................................. 9
Figura 3. homogeneizador de Manton-Gaulin .......................................................................... 10
Figura 4.Proceso de cavitación................................................................................................... 12
Figura 5. Detergentes para extracción de proteínas ................................................................... 13
Figura 6. Orden de dificultad de la ruptura celular. ................................................................... 14
Figura 7. Centrifugación diferencial para purificación de proteínas .Fuente: (Biomodel, 2016)
..................................................................................................................................................... 16
Figura 8. Precipitación por cambio iónico. Fuente: (Atom, 2010). ............................................ 17
Figura 9. Diálisis para purificación de proteínas. Fuente: (Stryer et al., 2012).......................... 18
Figura 10. Esquema de una columna de cromatografía por filtración en gel. Fuente (Caballero,
2013) ........................................................................................................................................... 18
Figura 11. Cromatografía por filtración en gel . (Stryer, 2012) ................................................ 19
Figura 12. Cromatografía por intercambio iónico. Fuente: (Stryer, 2012). ............................... 20
Figura 13. Cromatografía por afinidad. Fuente: (UNAM., 2007). ............................................. 21
Figura 14. Esquema de Cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC). Fuente: (Floro,
2015) ........................................................................................................................................... 21
Figura 15. Esquema Ultrasonificación. Fuente: (Canseco, 2010). ............................................. 23
Figura 16. Métodos de inmovilización mediante retención física (Arroyo M. , 1998). ............. 26
Figura 17. Enzimas inmovilizadas por inclusión dentro de una matriz de gel. A) gel húmedo. B)
esferas del gel seco y triturado (Fajardo & Osuna, 2011). .......................................................... 27
Figura 18. Enzimas inmovilizadas por encapsulación. A) microencapsulación dentro de esferas
porosas. B) Microemulsión en micelas. ...................................................................................... 28
Figura 19. Métodos de inmovlización por unión química.......................................................... 29
Figura 20. Tipos de soportes (Arroyo M. , 1998)....................................................................... 29
Figura 21. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico. A) Por adsorción, la región positiva de
la proteína interactúa con el soporte negativo. ............................................................................ 30
Figura 22. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico por enlace covalente, las enzimas se
encuentran orientadas espacialmente en el soporte ..................................................................... 32
Figura 23. Esquema de métodos de inmovilización enzimática: adsorción, unión covalente,
atrapamiento, entrecruzamiento. Fuente: (Salazar et al., 2015). ................................................. 34

Índice de Tablas
Tabla 1. Ventajas y desventajas de métodos de extracción de enzimas. ..................................... 15

pág. 3
Tabla 2. Parámetros de seguimiento de una purificación enzimpatica. (Stryer, 2012) ............... 23
Tabla 3. Ventajas y desventajas de los métodos de purificación enzimática . ............................ 24
Tabla 4. Ventajas y Desventajas de la inmovlización de enzimas .............................................. 26
Tabla 5. Comparación entre los métodos de inmovilización de enzimas (Arroyo M. , 1998) .... 35
Tabla 6. Ventajas y Desventajas de las técnicas de inmovilización enzimática.......................... 37

pág. 4
 1. TEMA: MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN E
INMOVILIZACIÓN ENZIMÁTICA

2. RESUMEN
Las enzimas fueron utilizadas desde la antigüedad de forma empírica para la
fermentación, producción de vino, pan, etc. Las enzimas son proteínas con gran capacidad
catalítica que se encuentran en los organismos, son indispensables en la traducción de
señales y procesos de regulación celular. Las enzimas poseen unas excelentes propiedades
de selectividad y especificidad y por ello son capaces de catalizar los procesos químicos
más complejos en las condiciones experimentales y medioambientales más suaves. Se
utilizan en muchas áreas de la industria: síntesis de biocombustibles, síntesis de fármacos,
química de alimentos, biosensores, etc (Koeller & Wong, 2001).

La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis, en
el presente trabajo se estudian los diferentes procesos de extracción que pueden
clasificarse en: a) métodos mecánicos dentro de los cuales tenemos a los mecanismos para
estado líquido, sólido y métodos físicos y b) métodos no mecánicos que consisten en
métodos químicos y biológicos.

Por otro lado, la purificación de enzimas es muy importante para fines científicos e
industriales ya que permite extraer enzimas indeseables. Entre los métodos de
purificación estudiamos la centrifugación, precipitación por sales, diálisis, electroforesis,
ultrasonificación, cromatografía por filtración, por intercambio iónico, por afinidad y por
líquidos de alta presión.

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima

en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su
actividad catalítica para que puedan ser reutilizadas (Arroyo M. , 1998)
Finalmente se menciona las ventajas y desventajas de cada método y los parámetros para
seleccionar cada uno de ellos, que en general comprenden del tipo de enzima, la muestra
de partida, la localización subcelular de la proteína y de las condiciones óptimas que ésta
requiera (Towbin, 1979).

3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
 Realizar una investigación bibliográfica de los métodos de extracción,
purificación e inmovilización enzimática.
3.2 Objetivos Específicos
 Identificar los diferentes métodos utilizados en la extracción, sus ventajas y
desventajas.
 Determinar los métodos usados para la purificación dependiendo del factor físico
o químico de la enzima.
 Definir los diferentes métodos de inmovilización enzimática, ventajas y
desventajas que presenta cada uno de estos métodos.

pág. 5
 4. JUSTIFICACIÓN

La aplicación de las enzimas en la industria ha sido de gran utilidad, inicialmente fueron

extraídas de plantas y animales, en la actualidad su producción por fermentación va
aumentando. El desarrollo de fuentes para producir enzimas de uso en la industria
alimentaria, de métodos de aislamiento y purificación y el diseño de reactores
enzimáticos, que permiten su aplicación en diversos procesos, ha evolucionado en forma
considerable y ha dado origen a un área interdisciplinaria conocida hoy día como
"ingeniería enzimática", como nuevo enfoque de la biotecnología (Menéndez, 2010).

En la actualidad se ha logrado obtener enzimas más puras, que tienen las siguientes
ventajas sobre los productos de fermentación: acción más específica en su función
catalítica; actividad predecible y controlable, y es posible utilizar concentraciones más
elevadas del substrato.
A pesar de estas claras ventajas del empleo de enzimas trabajar con ellas comprendía varias
dificultades. Con la inmovilización de las enzimas se han podido superar estos últimos
inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnológico sea económicamente rentable ya que
existen protocolos que de hecho nos permiten mejorar notablemente las propiedades
funcionales de las enzimas y su capacidad de reactivación (Koeller & Wong, 2001).

5. INTRODUCCIÓN

En el transcurso del tiempo las enzimas fueron utilizadas, formando parte de células o
extractos crudos de materiales vegetales, animales y microbianos. Se las utilizó
principalmente en la industria alimenticia para la fermentación como en la cerveza, vino,
pan y queso en forma empírica, es decir, sin conocerse su modo de acción, ni el porqué
de su actividad catalítica (Babot, 2010).

Los enzimas son catalizadores muy eficientes, específicos, regulables y no dejan

subproductos a diferencia de los catalizadores químicos. Por estas razones existe un gran
interés en la aplicación enzimática para diversos fines, debido a esto se han establecido
una gama de procesos de extracción, purificación e inmovilización enzimática, que sirven
para su empleo en la producción industrial de productos químicos, farmacéuticos,
alimentos, tratamiento de residuos, diagnóstico médico y tratamiento de enfermedades
(Yúfera, 2007).

En la actualidad se utiliza las enzimas procedentes de una levadura o un trozo de tejido

sin siquiera extraerla de las células, como ejemplo tenemos: el Acetobacter aceti puede
servir para oxidar el alcohol y convertirlo en ácido acético sin purificar antes la oxidasa
del alcohol (Campos, 2013).

