PRÁCTICA Nº 1

OBJETIVOS:

1. Determinar la fase exponencial en procariote por método de la cámara de

Neubauer.
2. Determinar la fase exponencial en E. coli por el método espectrofotométrico.

DETERMINACIÓN DE LA FASE EXPONENCIAL EN PROCARIOTE

MARCO TEÓRICO

En biotecnología, el conocimiento de las características de crecimiento de un

microorganismo es esencial para lograr una eficiencia de transformación
reproducible, y para obtener rendimientos repetibles de plásmidos y proteínas
recombinantes. Para conseguir un crecimiento uniforme y equilibrado, el cultivo se
recoge en la fase de crecimiento logarítmico o exponencial, donde la tasa de
crecimiento y la composición de cada célula en la población es relativamente la
misma.
El crecimiento de un microorganismo varía con el medio de cultivo dependiendo del
contenido en nutrientes y de la temperatura y de la aireación durante la incubación.
Es necesario que la agitación sea vigorosa para mantener la suficiente cantidad de
oxígeno disuelto en el medio para soportar el crecimiento. Incluso así, el crecimiento
en un medio mínimo comparado con el conseguido en un medio rico manifiesta un
alargamiento del periodo de duplicación. Esta diferencia se debe al tiempo y la
energía que el microorganismo debe emplear en un medio mínimo para sintetizar
los metabolitos que serían proporcionados directamente por un medio rico
(complejo). Así, el comienzo y la duración de la fase logarítmica es variable y debe
establecerse para cada medio y cada cepa microbiana empleados. La construcción
de una curva de crecimiento que incluya las fases de latencia, logarítmica,
estacionaria y de muerte nos permitirá establecer estos parámetros.
Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo (en un
erlenmeyer en agitación) y se van acumulando productos inhibitorios, la velocidad
de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse al llegar el cultivo a la fase
estacionaria, donde la población se mantiene constante. Conforme se agota la
mayor parte de nutrientes, el número de células que mueren sobrepasa al número
de células que se producen y el cultivo entra en fase de muerte.
La gran mayoría de los experimentos comienzan con el inóculo de un pequeño
volumen de un medio de crecimiento y después el crecimiento de estas células
durante la noche. A la mañana, el crecimiento se habrá detenido y la densidad
celular se encontrará normalmente en torno a las 2-3 x 109 células/ml en medio rico.

Determinación de masa celular por espectrofotometría:

El crecimiento de los cultivos puede seguirse por espectrofotometría. El número de

fotones dispersados es proporcional a la masa de células de la muestra. Sin
embargo, es la geometría de cada espectrofotómetro la que determina cuanta luz
entra en el fotodetector. Por lo tanto, debe construirse para cada espectrofotómetro
una curva de calibración que relacione la concentración celular con la absorbancia.
Esto se hace midiendo la absorbancia de suspensiones de células de diferente
concentración, y determinando la concentración de cada suspensión por recuento
microscópico directo.
Es importante señalar que la absorbancia es una medida de masa celular más que
de número celular. El tamaño de la célula varía con la fase de crecimiento, de modo
que es mejor calibrar el espectrofotómetro con células en crecimiento exponencial
porque son tales células las que se emplean en la mayoría de los experimentos.
Como regla aproximada para la mayoría de células de E. coli, D.O.600 nm = 1.0
para 8 x 108 células/ml.
Se pueden emplear longitudes de onda distintas a 600 nm para determinar la
densidad celular y, de hecho, la sensibilidad aumenta según descienda la longitud
de onda. Se pueden emplear longitudes de onda tan bajas como 400 nm, pero no
con todos los medios enriquecidos.

Determinación del número de células por el método de conteo en cámara de

Neubauer :

El método de elección para la determinación del número total de células de un

cultivo es el recuento microscópico directo. Para células bacterianas, se necesita
una cámara de Neubauer y una ampliación de x1000 a causa del pequeño tamaño
de las bacterias. Este método tiene la ventaja que permite observar directamente la
morfología de las células estudiadas. Las morfologías aberrantes o atípicas podrían
indicar unas condiciones subóptimas de crecimiento o la presencia de un genotipo o
fenotipo alterados.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al microscopio de
campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una
depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3
mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el
área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión
central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que
cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total de x células entre
las cuatro áreas, la concentración en la suspensión celular será:

Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L

y que en el microscopio se ven como una cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de
0.25 milímetros de lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio
invertido de contraste de fases.
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La cámara de recuento (de Neubauer o Burker) consiste en una gruesa capa de
vidrio con unas plataformas centrales que son exactamente 0'1 mm más bajas que
las laterales. En las plataformas centrales existe una cuadrícula (diferente
dependiendo de una u otra cámara.

Los lados de los cuadrados pequeños son, en ambas cámaras, de 0'05 mm. Los
lados de los cuadrados grandes en la cámara de Neubauer son de 0'25 mm. La
altura entre el cubreobjetos y la cámara central es de 0'1 mm.
Normalmente se utiliza la cámara de Neubauer (los cuadrados grandes para el
recuento de leucocitos, y los pequeños para el de hematíes).
Una vez realizado el recuento, los resultados deben expresarse en número de
células por milímetro cúbico.

nº céls./mm3 de sangre = (A/V) x F

Donde:
A = número de células contadas
V = volumen del cuadrado (en mm3)
F = factor de dilución

MATERIALES Y MÉTODOS:

MATERIALES:

Cepas: Top 10, Virna, “Antobacteria”

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Medio de cultivo (Luria – Bertani): Triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 5
g, agua destilada.
Material de laboratorio:

Probeta (1000 ml), pipeta (10 ml), piceta, balón (1000 ml), papel aluminio, mechero
Bunsen, hipoclorito de sodio 2.5%, alcohol, guantes de látex, micropipetas, puntas,
cámara de Neubauer, eppendorfs, propipeteador.
Equipo de laboratorio: Autoclave, cámara de siembra, shaker, espectrofotómetro,
microscopio, refrigerador.

