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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA


OBJETIVOS:
 Observar la influencia de la temperatura y el
pH sobre una reacción enzimática
 Constatar la especificidad de las enzimas
 Examinar el efecto de los iones metálicos
pesados sobre la actividad de la α-amilasa
 Determinar el valor de Vm y Km para la α-
amilasa
FUNDAMENTO:
Las enzimas son proteínas cuya función es
catalizar las muy diversas reacciones que se llevan
a cabo dentro de los organismos vivos. Su acción
es específica y se afecta por factores tales como la
temperatura y el pH del medio, la concentración de
enzima y de sustrato, la presencia o ausencia de
cofactores y/o inhibidores, etc. En esta práctica se
va a ensayar la acción de varios de los factores
mencionados sobre la α-amilasa, una enzima que
en los seres humanos se encuentra presente en la
saliva y en el páncreas.
La α-amilasa (nombre sistemático: 1,4-glucano-
glucanohidrolasa; código: 3.2.1.1 de la Unión
Internacional de Bioquímica; peso molecular:
45000) hidroliza los enlaces glucosíricos α 1- 4.
Estos enlaces se encuentran presentes en el
almidón.
El almidón es una mezcla de dos polisacáridos:
amilosa y amilopectina. La amilosa con el yodo da
una coloración azul oscura que se comunica a todo
el almidón. Esta propiedad permite seguir la acción
de la α-amilasa sobre el almidón: a medida que
éste se va hidrolizando el color azul va
desapareciendo hasta llegar a un color amarillo
ocre, característico de la solución de yodo cuando
la hidrólisis ha sido total:
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METODOLOGÍA
α-amilasa
Almidón maltosa + otros productos
+ +
R. Lugol R. Lugol
Color azul oscuro color amarillo ocre
Preparación de la amilasa salival:
Se enjuaga la boca dos o tres veces con agua para
eliminar los restos de alimentos. Se miden en una
probeta 60 ml de agua destilada y con ellos se
enjuaga la boca, en varios buches, por espacio de
unos 2 o 3 minutos, cada buche. El liquido
recogido se filtra a través de un algodón Esta
solución, que en adelante se denominara amilasa
salival, será la que se utilice para la realización de
las distintas partes de la práctica, la que debe estar
en frío.
Influencia de la temperatura sobre la actividad
de la amilasa salival
Se rotulan cuatro tubos de ensayo 0, 20, 40, 90. En
cada uno se vierten 1 ml de suspensión de almidón
al 0.5%. El tubo 0 se coloca, durante 10 minutos,
en un baño de hielo; el tubo 20 se deja a
temperatura ambiente; el tubo 40 y el tubo 90 se
colocan respectivamente en un baño de agua a 40
°C y en un baño de agua hirviente, durante 10
minutos, para que el contenido de los tubos
adquiera la temperatura correspondiente. Mientras
tanto se colocan 2 gotas de lugol en varias
concavidades de la placa de porcelana. Al cabo de
los 10 minutos se agrega a cada tubo sin retirarlo
del baño, 0.5 ml de amilasa salival. Se agitan bien
los tubos y se dejan durante 30 segundos a las
condiciones de temperatura anteriormente
señaladas. Al cabo de este tiempo se colocan cinco
gotas del contenido cada tubo en una concavidad
de una placa de porcelana a la que previamente se
le habían adicionado dos gotas del reactivo de

Lugol, y se observa el color producido. La
temperatura óptima será aquella en la cual se
observe más rápidamente el color amarillo ocre. Si
el color permanece azul, se esperan 2 minutos y
luego se repite el procedimiento en la placa de
porcelana.
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Influencia del pH en la actividad enzimática
Rotule cinco tubos de ensayo 3, 5, 6, 7 y 8;
deposítelos en un baño de agua a la temperatura
óptima (obtenida en la parte anterior) y agregue, en
su orden sin retirarlos del baño las sustancias que
se indican a continuación:
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Tubo 3 5 6 7 8

solución

Almidón 0.5% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Amortiguador pH 3.0 2 ml - - - -