Las enzimas son de naturaleza proteica pero también ácidos nucleicos catalíticamente
activos conocidos como “ribosimas” (Koolman, 2004). Casi, todas las reacciones
metabólicas, en los sistemas vivos, son catalizadas por las enzimas.

pág. 6
Se ha visto que las enzimas aisladas no pierden su capacidad catalítica, propiedad que ha
sido explotada por los bioquímicos para estudiarlas in vitro (Kumar A. G., 2006). Aunque,
la mayoría de las enzimas se encuentran dentro de las células, hay pocas enzimas
especialmente en microorganismos que son secretadas en el medio y se llaman enzimas
extracelulares. Las enzimas intracelulares pueden encontrarse en el citoplasma o bien
pueden estar fijadas a determinados organelos. Las que se encuentran solamente en el
citoplasma se llaman uniloculadas y las que están en un cierto porcentaje en los organelos
y otro porcentaje en el citoplasma, son biloculadas. La localización subcelular es muy
importante para la selección de los diferentes métodos de extracción y purificación
(Brandan & Llanos, 2008).
Con el fin de estudiar una enzima in vitro, es esencial aislarla de la célula. para su
extracción primero se debe efectuar algún método que permita la lisis celular, para
posteriormente separar de los restos celulares mediante algún tipo de centrifugación
dependiendo de la localización y solubilidad de la enzima. En la extracción se requiere
eliminar enzimas celulares y evitar contaminación con otros componentes celulares
(Kumar A. G., 2006) .
Es preferible también purificarla, por lo menos hasta cierto punto, antes de estudiar sus
características. Para separar la enzima de interés de otros componentes celulares se
recurre a métodos de purificación. Los métodos de purificación dependen de la fuente
biológica, de la concentración de enzima y de sus propiedades (Berg, Tymoczko, &
Stryer, 2012).
Los procesos de inmovilización enzimática son aquellos en los que se confina o localiza
a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles, con el
fin de retener su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen,
completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos y
células, por su unión a un soporte. Existen protocolos de inmovilización que permiten un
aumento de la actividad, especificidad y de la estabilidad, reutilización de los
componentes y diseñar de reactores adaptables (Arroyo M. , 1998)

6. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

Debido a que las enzimas son proteínas, los métodos utilizados para la extracción de
proteínas se los aplica a enzimas. En esta etapa deben extremarse las precauciones para
evitar la desnaturalización que conduce a la perdida de actividad y también para
maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las
alteraciones secundarias por oxidación o proteólisis. El material biológico debe triturarse
(homogenizarse), para que se produzca la ruptura celular o lisis y formar el llamado
extracto crudo (Yúfera, 2007).

pág. 7
Se realiza la homogeneización en un medio tamponado al pH adecuado, para desintegrar
las células. El producto resultante se denomina homogenizado o extracto y contiene
moléculas del citosol, enzimas, metabolitos, ribosomas, orgánulos y sus membranas por
lo tanto se debe separar las enzimas por centrifugación (Arroyo M. , 1998)

Las enzimas en cuanto a su extracción las podemos clasificar en dos grandes grupos:
intracelulares y extracelulares. Las enzimas intracelulares pueden encontrarse en el
citoplasma o bien pueden estar fijadas a determinados organelos. Las que se encuentran
solamente en el citoplasma se llaman uniloculadas. Por ejemplo, GPT (glutámico-
pirúvico transaminasa) ó LDH (láctico deshidrogenasa). Otras enzimas están en un cierto
porcentaje en los organelos y otro porcentaje en el citoplasma, es decir que son
biloculadas, como la GOT (glutámico-pirúvico transaminasa) que está 60% en el
citoplasma y 40% en mitocondria, MDH (malato deshidrogenasa) 50 % en citoplasma y
50% en mitocondria. Esto se debe tomar en cuenta para la selección del método adecuado
de extracción. En las primeras es obligatorio el rompimiento celular, para lo cual existen
diversos métodos químicos, físicos y enzimáticos, para las enzimas extracelulares tan solo
se requiere la separación de la biomasa con el sobrenadante de la fermentación (Flores,
2013).
Según Balasundaram et al., (2009) se obtiene la siguiente tabla:

Figura 1. Métodos mecánicos y principios de ruptura celular.

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 Figura 2. Métodos no mecánicos y principios de ruptura celular.

I. MÉTODOS MECÁNICOS

I.1 MECANISMOS EN ESTADO LÍQUIDO

I.1.2 HOMOGENIZACIÓN
I.1.2.1 HOMOGENIZACIÓN CON CUCHILLAS
Se utiliza muestras con un alto contenido de agua, aceite o grasa sean perfectamente
triturados y homogeneizados como muestras de tejidos animales y vegetales. Proceso
magnificado por uso de solventes orgánicos y/o detergentes, las cuchillas rotan a 6000 –
50000 rpm en un contenedor. Las muestras pueden ser reducidas hasta partículas de 4
micrones (análisis de citometría de flujo). Homogenizados de plantas pueden sufrir
oxidación enzimática (Milling, 2015).

I.1.2.2 HOMOGENIZADOR ROTOR

Homogenización rápida (10-60 seg.) y completa. Mecanismo de turbulencia ligera.
Protección de organelos: menor velocidad y tiempo de exposición. Uso: tejidos animales
y vegetales. Genera calor a niveles insignificantes. Formación de espuma y aerosoles
(Flores, 2013).

I.1.2.3 HOMOGENIZACION DE ALTA PRESIÓN

I.1.2.3.1 CIZALLA LÍQUIDA:
Paso de la suspensión de células a elevada presión (mayor a 55MPa) a través de un orificio
estrecho, ruptura celular por caída brusca de presión y choque, efectividad depende del

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condiciones de crecimiento. Este método se recomienda aplicar a microorganismos como
bacterias Gram negativas y positivas. (Huerta, 2015).

Para su aplicación se usa el homogeneizador de Manton-Gaulin el cual tiene una bomba

de pistón y una válvula. En la válvula las células se someten a turbulencia, cavitación y
esfuerzos de corte líquido. La fuerza del choque sobre el anillo es la causa principal del
rompimiento.

Figura 3. homogeneizador de Manton-Gaulin

I.1.2.3.2 CIZALLA SÓLIDA:
Paso de células congeladas (-20 ºC) entonces se hace pasar a alta presión, agitación en
presencia de abrasivo (cristales de hielo) más ruptura por cizalla líquida, paso a través de
orificio donde ocurre un desgarro por cristales de hielo. No produce la desnaturalización
de las enzimas y no se aplica a gran escala: manejo complicado y costoso (Huerta, 2015).

I.1.2.3.3 ULTRASÓNICA
Se utiliza ondas ultrasónicas se encontrarán por encima de 16000 Hz, pudiendo llegar a 1
GHz de frecuencia, actualmente se utilizan para la generación de ondas ultrasónicas
materiales como el cuarzo (cristales) o de cerámicas, como por ejemplo de Titanato de
Bario. Las células se someten a vibraciones ultrasónicas que resultan en su ruptura y
formación de un homogeneizado.
La disrupción celular por ultrasonido está asociada con el proceso de cavitación. Se puede
usar de forma continua hasta 15 minutos, provoca cambios de presión de miles de
atmósferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras
y a veces, para determinados tejidos animales. La sonicación puede causar efectos en la
estabilidad enzimática, varía dependiendo de factores asociados como el pH, temperatura,
tipo de Buffer, tiempo, entre otros.
Las desventajas de este método son: genera mucho calor, por lo que requiere de un buen
control de temperatura, los productos de interés pueden ser degradados en el curso de la
disrupción celular, produce altos niveles de sonido, no se utiliza a escala industrial por
sus costos elevados. Suspensión de células a pequeña escala.

I.2 MECANISMOS EN ESTADO SÓLIDO

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I.2.1 MOLIENDA
Es un método convencional de rompimiento por fricción, las células son rotas por medio
de una molienda con abrasivos, ejemplo: arena, cuarzo, vidrio molido (1).

I.2.2 PRENSA FRANCESA

Las células pasan a través de poros pequeños con una presión muy elevada, las células se
rompen al cambio brusco de presión (Cuervo, 2005).

I.2.3 MOLINOS DE BOLAS

Las células son trituradas con esferas de vidrio o acero (Huerta, 2015).
0.1 mm: Bacterias, esporas, 0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no
anexas, células tripsinizadas, 1.0 - 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas.
I.2.4 SHOCK OSMÓTICO
Las células se hacen estallar al someterlas a un medio hipotónico, lo cual hace que la
membrana no resista la presión osmótica. Puede ocasionar el daño a las membranas de
algunas organelos. Primero se elimina restos del medio de cultivo, posteriormente se re
suspende en una solución hipertónica (sacarosa 20%). Las células cuando se equilibran,
se recogen, centrifugan y re suspenden rápidamente en agua a 4°C, al entrar el agua al
interior celular produce ruptura. Se libera un 4-8% de proteína total, pero si la enzima que
se desea extraer está en la región periplasmática este método incrementa de 14 a 20 veces
la purificación con otras técnicas de extracción.

No se recomienda porque en algunos organelos se lesiona la membrana. Es utilizado para

el aislamiento de mitocondrias y cromosomas mitóticos. Por ejemplo: ruptura de células
de sangre (1) & (Huerta, 2015).

I.2.5 TEMPERATURAS EXTREMAS

La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura,
congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a
temperatura ambiente (25 ºC). Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de
tampones específicos para proteínas solubles o bien que contengan además detergentes si
se pretende purificar proteínas asociadas a membranas, si bien en este caso hay que cuidar
que la enzima no se desnaturalice (2).

I.3 MÉTODOS FÍSICOS

I.3.1 CAVITACIÓN HIDRODINÁMICA
Consiste en la formación de microburbujas de vapor producidas de forma mecánica en un
medio líquido por variaciones en la presión, lo cual induce al rompimiento de la pared
celular (Flores, 2013).

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 Figura 4.Proceso de cavitación

I.3.2 DESECACIÓN
La deshidratación celular provoca por elevadas temperaturas produce el rompimiento de
las paredes y membranas (Alline, 2012).

II. MÉTODOS NO MECÁNICOS

II. 1 QUÍMICOS

II.1.1 pH EXTREMO
Cualquier variación en el pH puede tener consecuencias fatales en las células, la mayoría
sufren la desintegración de entre un pH de 11.5-12.5 obtenido mediante el empleo de
soluciones alcalinas como KOH, NaOH en un intervalo de 20 a 30 minutos, el álcalis
reacciona con la pared celular en diversas formas, produciendo la saponificación de
lípidos e hidrolizando la pared celular (López, 2008).

II.1.2 DETERGENTES

Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a

apertura de poros, con estas sustancias la ruptura celular es más suave, los detergentes
rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción
lípido-lípido, lípido-proteína y proteínaproteína. Los detergentes, al igual que los
lípidos, se asocian entre ellos y se unen a superficies hidrofóbicas. Ejemplo: Triton X-
100, SDS, Tween, Spam (Flores, 2013).

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 Figura 5. Detergentes para extracción de proteínas

II.1.3 SOLVENTES ORGÁNICOS

El fraccionamiento con solventes orgánicos está basado en las diferencias de solubilidad

que presentan las proteínas en soluciones acuosas de solventes orgánicos como el alcohol
(etanol), aldehídos, cetona (acetona) y éteres, empleados tanto sucesiva como
separadamente. Disuelven la pared celular fundamentalmente por la disolución de lípidos
asociados a membranas. Ejemplo: Tolueno, acetona (Menéndez, 2010).

II.1.4 ANTIBIÓTICOS
Algunos se utilizan por sus propiedades en la síntesis de la pared celular, como algunas
penicilinas, estas disociaran las uniones e interacciones de la pared celular (Flores, 2013).

II.1.5 AGENTES QUELANTES

Algunos como el EDTA atrapan cationes divalentes (Ca+2) que debilita la membrana
celular (Flores, 2013).

II.1.6 AGENTES CAOTRÓPICOS

Urea o sales de guanidina favorecen la disolución de proteínas y minerales de la pared
celular de algunas bacterias ocasionando su ruptura. Otro agente caotrópico utilizado es
el isotiocianato de guanidinio.

II.2 BIOLÓGICOS
II. 2.1 ADICIÓN DE ENZIMAS
Lisozima + EDTA; esta combinación digiere las paredes celulares por ruptura de los
enlances β(1→4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurímico (NAM) y la N-
acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido. Otro ejemplo es: la proteinasa K junto con
SDS.

II.2.2 AUTOLISIS
Es un proceso biológico por el cual una célula se autodestruye, en vegetales la absorción
de agua en exceso puede causar el rompimiento de vacuolas; en animales la producción
de la enzima autolisasa puede ocasionar la hidrólisis celular; en bacterias las enzimas
autolíticas de la pared bacteriana (autolisinas) lleva a la lisis celular (Koolman, 2004).

pág. 13
 II.2.3 INHIBIDORES DE PARED CELULAR
Algunas sustancias alteran la permeabilidad de la membrana celular, como: polienos,
polimixinas e imidazoles (Flores, 2013).

II.2.4 LISIS INDUCIBLE

Exponer las células a soluciones concentradas con sales y/o tratamiento radioactivo puede
inducir la lisis celular (Menéndez, 2010).

III. SELECCIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN

En la elección del método de ruptura celular depende de seis factores (Flores, 2013):

1. Naturaleza y fuente de la enzima (origen animal, vegetal, microbiana: fúngica o

bacteriana)
2. Escala de la operación (laboratorio, planta piloto o industrial)
3. Velocidad del método de extracción
4. Estabilidad de la enzima
5. Pureza requerida
6. Costo del proceso.
La ruptura celular depende del tipo de microorganismo:

Figura 6. Orden de dificultad de la ruptura celular.

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 IV. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE ALGUNOS MÉTODOS DE
EXTRACCIÓN

Tabla 1. Ventajas y desventajas de métodos de extracción de enzimas.

TIPO MÉTODO DESVENTAJAS VENTAJAS

Mecanismos Homogeneización Costo moderado. Usa en tejido animal y
en Estado con cuchillas vegetal.
Líquido Ultra Suspensión de células a pequeña Se puede utilizar varias
zonificación escala, costo es alto, requiere diferentes muestras.
grandes cantidades de energía.
Molienda Genera calor que puede afectar la Se usa para obtener grandes
actividad, eficiencia baja en cantidades de muestra.
pequeñas cantidades.
Prensa francesa Se lleva a pequeña escala, no Hacer estallar las células de
selectivo. forma uniforme, logrando
mayor efectividad en la
ruptura.
Molino de bolas No se puede llevar a gran escala, Costo Barato, se lleva a gran
no selectivo. escala.

Mecanismos Shock osmótico Lesión de algunos orgánulos. Su coste es barato.

en estado Números pasos de centrifugación. utilizado para el aislamiento:
sólido Mitocondria y Cromosomas
Mitóticos

Temperaturas En caso de purificar proteínas no En enzimas se detectarían

extremas enzimáticas, se requieren métodos mediante su ensayo de
de selección más específicos. actividad.

Físicos Cavitación Un método elevado costo, Más selectivo

hidrodinámica suspensión de células de a pequeña
escala.
Desecación Puede alterar las estructuras de las Método fácil de utilizar.
enzimas,

pág. 15
 7. PURIFICACIÓN DE ENZIMAS
Para estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso contar con
una muestra homogénea que solo contenga moléculas de un tipo. Las técnicas de
separación concentran en el tamaño, la carga y la polaridad que es donde residen las
diferencias de las moléculas (Acosta, 2015).

El método de purificación debe diseñarse desde un principio teniendo en cuenta la

cantidad de proteína que se requiere. E l grado de pureza dependerá del uso al que va a
ser sometido. En investigación lo más importante es la pureza que el rendimiento y la
escala son reducidos. En usos terapéuticos la pureza es máxima y la escala es mayor. En
la industria las necesidades son: gran cantidad, pureza menor y bajo costo (Freifelder,
2003).

7.1 CENTRIFUGACIÓN
En la extracción se obtiene un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas,
membranas y células rotas. La mezcla es centrifugada para separar en dos fases, en el
sobrenadante se encuentra las enzimas solubles. En enzimas liposolubles se debe se debe
realizar un tratamiento con detergentes para solubilizarlas en el medio acuoso. El
sobrenadante se somete a un centrifugado diferencial que permite la separación del
homogenado en varias fracciones (Sattayasai, 2012). La muestra se hace girar a unas 500
veces la fuerza de la gravedad (500 x g). Si la proteína deseada no se obtiene se aumenta
la velocidad, para separar las mitocondrias. Una vez solubilizadas se somete a una
purificación burda, comúnmente se utiliza sulfato de amonio y se lo conoce como
precipitación por sales (Acosta, 2015).

Figura 7. Centrifugación diferencial para purificación de proteínas .Fuente:

(Biomodel, 2016)

7.2 SEPARACIÓN POR LA SOLUBILIDAD

7.2.1 PRECIPITACIÓN POR SALES
La precipitación de proteínas mediante el uso de sales ha sido utilizada durante muchos
años, siendo útil tanto para su purificación como para su concentración. La sal más
comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta solubilidad, la ausencia
de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo costo. La precipitación de una
proteína mediante el tratamiento con una sal depende de diversos factores: como el pH,
temperatura, la concentración de proteínas y la sal empleada (Rodas, 2010).

pág. 16
Altas concentraciones de sales disminuyen la solubilidad de las enzimas, efecto llamado
desplazamiento salino. La concentración de sal en la que una enzima precipita difiere de
una proteína a otra. Por lo tanto, soluciones salinas se puede usar para fraccionar las
proteínas. Por ejemplo, el sulfato de amonio 0,8 M precipita el fibrinógeno, una proteína
de coagulación de la sangre, mientras que se necesita una concentración de 2,4 M para
precipitar la albúmina sérica. La sal puede ser removida por diálisis si es necesario
(Jankowski et al., 2012).

Figura 8. Precipitación por cambio iónico. Fuente: (Atom, 2010).

7.3 SEPARACIÓN POR EL TAMAÑO

7.3.1 DIÁLISIS
Es un método de filtración molecular, separa moléculas de acuerdo a su tamaño. Se
emplea membranas semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las
macromoleculares. Estos poros permiten que difundan a través de la membrana sales y
metabolitos pequeños, pero bloquean la difusión de moléculas de mayor tamaño. La
diálisis se emplea rutinariamente para cambiar el disolvente en el que se encuentran
disueltas las macromoléculas. Una disolución macromolecular se introduce en el saco de
diálisis, que se sumerge en un volumen relativamente grande de disolvente nuevo. Las
moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al fluido externo hasta que se alcanza
el equilibrio, las macromoléculas permanecerán en el interior de saco de diálisis. El
proceso puede repetirse varias veces a fin de sustituir completamente un sistema
disolvente por otro (Amorós et al., 2013).
Algunos factores afectan la velocidad de diálisis como: solución acuosa, generalmente la
diálisis es mayor en agua destilada sin embargo en algunos casos es necesario utilizar
soluciones de fuerza iónica y pH definido. Solución de macromoléculas, durante la
diálisis penetra agua en el saco por ósmosis, por lo tanto, el tubo debe llenarse
completamente con el fin de evitar la dilución del contenido. Condiciones físicas:
temperatura, entre más alta sea la temperatura, mayor será la velocidad de diálisis. A
temperaturas elevadas, la viscosidad del solvente es menor y la velocidad de difusión
aumenta (Amorós et al., 2013).

pág. 17
 Figura 9. Diálisis para purificación de proteínas. Fuente: (Stryer et al., 2012).