Amortiguador pH 5.0 - 2 ml - - -

Amortiguador pH 7.0 - - - 2 ml -

Amortiguador pH 9.0 - - - - 2 ml

Amilasa salival 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5ml

Después de 1 minuto deposite cinco gotas del tubo 3 en una concavidad de la placa de
porcelana en la que previamente había depositado dos gotas del reactivo del Lugol y
observe el color producido. Repita el mismo procedimiento con los demás tubos. El pH
óptimo para la α- amilasa corresponde a aquel tubo donde se obtenga mas rápidamente el
color amarillo ocre. En caso de que no se observe este color en ninguno de los ensayos
repita el procedimiento anterior, con todos los tubos, cada minuto hasta que en alguna
concavidad aparezca el color amarillo ocre. Este será el pH óptimo.

Concentración óptima de enzima

Rotule cuatro tubos de ensayo 1, 2, 3 y 4, deposítelos en un baño de agua a la temperatura

óptima y, sin sacarlos de allí, agregue, en su orden:

Tubo 1 2 3 4

Solución

Almidón 0.5% 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Amortiguador de pH óptimo 2.9 ml 2.7 ml 2.1 ml 1.2 ml

Amilasa salival 0.1 ml 0.3 ml 0.9 ml 1.8 ml

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Realice los mismos ensayos que para
determinar la temperatura y el pH
óptimos. Encuentre la concentración
óptima de enzima.
Efecto de los iones metálicos pesados
sobre la acción de la amilasa
Rotule tres tubos de ensayo amilasa, Hg++
y Pb++, deposítelos en un baño de agua a
la temperatura óptima y agregue en su
orden:

Tubo Amilasa Hg++ Pb++ Cu++

solución

Almidón 0.5% 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml

Amortiguador de pH óptimo 3 ml 2 ml 2 ml 2 ml

HgCl2 0.2% - 1 ml - -

Pb(NO3)2 0.2% - - 1 ml -

Cu(NO3)2 0.2% - - - -

Amilasa salival 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Repita el procedimiento de los casos luego solamente al primer tubo agregue la

anteriores y determine el efecto de los
iones metálicos pesados sobre la amilasa.
Efecto de la concentración de sustrato
Rotule cinco tubos de ensayo 0.25, 0.5,
1.0, 2.0 y 4.0. Deposítelos en un baño de
agua a la temperatura óptima y, agregue
en su orden, almidón y amortiguador.
Deje que estén a la temperatura óptima y
amilasa sin sacarlo del baño maría. Agite
sin sacarlo del agua y al cabo de 30
segundos extraiga 3 gotas de la solución y
haga la prueba con el lugol. Si no hay
cambio a rojo pardo, espere otros 30
segundos y realice el mismo
procedimiento hasta que aparezca el rojo
pardo. Debe tomar el tiempo lo más
exacto posible. Realice el mismo
procedimiento para los demás tubos, uno
por uno.

Tubo 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0

Solución

Almidón 0.5% 0.25 ml 0.5 ml 1.0 ml 2.0 ml 4.0 ml

Amortiguador de pH óptimo 4.25 ml 4.0 ml 3.5 ml 2.5 ml 0.5 ml

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Amilasa salival 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuál fue la temperatura óptima de la amilasa? ¿El pH óptimo? ¿Con cual solución
de amilasa salival fue más rápida la digestión del almidón?
2. ¿Qué efecto tuvieron el mercurio y el plomo sobre la actividad de la α-amilasa?
3. Llene la siguiente tabla:

Volumen de Concentración tiempo, velocidad 1/[ S ] 1/v

Sustrato, ml del sustrato, [ S ] t, min v = [ S ]/ t

0.25 ml

0.5 ml

1.0 ml

2.0 ml

4.0 ml

4. Con base en los datos de la tabla anterior, construya dos graficas:

Gráfica 1: velocidad de reacción, v, en función de la concentración de sustrato, [ S ]

Gráfica 2: 1/v en función de 1/[ S ]. Gráfica de Linneaweaver-Burk.

De las dos graficas deduzca los valores de la velocidad máxima, V m y de la constante de
Michaellis-Menten, Km