7.4 CROMATOGRAFÍA
7.4.1 CROMATOGRAFÍA POR FILTRACIÓ EN GEL
La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar moléculas en
función de su tamaño molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el
gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Cada gel se
caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamaño de sus poros
(Caballero, 2013).

El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio
(Figura 10) quedando listo para su uso.

Figura 10. Esquema de una columna de cromatografía por filtración en gel.

Fuente (Caballero, 2013)

La muestra se aplica a la parte superior de una columna que consta de perlas porosas
hechas de un polímero insoluble pero altamente hidratado tales como dextrano o agarosa

pág. 18
(que son los hidratos de carbono) o poliacrilamida. Los poros de estas perlas no tienen en
tamaño suficiente para retener a las enzimas, mientras que lo para moléculas más
pequeñas estos poros hacen que tengan un camino más tortuoso y que demore más su
salida. Por tanto, las enzimas son las primeras en salir de la columna. El tamaño de los
poros internos depende de la naturaleza del polímero en cuestión, y permite la entrada a
proteínas por debajo de un determinado peso molecular (Tymoczko et al., 2012).

Factores que influyen en la separación:

Longitud de la columna: La capacidad de separación de sustancias de diferente tamaño
aumenta con la longitud de la columna.

Flujo: La resolución de la separación disminuye al aumentar el flujo del líquido con que
son arrastradas las moléculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre
2 y 10 𝑐𝑚 . ℎ−1 .

El volumen de la muestra a cromatográfica debe ser pequeño comparado con el volumen

total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volúmenes de
muestra iguales o menores al 5% del volumen total.

Figura 11. Cromatografía por filtración en gel . (Stryer, 2012)

7.4.2 CROMATOGRAFÍA POR INTERCAMBIO IÓNICO

La cromatografía de intercambio iónico es un método que permite la separación de
moléculas basada en sus propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase
estacionaria o intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva
en la superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contraiones móviles que pueden
intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con
cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que
contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten
con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria (Álvarez, 2012).

Si una proteína tiene una carga positiva neta a pH 7, por lo general se unen a una columna
de perlas que contienen grupos carboxilato, mientras que una proteína cargada
negativamente no. Una proteína cargada positivamente unida a dicha columna puede
entonces ser eluido (liberado) mediante el aumento de la concentración de cloruro de

pág. 19
sodio u otra sal en el tampón de elución debido a los iones de sodio compiten con los
grupos cargados positivamente en la proteína para la unión a la columna. Las proteínas
que tienen una baja densidad de carga neta positiva tienden a surgir primero, seguido por
los que tienen una densidad de carga superior. Proteínas cargadas positivamente
(catiónicos) proteínas se pueden separar en cargada negativamente carboximetil-celulosa
(CM-celulosa) columnas. Por el contrario, las proteínas cargadas negativamente
(aniónicos) las proteínas se pueden separar por cromatografía en columnas de carga
positiva dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa) (Stryer, 2012).

Figura 12. Cromatografía por intercambio iónico. Fuente: (Stryer, 2012).

7.4.3 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad
de fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven
de soporte porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz
inerte que debe de tener una de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de
pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las
proteínas, la fase estacionaria es sólida (UNAM., 2007)

Muchas proteínas tienen la capacidad de unirse específicamente a ciertas moléculas,

mediante uniones fuertes, pero no covalentes. En esta técnica la molécula que se une
específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando y se une covalentemente
a una matriz inerte. Cuando el extracto con la mezcla de proteínas se aplica a la columna,
la proteína buscada se unirá al ligando inmovilizado mientras que las demás saldrán de la
columna con el tampón. En este caso también se utiliza el incremento de fuerza iónica
para eluir las proteínas (Stryer, 2012).

La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención

de proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas
cortas y un campo restringido para la separación (UNAM., 2007).

pág. 20
 Figura 13. Cromatografía por afinidad. Fuente: (UNAM., 2007).

7.4.4 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Su sensibilidad, su fácil
adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, es ideal para la separación de
especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustancias que son de
interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides,
especies organometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un
líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable (UNAM.,
2007).

Figura 14. Esquema de Cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC). Fuente:

(Floro, 2015)

7.5 ELECTROFORESIS
Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró
separar mezclas de proteínas por su distinta movilidad en un soporte poroso al que se

pág. 21
aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquier
especie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica (UNAM., 2007).

La muestra se deposita en un medio poroso de una mezcla de especies cargadas.

Aplicando un campo eléctrico en los extremos del soporte poroso, las especies se separan
en función de sus cargas y su movilidad en medio ionico. Cuanto más elevado sean el
voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separación; sin embargo, valores
altos de estas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente
evaporación del disolvente y acumulación de sales del tampón, lo cual es indeseable. Para
favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos)
que son disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso,
debidamente escogidas para que no formen precipitados con las especies del problema.
Como soportes se han utilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice,
etc. (UNAM., 2007).

Las proteínas pequeñas se mueven rápidamente a través del gel, mientras que las proteínas
grandes se quedan en la parte superior, cerca del punto de aplicación de la mezcla. La
movilidad de la mayoría de las cadenas de polipéptido en estas condiciones es linealmente
proporcional al logaritmo de su masa (Stryer, 2012).

7.6 ULTRASONIFICACIÓN
Es un proceso capaz de fraccionar, separar y concentrar sustancias sin que éstas sufran
cambios de fase, en el cual se utiliza una membrana semipermeable con poros de tamaño
definido, que determina el tamaño de las partículas que pasarán a través de ella. Debido
a que la membrana utilizada es semipermeable, es necesaria la presencia de una presión
(entre 4 a 8 atm) que auxilie a las partículas a fluir a través de la misma.

Existen dos categorías de membranas de ultrafiltración que presentan ambas una

estructura asimétrica. Primero las membranas formadas con polímeros orgánicos. Están
constituidas de una "piel activa"(capa que define el tamaño de las partículas que podrán
pasar por la membrana) soportada sobre una estructura macroporosa. La segunda
generación de membranas de ultrafiltración se prepara a partir de materiales cerámicos.

7.6.1 Ultrasonificación a pequeña escala:

Se utilizan tubos para centrifuga modificados, los cuales tienen un recipiente con forma
de cono adentro con la membrana en las paredes, estos se llenan con la solución problema
y se centrifuga, lo que origina la presión necesaria para que el proceso se lleve a cabo, el
solvente y las partículas de menor tamaño que los poros se colectan en el tubo más grande
(UNAM., 2007).

7.9.2 Ultrasonificación a gran escala:

Membrana de fibra hueca: los módulos contienen varios tubos o fibras de pequeño
diámetro (de 0,6 a 2 mm). La solución a filtrar fluye a través de los núcleos abiertos de

pág. 22
fibras y el líquido filtrado es recogido en un cartucho que rodea las fibras (UNAM., 2007).

Figura 15. Esquema Ultrasonificación. Fuente: (Canseco, 2010).

7.7 PARÁMETROS DE PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

En cada paso de la purificación de una enzima se debe medir el total de proteína, la
actividad, la actividad específica, el rendimiento, y el nivel de purificación (Stryer, 2012)
(Freifelder, 2003).

 La proteína total: La cantidad de proteína presente en una fracción se obtiene

mediante la determinación de la concentración de proteína de una parte de cada
fracción y multiplicando por el volumen total de la fracción (Sattayasai, 2012).
 La actividad total: La actividad enzimática de la fracción se obtiene mediante la
medición de la actividad de la enzima en el volumen de la fracción usada en el
ensayo y multiplicando por el volumen total de la fracción (Sattayasai, 2012).
 La actividad específica: Este parámetro se obtiene dividiendo la actividad total
de la proteína total (Sattayasai, 2012).
 Rendimiento: Este parámetro es una medida de la actividad retenida después de
cada etapa de purificación como un porcentaje de la actividad en el extracto crudo.
La cantidad de actividad en el extracto inicial se toma como 100% (Sattayasai,
2012).
 Nivel de purificación: Este parámetro es una medida del aumento de la pureza y
se obtiene dividiendo la actividad específica calculada después de cada etapa de
purificación por la actividad específica del extracto inicial (Sattayasai, 2012).

Un buen esquema de purificación tiene en cuenta tanto los niveles de purificación y el

rendimiento. Un alto grado de purificación y un rendimiento pobre dejan poco proteína
con la que experimentar. Un alto rendimiento con baja purificación deja a muchos
contaminantes (proteínas distintas de la de interés) en la fracción y complica la
interpretación de los experimentos (Stryer, 2012).
Tabla 2. Parámetros de seguimiento de una purificación enzimpatica. (Stryer, 2012)

pág. 23
 7.8 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS DE
PURIFICACIÓN

Tabla 3. Ventajas y desventajas de los métodos de purificación enzimática .

MÉTODO DE VENTAJAS DESVENTAJAS

PURIFICACIÓN
Centrifugación Separa enzimas solubles. Moléculas y proteínas no
deseadas se encuentran en el
sobrenadante.
Precipitación por sales Es una técnica fácil de hacer. Alta La técnica necesita una
solubilidad, la ausencia de toxicidad purificación posterior.
para la mayor parte de las enzimas y
a su bajo costo.
Diálisis Es una técnica es sencilla, bajo Aún permanecen moléculas de
requerimientos en cuanto su igual o mayor tamaño a la
seguimiento. Elimina moléculas de enzima.
tamaño más pequeño que la enzima.
El proceso puede repetirse varias
veces a fin de sustituir
completamente un sistema
disolvente por otro
Cromatografía por Tiempos de separación cortos y muy Inaplicabilidad en muestras con
filtración en gel. bien definidos. No hay pérdida de analitos de dimensiones similares
muestra porque los solutos no (como los isómeros). En general,
interaccionan con la fase se requiere una diferencia de 10
estacionaria % en las masas moleculares para
conseguir una resolución
razonable.
Cromatografía por Con una misma columna se puede Las proteínas se eluiran a un PH
intercambio iónico utilizar a diferentes pH y obtener igual a su Punto Isoeléctrico su
diversos perfiles de elución. solubilidad
estará disminuida y pueden
precipitar.
Cromatografía por Altamente selectiva para la Se debe tener conocimiento
afinidad retención de proteínas afines a la previo sobre ligandos que se
columna puedan usar
Cromatografía por Alta resolución, eficiencia y Costo inicial alto y operacional
líquidos de alta presión reproducibilidad. Análisis rápidos, medio. Muestra debe ser soluble.
(HPLC) analíticos y preparativo Requiere uso de patrones

pág. 24
Ultrasonificación La simplicidad, el corto tiempo de Taponamiento interno de las
operación y bajo costo son las membranas producido por el
principales. bloqueo de los poros por el
soluto.
La presión influencia el flujo de
solvente y la temperatura que
puede alcanzar la máquina.

8. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima

en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su
actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta
definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o
parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc.

Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos industriales

para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o alimentarios se ha recurrido al
uso de enzimas. La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y
la dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua, hacen
que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el método de
inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso biotecnológico sea
rentable y, sobre todo, para poder controlar con facilidad la velocidad de la reacción
mediante un proceso continuo (Herrera R., Bolaños V., & Lutz C., 2003).

La inmovilización de enzimas permite una mejora significativa de su estabilidad, combina

la actividad elevada y específica de las biomoléculas activas, como las enzimas o
anticuerpos, con la estabilidad química y mecánica del soporte. Las enzimas pueden ser
inmovilizadas en sustratos naturales y/o sintéticos por medios químicos (uniéndolas al
sustrato mediante enlaces covalentes) o físicos (fuerzas electrostáticas o membranas), y
pueden además ser encapsuladas mecánicamente la adición de agentes que formen una
película protectora alrededor de la enzima inmovilizada, permitiendo el paso de reactivos
y productos de tamaño pequeño, pero no de proteínas (Fajardo R., Osuna J.,
VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011).

La producción de enzimas muy selectivas y estables es cada día más frecuente. Según
(Guisán, 2006) las características de los protocolos de inmovilización son las siguientes:
a.- El uso de soportes pre-existentes que se puedan reutilizar una vez que la enzima se
haya inactivado. La enzima inactivada se puede separar del soporte y éste se puede volver
a recargar con enzima nueva.
b.- Derivados con muy buenas propiedades mecánicas. Por ejemplo: inmovilizados sobre
soportes pre-existentes adecuados para cada tipo de reactor, como geles de agarosa para
reactores tipo tanque agitado, soportes inorgánicos para columnas de lecho fijo, etc.
c.- Los soportes pre-existentes deben ser químicamente muy estables.

pág. 25
d.- Los procesos de inmovilización deben ser rápidos y realizarse en condiciones
experimentales muy suaves (pH neutro y bajas temperaturas) donde las enzimas son muy
fáciles de manejar.

Tabla 4. Ventajas y Desventajas de la inmovlización de enzimas

Ventajas Desventajas
El aumento de la estabilidad de la enzima La alteración de la conformación de la
enzima respecto de su estado nativo.

La posible reutilización del derivado, por La gran heterogeneidad del sistema

lo que disminuyen los costes del proceso enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas
inmovilizadas con un diferente número
de uniones al soporte
La posibilidad de diseñar un reactor Siempre suele haber una pérdida de
enzimático de fácil manejo y control, actividad de la enzima durante la
adaptado a la aplicación de la enzima movilización
inmovilizada
Rápidas tasas de reacción y una fácil El biocatalizador es más caro que la
separación de los productos. enzima nativa.

7.5 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN

FÍSICA

Figura 16. Métodos de inmovilización mediante retención física (Arroyo M. , 1998).

8.1.1 ATRAPAMIENTO
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz
sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros
del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El
proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una

pág. 26
solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de
temperatura o mediante la adición de un reactivo químico (Arroyo M. , 1998).
El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los
geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que
en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una
fibra sintética.
El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no
sufre ninguna alteración en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un
control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que
la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína (Datta,
Christena, & Sriramulu, 2012).

Figura 17. Enzimas inmovilizadas por inclusión dentro de una matriz de gel.
A) gel húmedo. B) esferas del gel seco y triturado (Fajardo & Osuna, 2011).

8.1.2 INCLUSIÓN EN MEMBRANAS

Existe dificultad de la inclusión de la enzima en el interior de la matriz, ya que

generalmente queda atrapada en la superficie exterior y puede desprenderse
paulatinamente debido al tipo de interacciones presentes o tras varios ciclos de uso. Sin
embargo, esto se ve solucionado al controlar el tamaño de poros de las esferas y al dar un
tratamiento con un agente que encapsule la proteína evitando su fuga y protegiéndola de
proteasas (Fajardo R., Osuna J., VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011)

8.1.2.1 MICRO ENCAPSULACIÓN.

En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten
el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas
semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no
permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las
microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100
µm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran

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variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo
determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos (Arroyo M. , 1998).
El método puede ser de dos tipos: por microencapsulación en soportes porosos (con un
diámetro de 2-50 nm), que posteriormente pueden ser recubiertos con un revestimiento
nanocompuesto, atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y
productos; por microemulsión o liposomas, combinando la enzima con agentes
emulsificantes y agitando para formar micelas que la protegen de medios ácidos/alcalinos,
proteasas y durante los periodos de almacenamiento (Fajardo & Osuna, 2011).

En la microencapsulación las partículas porosas (esferas de sílice con nanoporos,

micropartículas de CaCO3, etc.) son puestas en suspensión con la enzima por un tiempo
dado (aprox. 40 min), y la cantidad de enzima inmovilizada es monitoreada por
espectroscopía.

Figura 18. Enzimas inmovilizadas por encapsulación.

A) microencapsulación dentro de esferas porosas. B) Microemulsión en micelas.

8.1.2.2 REACTORES DE MEMBRANA

El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran
interés en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final,
permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una
bomba se establece un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor (Arroyo M. ,
1998).
En general, en esta metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre
la membrana que formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos formas:
mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través de la membrana y por
contacto continuo de una solución de enzima con la membrana (Arroyo M. , 1998).

pág. 28
8.2 INMOVILIZACIÓN POR UNION QUÍMICA.

Figura 19. Métodos de inmovlización por unión química

8.2.1 UNIÓN POR SOPORTE

Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor
información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe
tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser
fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado
una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas
enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque
generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más
corrientemente en forma de esferas. Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante
adsorción o por unión covalente (Datta, Christena, & Sriramulu, 2012).

Figura 20. Tipos de soportes (Arroyo M. , 1998)

pág. 29
8.2.1.1 ADSORCIÓN
En la adsorción, la enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas, fuerzas de
Van der Waals y por puentes de hidrógeno. Los principales factores que influyen en la
adsorción, son:
a) pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la
superficie de la proteína y del sólido;
b) Fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción de la enzima,
ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína;
c) el diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor
de la enzima;
d) Presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya que pueden
incrementar la carga enzimática del derivado.

Figura 21. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico. A) Por adsorción, la región

positiva de la proteína interactúa con el soporte negativo.

8.2.1.2 UNIÓN IÓNICA

Se utilizan intercambiadores orgánicos de iones (DEAE, CM, etc) e inorgánicos (sílice).
Es una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear resinas de
intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos
contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga,
sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble (Arroyo M. , 1998).
La naturaleza de las fuerzas involucradas en la inmovilización no covalente resulta en un
proceso que puede ser reversible cambiando las condiciones que influyen en la resistencia
de la interacción (pH, resistencia iónica, temperatura y polaridad del solvente). La
inmovilización por adsorción es fácil de realizar y usualmente preserva la actividad
catalítica de la enzima. Dichos métodos son, por lo tanto, atractivamente económicos,
pero pueden presentar problemas como la liberación de enzimas cuando las interacciones
son relativamente débiles. De igual forma es difícil encontrar condiciones bajo la cuales
las enzimas permanecen enlazadas fuertemente y activas (Fajardo R., Osuna J.,
VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011).

pág. 30
8.2.1.3 ADSORCIÓN HIDROFÓBICA
Otro método es el uso de interacciones hidrofóbicas, donde la adsorción hidrofóbica ha
sido utilizada como un principio cromatográfico por más de 3 décadas. Consiste en
variables experimentales conocidas como el pH, concentración de sales, y la temperatura.
La resistencia de las interacciones radica en la hidrofobicidad del adsorbedor y de la
proteína. La hidrofobicidad del adsorbedor puede ser regulada por el grado de sustitución
del soporte y por el tamaño de la molécula ligante hidrofóbica. El éxito de la
inmovilización reversible de la β-amilasa y amiloglucosidasa en soportes de hexilagarosa
ha sido reportada (Fajardo R., Osuna J., VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V.,
2011).

8.2.1.4 QUELACIÓN O UNIÓN METÁLICA

Sales de metales de transición o hidróxidos depositados en la superficie de soportes
orgánicos han podido ser enlazados gracias a la coordinación de los grupos nucleofílicos
en la matriz. Se utilizan principalmente sales de titanio y circonio, siendo este método
conocido como inmovilización por enlace metálico. La sal metálica o el hidróxido es
precipitado en el soporte (celulosa, quitina, ácido algínico y bases de sílice) por
calentamiento o neutralización. Debido a los factores estéricos es posible para la matriz
ocupar todas las posiciones de coordinación del metal, por lo tanto, algunas de las
posiciones permanecen libres para coordinarse con grupos de enzimas (Fajardo R., Osuna
J., VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011).

La elusión de proteínas enlazadas puede ser fácilmente lograda por competencia con
ligantes solubles o disminuyendo el pH. El soporte es subsecuentemente regenerado
lavándolo con un fuerte quelante como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Estos
soportes metálicos han sido utilizados ampliamente en cromatografía de proteínas
(Fajardo R., Osuna J., VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011) .

8.2.1.3 UNIÓN COVALENTE

La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más
interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se
basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos
de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura
de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son
principalmente la lisina, cisteína, tirosina, histidina y en menor medida la metionina,
triptófano, arginina, ácido aspártico y glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su
carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica,
y no pueden intervenir en la unión covalente (Datta, Christena, & Sriramulu, 2012).
El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar
esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que
bloquee el centro activo. Otro inconveniente es el sitio del enlace, ya que puede
modificarse el sitio activo o pueden ocurrir impedimentos estéricos que reduzcan la
actividad. Sin embargo, esto es poco probable y puede verse reducido al dirigir el enlace

pág. 31
a sitios específicos y/o con una orientación molecular definida (Fajardo R., Osuna J.,
VillaVelázquez C., Escalante P., & Ibarra V., 2011).

Figura 22. Enzimas inmovilizadas en un soporte físico por enlace covalente, las
enzimas se encuentran orientadas espacialmente en el soporte

8.2.1.4 UNIÓN POR AFINIDAD

Este método de inmovilización se basa en que las enzimas, al igual que los anticuerpos
y otras proteínas, tienden a fijarse a determinados moléculas orgánicas por las que tienen
afinidad, formando complejos estables y reversibles con estas moléculas. Su
inmovilización en soportes inorgánicos sería similar, aunque con algunas modificaciones
en la activación del soporte, cuando la enzima o proteína no presente afinidad por
determinados grupos funcionales de soportes comerciales, se pueden añadir a la proteína
dominios proteicos con afinidad por tales (UCM, 2002).

8.2.1.5 SELECCIÓN DEL SOPORTE

Las características de las matrices o soportes son de gran importancia en la determinación

de la eficiencia del sistema de inmovilización de enzimas. Las propiedades ideales de un
soporte incluyen la resistencia física a la compresión, hidrofilicidad, inertes entre las
enzimas y sus derivados, biocompatibilidad, resistencia al ataque microbial y bajo costo.
Asimismo, los soportes pueden clasificarse en inorgánicos y orgánicos en función de su
composición química Figura 20.

Las características físicas de los soportes como el tamaño medio de partícula o resistencia
mecánica a la compresión son de gran importancia en el comportamiento del sistema
inmovilizador y determinará el tipo de reactor por usar bajo condiciones técnicas. En
particular, el parámetro de poro y el tamaño de partícula establecerán el total del área
superficial, por lo tanto, la adecuada selección incidirá en la capacidad de enlace de las
enzimas.
Los soportes no porosos muestran pocas limitaciones, pero presentan baja capacidad de
carga. Por lo tanto, los soportes porosos son generalmente preferidos por su alta área

pág. 32
superficial que permite una alta carga de enzimas, así como porque las enzimas
inmovilizadas quedan aisladas del medio ambiente.

Se debe controlar la distribución del tamaño de poro en los soportes porosos para
optimizar la capacidad y las propiedades de flujo. A pesar de las muchas ventajas de los
soportes inorgánicos, la mayoría de las aplicaciones industriales se realizan con soportes
orgánicos. El carácter hidrofílico es uno de los factores más importantes que se utilizan
para determinar el nivel de actividad de las enzimas inmovilizadas. Una excelente matriz
o soporte que ha sido utilizada es la agarosa.

8.2.2 RETICULADO
También se lo conoce como entrecruzamiento o cross-linking, el método usa reactivos
bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre moléculas y enzimas. El
método se desarrolló en la década de los sesenta. Ejemplos de los reactivos que se usan
son: dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e incluso, diaminas
si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y
temperatura (UIS, 1990)

El método más novedoso actualmente consiste en la cristalización de enzimas y su

posterior reticulado con glutaraldehido, el resultado obtenido aumenta la estabilidad que
se basa en el entramado cristalino formado, donde las moléculas de enzima se encuentran
rodeadas por moléculas de proteína. La enzima actúa como soporte y su estructura
terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura
cristalina posee canales microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta
el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción (Arroyo, 1998).
El co-reticulado, elimina las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos
difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad
enzimática y rica en residuos de lisina como la albúmina bovina (Arroyo, 1998).

pág. 33
 Figura 23. Esquema de métodos de inmovilización enzimática: adsorción, unión
covalente, atrapamiento, entrecruzamiento. Fuente: (Salazar et al., 2015).

8.3 EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN

A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas,

pues se producen cambios en su estabilidad y además la enzima inmovilizada es un
sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso
catalítico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores) se encuentran en
interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima.
Como consecuencia, la actividad enzimática se ve afectada por efectos de tipo difusional,
estérico y del microentorno.

8.3.1 EFECTOS DE LA ESTABILIDAD

Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su

inmovilización, que se debe principalmente a (Arroyo M. , 1998):

 La existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de

la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más resistente a la desactivación
térmica o química. Este tipo de estabilización se obtiene en el método reticulado o
la unión a soportes activados. La inmovilización covalente multipuntual se puede
combinar con la adición de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la
estructura de la enzima.
 La protección frente a las proteasas en el medio. La unión de proteasas a un soporte
elimina su capacidad proteolítica, y evita su autolisis.

pág. 34
  Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas
en una determinada región del espacio.
 La existencia de una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción
de la enzima con el soporte. El soporte tiene un efecto tamponador de tal manera
que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución
se produzcan cambios importantes de pH. En aquellas reacciones catalizadas por
enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, la “acuofilia” del
soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto
mayor es la acuofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad
necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación activa.

8.3.2 EFECTOS DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por
diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede deberse a: que la
unión al soporte impide el paso del sustrato al centro activo. Los grupos reactivos del
soporte reaccionan con algún aminoácido que forma parte del centro activo o que es
esencial para la actividad catalítica de la enzima. La inmovilización puede originar un
cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva. Las condiciones
experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la enzima. Si
la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los cambios (disminución
o aumento de la actividad enzimática) se deben principalmente a efectos difusionales,
electrostáticos, estéricos y/o del microentorno.

Tabla 5. Comparación entre los métodos de inmovilización de enzimas (Arroyo M. ,

1998)

8.4 APLICACIONES DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Una vez las enzimas has sido fijadas a un soporte se logra conservarlas y hacer circular
en continuo la solución a través de las enzimas inmovilizadas. Se utiliza en procesos
químicos, análisis, tratamientos médicos, procesado de alimentos, cromatografía de
afinidad, tratamiento de aguas residuales, etc. (Peñate, 1994 ).

 Aplicaciones analíticas: biosensores

pág. 35
Los biosensores son una herramienta utilizada en medicina, el control de calidad de los
alimentos y el control medioambiental. Se puede diseñar un biosensor para cualquier tipo
de compuesto que sea capaz de interaccionar específicamente con un sistema biológico.
Son de gran utilidad en el campo del diagnóstico clínico. Se determinan niveles
sanguíneos de glucosa, lactato, urea, colesterol, creatinina y ácido úrico. Hay biosensores
para control de calidad en la industria alimentaria, para la determinación de
contaminación microbiana o detección de polución ambiental, presencia de residuos
tóxicos, pesticidas, herbicidas o microorganismos. algunos biosensores utilizan
medidores sensibles de fluorescencia, lo cuales monitorean los cambios en la
fluorescencia intrínseca de FAD de la glucosa oxidasa (Cedillo, 2014).

 Aplicaciones médicas:
Se puede utilizar enzimas inmovilizadas por el método de atrapamiento con fines
terapéuticos en caso de deficiencia enzimática o desordenes metabólico. Se han aplicado
enzimas en microcápsulas para fines terapéuticos. Resultan interesantes los estudios que
pretenden atrapar enzimas en membranas que sean degradables y que por lo tanto puedan
ser eliminados del cuerpo en un determinado periodo de tiempo. Ejemplo la asparraginasa
ha sido atrapado en células de eritrocitos. También el atrapamiento de enzimas en
liposomas para la terapia de determinadas enfermedades. Adicionalmente se han
realizado intentos para usar enzimas inmovilizadas para órganos artificiales (Rojas,
2002).

 Aplicación en la elaboración de alimentos

En la elaboración de leche se utiliza peróxido de hidrógeno para su esterilización, para
eliminar el exceso de este reactivo se utiliza la catalasa inmovilizada. Para prevenir la
aparición de un sabor oxidado se utiliza tripsina inmovilizada. Se ha utilizado enzimas
inmovilizadas para para la preelaboración de bebidas y licores, como la amilasa para para
hidrolizar almidón durante la fabricación de cerveza. Se utiliza papaína y polifenol
oxidada inmovilizadas para evitar la turbidez de la cerveza que ha sido guardada durante
mucho tiempo. Se ha utilizado naringinasa inmovilizada para eliminar el sabor amargo
en el zumo de naranja, etc (Rojas, 2002).

 Aplicaciones en la industria farmacéutica

Se trabaja con moléculas lábiles, y en muchos casos con moléculas quirales. El empleo
de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a la síntesis química en pasos clave,
donde no conviene trabajar a temperaturas altas o se requiere una elevada especificidad
de sustrato. Los enzimas son unos reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores
con una estructura tridimensional asimétrica definida que permiten la obtención de
productos de gran pureza óptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las
reglamentaciones exigen la síntesis de compuestos ópticamente puros, ya sean fármacos,
hormonas o antibióticos. (Rojas, 2002)

 Aplicaciones en tratamientos de aguas residuales

Se ha utilizado numerosos tratamientos como: la HRPc que cataliza la oxidación de fenol
con 𝐻2 𝑂2 para generar radicales fenoxi que salen del centro activo de la enzima y en la
disolución reaccionan no enzimáticamente para formar oligómeros y polímeros de

pág. 36
 superior peso molecular y menos solubles en la disolución acuosa de trabajo. Si los
productos de reacción formados precipitan en la disolución, podrán ser eliminados por
sedimentación y filtración (Rojas, 2002). Se ha utilizado tirosinasa para la eliminación de
compuestos aromáticos en los efluentes de las industrias. Esta enzina utiliza 𝑂2 molecular
como agente oxidante, pero se inactiva por reaccion con las benzoquinonas formadas
durante el proceso de oxidación que catalizan, etc (Rojas, 2002).

La "bioremediación" es el proceso que se ocupa de la utilización de sistemas biológicos

para producir rupturas, cambios moleculares o separación de tóxicos, contaminantes y
sustancias de importancia ambiental en suelos, aguas y aire, generando compuestos de
menor o ningún impacto ambiental, o bien separando la substancia tóxica. (Rojas, 2002)

8.5 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS DE INMOVILIZACIÓN

ENZIMÁTICA
Tabla 6. Ventajas y Desventajas de las técnicas de inmovilización enzimática

Técnica de inmovilización Ventajas Desventajas

Atrapamiento Técnica muy sencilla. Requiere un control riguroso

Requiere poca cantidad de
enzima para obtener
derivados activos.
La enzima no sufre ninguna
alteración en su estructura.
de las condiciones de
polimerización, así como
la comprobación de que la
naturaleza química del
proceso no altera los grupos
reactivos de la proteína.

Inclusión en membranas Por su naturaleza de Es una técnica costosa.

interacción suave, permite La dificultad de la inclusión
una alta actividad y de la enzima en el interior de
resistencia a cambios de pH y la matriz.
temperatura
Pérdida de actividad ante la
Permite que la enzima inmovilidad de la proteína al
funcione en un sistema en quedar atrapada en la
solución, pero al mismo interface agua/aceite, o al ser
tiempo protegida del desnaturalizada por el
ambiente degradante. esfuerzo de corte generado
durante la preparación de las
Puede llevarse a cabo micelas.
repetidas veces (emulsión
múltiple), agregando agentes
emulsificantes secundarios y
espesantes para proporcionar
una mayor protección.

pág. 37
 Por la naturaleza de los
reactivos utilizados, puede
tener uso farmacológico en la
administración oral de
inmunoglobulinas.

Unión covalente No cambia la actividad Es una técnica difícil de

enzimática.
La manipulación de los
derivados inmovilizados es
sencilla;
La carga de enzima
permanece constante después
de la inmovilización;
Los derivados pueden
utilizarse en reactores en
continuo, empaquetados, de
lecho fluidizado o tanque
agitado.
Una mayor resistencia a la
desactivación por el efecto de
la temperatura, de los
disolventes orgánicos o del
pH, al tener estabilizada su
estructura terciaria.
preparar.
Tiene un alto costo
Es necesario conocer la
densidad de grupos activos
por unidad de superficie, ya
que condiciona el número de
uniones enzima-soporte y su
geometría, que puede ser
distorsionante y conducir a
derivados inactivos.
El proceso de inmovilización
puede alterar la estructura del
centro activo.
La inmovilización covalente
no es aconsejable en aquellas
enzimas muy sensibles a
cambios de pH, fuerza iónica,
etc.

Adsorción Su preparación sencilla, Los derivados obtenidos son

Bajo coste, poco estables desde el punto
No hay cambios de de vista mecánico.
especificidad enzimática, La unión al soporte es débil.
Los derivados son estables en La optimización de las
medios de trabajo con bajo variables que controlan la
contenido en agua. adsorción

Reticulado Se obtiene una alta La actividad enzimática es

estabilidad de la enzima. baja.

8. CONCLUSIONES

La extracción, purificación e inmovilización son procedimientos necesarios para la

aplicación y caracterización de las enzimas, dependiendo de la enzima de interés y de la
disponibilidad de equipo se debe escoger las mejores técnicas que permitan obtener
enzimas puras e inmovilizadas.

Los factores que inciden en la selección de un método son: las propiedades de la enzima,
la fuente enzimática, el coste, la facilidad y reproducibilidad de la técnica entre otras. En
la extracción es importante tener en cuenta la localización subcelular de las enzimas ya

pág. 38
que esto determina si el procedimiento a ser realizado requiere de un rompimiento celular
o solo se requiere una separación de la biomasa en base al microorganismo tratado.

El proceso de rompimiento celular depende de seis factores como son la naturaleza y

fuente de la enzima, la escala de la operación, la velocidad del método de extracción que
está siendo utilizado, la estabilidad que presenta la enzima, cual es la pureza que se quiere
obtener y el costo de todo el procesamiento los mismo que se deben tener en cuenta para
lograr un extracto que permita un correcto análisis.

La purificación enzimática está basada en la solubilidad, tamaño, carga, y la afinidad de

unión de la enzima. Por lo general, mezclas de proteínas se someten a una serie de
separaciones, cada una de estas separaciones deben tener características especiales para
la purificación de la proteína de interés. En cada fase de purificación se debe determinar
la actividad enzimática de las fracciones, la actividad específica y la pureza de la enzima,
esto permitirá saber si la purificación se está llevando por un camino adecuado.

Durante todos los procesos descritos es importante evitar la desnaturalización de la

proteína, ya que una vez que esto suceda perderá propiedades biológicas al igual que su
actividad, por lo tanto, se debe utilizar soluciones tampón para evitar cambios bruscos de
ph.

La inmovilización de las enzimas es una de las técnicas más prometedoras para procesos
biotecnológicos altamente eficientes y económicamente competentes en materia de
vigilancia del medio ambiente, la biotransformación, diagnóstico, farmacéutica e
industrias alimentarias.

Las estrategias basadas en enzimas están reemplazando cada vez más métodos químicos
convencionales ya que presentan atributos como la eficiencia, el rendimiento más rápido
y el uso múltiple. Sin embargo, la comercialización de enzimas inmovilizadas está en un
ritmo menor debido a sus costos y problemas de almacenamiento.

pág. 39
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pág. 42
 10. GLOSARIO

Abrasivos: Sustancia que tiene como finalidad actuar sobre otros materiales con
diferentes clases de esfuerzo mecánico —triturado, (molienda), corte, pulido—. Es de
elevada dureza y se emplea en todo tipo de procesos, industriales y artesanales.

Actividad catalítica: Proceso por el cual se aumenta la velocidad de una reacción

química, debido a la participación de una sustancia llamada catalizador y las que
desactivan la catálisis son denominados inhibidores.

Actividad específica: es la relación entre la actividad total (u) sobre el contenido de

proteína total en mg.

Absorción: es la retención de una sustancia por las moléculas de otra ya sea en estado
líquido o gaseoso.

Adsorción: Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o retenidos
en la superficie de un material.

Álcalis: Son sustancias cáusticas que se disuelven en agua formando soluciones con un
pH bastante superior a 7 (al neutro): amoniaco, hidróxido amónico, hidróxido y óxido
cálcicos, hidróxido de potasio, hidróxido y carbonato potásico, hidróxido de sodio ,
carbonato, hidróxido, peróxido y silicatos sódicos y fosfato trisódico

Alginato: Es un polisacárido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias

especies de algas.

Agentes caotrópico: es una sustancia que desorganiza la red tridimensional del agua
influyendo en la organización de sus moléculas a través de sus enlaces de hidrógeno, y
en la interacción de estas con otros solutos como macromoléculas tales como proteínas.

Agentes emulsificantes: Compuestos que disminuyen la tensión inferfacial y forma una

película en la interfase. Se usan para promover la emulsificación durante la manufactura.

Autolisis: Proceso biológico por el cual una célula se autodestruye.

Biocatalizador: Es un catalizador de las reacciones bioquímicas de los seres vivos. Se

consideran biocatalizadores las enzimas, las hormonas y las vitaminas

Biomasa: Materia orgánica originada en un proceso biológico, espontáneo o provocado,

utilizable como fuente de energía.

Cavitación: Formación de cavidades llenas de vapor o de gas en el seno de un líquido en

movimiento.

Extracto crudo: la mezcla homogénea sin ningún tratamiento de purificación.

pág. 43
Factor de purificación: Es la relación entre la actividad específica del paso “n” de
purificación y la actividad específica del extracto inicial.

Fuerza iónica. Donde cB es la concentración molar de iones B, zB es la carga de cada ion,

y el sumatorio se refiere a cada una de las especies iónicas presentes en el medio.

Hipotónico. ... Una solución hipotónica, denominada también hipotona, es una solución
en la cual el solvente (como puede ser un plasma diluido) tiene una menor concentración
de soluto (sales, etc.) que la que hay en el medio celular interno (o citoplasma).

Homogeneidad: Cualidad de una cosa homogenea o formada por elementos de la misma

naturaleza
Homogeneización: Se refiere al rompimiento de la celula o el tejido del cual se pretende
extraer la organela o la molecula de interes biologico.

Inmovilización enzimática: Proceso por el que una enzima es contenida y pierde su

movilidad.

Ligando: es una sustancia (usualmente una molécula pequeña) que forma un complejo
con una biomolécula. En un sentido más estricto, es una molécula que envía una señal al
unirse al centro activo de una proteína.

Lisozima: Enzima bactericida que impide infecciones y que está presente en numerosas
sustancias segregadas por los seres vivos, como las lágrimas, la saliva o la leche.

Movilidad relativa: Distancia recorrida de la banda sobre un gel de agarosa o

poliacrilamida después de una electroforesis.

Polímero: Sustancia química que resulta de un proceso de polimerización. Se definen

como macromoléculas compuestas por una o varias unidades químicas (monómeros) que
se repiten a lo largo de toda una cadena.

Quelante: Secuestrante, o antagonista de metales pesados, es una sustancia que

forma complejos con iones de metales pesados. A estos complejos se los conoce como
quelatos, palabra que proviene de la palabra griega chele que significa "garra".

Rendimiento. Este parámetro es una medida de la actividad retenida después de cada

etapa de purificación como un porcentaje de la actividad en el extracto crudo. La cantidad
de actividad en el extracto inicial se toma como 100%.

SDS-PAGE: Técnica molecular en la que se obtiene un fraccionamiento que obedece a:

la diferencia de peso; la longitud de la cadena (tamaño); y la forma de la proteína. Es el
método de electroforesis empleado con mayor profusión para analizar proteínas.

Tampón químico: Un tampón, buffer, solución amortiguadora o solución reguladora es

la mezcla en concentraciones relativamente elevadas de un ácido y su base conjugada, es

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decir, saleshidrolíticamente activas. Tienen la propiedad de mantener estable el pH de
una disolución frente a la adición de cantidades relativamente pequeñas de ácidos o bases
fuertes. Este hecho es de vital importancia en diversos contextos en donde es necesario
mantener el pH en un umbral estrecho, por ejemplo, con un leve cambio en la
concentración de hidrogeniones en la célula se puede producir un paro en la actividad de
las enzimas.

Termolábil: Que se altera con facilidad por la acción del calor: material termolábil.

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 11.ANEXOS

CUESTIONARIO
1. Escriba la clasificación de enzimas según su localización
Enzimas intracelulares y enzimas extracelulares

2. Describa dos métodos de extracción enzimática físicos

CAVITACIÓN HIDRODINÁMICA
Consiste en la formación de microburbujas de vapor producidas de forma mecánica en un
medio líquido por variaciones en la presión, lo cual induce al rompimiento de la pared
celular.
DESECACIÓN
La deshidratación celular provoca por elevadas temperaturas produce el rompimiento de
las paredes y membranas.

3. Describa dos métodos de extracción enzimática químicos

DETERGENTES
Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a
apertura de poros, con estas sustancias la ruptura celular es más suave, los detergentes
rompen la barrera lipídica solubilizando las proteínas e interrumpiendo la interacción
lípido-lípido, lípido-proteína y proteína.
SOLVENTES ORGÁNICOS
El fraccionamiento con solventes orgánicos está basado en las diferencias de solubilidad
que presentan las proteínas en soluciones acuosas de solventes orgánicos como el alcohol,
aldehídos, cetona y éteres, empleados tanto sucesiva como separadamente. Disuelven la
pared celular fundamentalmente por la disolución de lípidos asociados a membranas.

4. Escriba los 6 factores del cual depende la elección del método de extracción
enzimática
 Naturaleza y fuente de la enzima (origen animal, vegetal, microbiana: fúngica o
bacteriana)
 Escala de la operación (laboratorio, planta piloto o industrial)
 Velocidad del método de extracción
 Estabilidad de la enzima
 Pureza requerida
 Costo del proceso.

5. ¿En qué consiste el mecanismo shock osmótico?

Las células se hacen estallar al someterlas a un medio hipotónico, lo cual hace que la
membrana no resista la presión osmótica. Puede ocasionar el daño a las membranas de
algunas organelos. Primero se elimina restos del medio de cultivo, posteriormente se re
suspende en una solución hipertónica (sacarosa 20%). Las células cuando se equilibran,

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se recogen, centrifugan y re suspenden rápidamente en agua a 4°C, al entrar el agua al
interior celular produce ruptura. Se libera un 4-8% de proteína total.

6. ¿En qué consiste el método precipitación por sales?

Altas concentraciones de sales disminuyen la solubilidad de las enzimas, efecto
llamado desplazamiento salino. La concentración de sal en la que una enzima
precipita difiere de una proteína a otra. Por lo tanto, soluciones salinas se puede
usar para fraccionar las proteínas.

7. ¿Cuál es la sal más común utilizada en el proceso de precipitación por sales y

por qué se emplea esta sal?
La sal más comúnmente empleada es el sulfato de amonio debido a su alta
solubilidad, la ausencia de toxicidad para la mayor parte de las enzimas y a su bajo
costo.
8. ¿Qué significa HPLC y para qué sirve?
Significa Cromatografía de líquidos de alta resolución y es la técnica analítica de
separación enzimática más ampliamente utilizada. Consta de una fase móvil la
cuál es un líquido y la fase estacionaria es una columna que puede ser de acero
inoxidable.
9. ¿En qué consiste la electroforesis?
La muestra se deposita en un medio poroso de una mezcla de especies cargadas.
Aplicando un campo eléctrico en los extremos del soporte poroso, las especies se
separan en función de sus cargas y su movilidad en medio iónico. Las proteínas
pequeñas se mueven rápidamente a través del gel, mientras que las proteínas
grandes se quedan en la parte superior, cerca del punto de aplicación de la mezcla.
10. Clasifique los métodos de inmovilización enzimática mediante el uso de un
organigrama

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