ACTIVIDADES:

Preparación de medio LB: Preparar 1000 ml de medio LB. Pesar 10 g de triptona,

5 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl y enrasar hasta 1000 ml con agua
destilada. Luego verter el medio a un balón de 1000 ml, tapar con papel aluminio y
se autoclavar a 120º C (1 atm de presión) durante 20 minutos. Guardar en el
refrigerador a 4º C.

Inoculación de cepas bacterianas: Elegir cuatro cepas, del cepario del

laboratorio. De cada una de las cepas tomar 500 ul e inocular en 10 ml de medio LB.
Dejar crecer por 24 horas a 37º C con agitación constante (60 rpm). Transcurridas
las 24 horas, se toma 1 ml de medio de cada erlenmeyer e inocular en 24 ml de
medio LB. Dejar crecer nuevamente por 24 horas a 37º C con agitación constante
(90 rpm).

Determinación de la curva de crecimiento: Para determinar la curva de

crecimiento de cada una de las cepas, tomar muestras para realizar la medición
espectofotométrica y el recuento celular en cámara de Neubauer. Las muestras se
tomaran a tiempos: 0, 1, 2, 4, 7, 16, 24 horas.

Medición de la densidad óptica (D.O.): Realizar el análisis del espectro de

absorción usando como blanco medio LB y como muestra la tomada a las 7 horas
(correspondiente a un tiempo intermedio) determinar la longitud de onda óptima
para realizar la medición. Luego medir la absorbancia de las muestras.

Determinación del número de células en cámara de Neubauer: Tomar

aproximadamente 10 ul de las muestras y depositar una gota pequeña en la
superficie pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del cubre, evitando
que el fluido caiga en los surcos.
Colocar la cámara en la platina del microscopio y enfocar el enrejado con el objetivo
de menor aumento. Realizar el conteo en el cuadrado central; el cuadrado central
que contiene 25 cuadrados, cada uno rodeado por tres líneas que están
representadas en la figura con líneas más oscuras. Cada uno de los 25
cuadraditos a su vez contiene 16 cuadraditos). Se contaran cinco cuadrados

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 X X

X X

Utilizar la siguiente fórmula para calcular el número de células por mililitro:

cel / ml  N º células 510000D

donde:

Nº células : Número de células contadas en la cámara.

5 : Número de cuadrados contados al interior del cuadrado central.
10000: Factor para obtener el número de células por mililitro.
D : Factor de dilución.

Gráfica las curvas de crecimiento: Para realizar las curvas de crecimiento tomar
los datos de densidad óptica y de recuento celular. Las gráficas realizarlas en Excel
con los siguientes criterios: Tiempo vs. Densidad óptica (en escala normal y en
escala logarítmica), Tiempo vs. Recuento celular (en escala normal y en escala
logarítmica) y Densidad óptica vs. Recuento celular.

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CUESTIONARIO

¿Cuáles son los factores que influyen en el crecimiento de bacterias en un medio?

¿Y porqué estos factores influyen?

¿Por qué es necesario realizar la lectura de OD en el medio sin bacterias y en las

bacterias con un tiempo de crecimiento de tiempo medio del crecimiento
bacteriano?

¿De que sirve el conocimiento de la elaboración de la curva de crecimiento en la

Ingeniería Genética?

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 PRÁCTICA Nº 2

OBJETIVOS

1. Determinación de la fase logaritmia por el método espectrofotométrico en una

célula eucariótica.
2. Determinación de la fase logarítmica por el método de conteo en Cámara de
Neubauer en una célula eucariotica.

DETERMINACIÓN DE LA FASE EXPONENCIAL EN EUCARIONTES

MARCO TEÓRICO:

Gram parte de los principios aplicados al cultivo de bacterias son extrapolables a los
cultivos celulares de los eucariotas. De hecho, bastantes técnicas de trabajo con
bacterias han sido aplicadas al cultivo de eucariotas. Sin embargo, es frecuente que
las células eucariotas pierdan parte de sus propiedades cuando son extraídas de
los órganos que se encuentran y que su proliferación requiera la utilización de
condiciones especiales, incluyendo los cultivos histotípicos.
Las poblaciones de células, tanto procariotas como eucariotas, presentan un tipo de
crecimiento característico llamado crecimiento exponencial. Este tipo de
crecimiento esta muy bien estudiado y modelizado, y en el pueden diferenciarse
varias fases: latencia, exponencial, estacionaria y de muerte.

Curva de crecimiento típica de una población de células. Representación

semilogarítmica de la concentración de los microorganismos frente al tiempo. 1 fase
de latencia, 2 fase exponencial, 3 fase estacionaria, 4 fase de muerte.
La fase exponencial es aquella en la que los microorganismos se están dividiendo, y
por tanto la población está creciendo. La velocidad de crecimiento va a depender de
muchos factores, tanto ambientales (temperatura, pH, medio de cultivo) como del
propio organismo. En la fase de latencia, las células están adaptándose al medio en
el que se les ha inoculado, bien porque el medio de cultivo es distinto al de
procedencia, bien por que se hallen en una fase de crecimiento distinta a la
exponencial. Por tanto, cuando el inoculo se realiza a un mismo medio de cultivo
desde una población en crecimiento exponencial, esta fase desaparece y se
continúa por la fase exponencial. La fase estacionaria se alcanza cuando el medio
de cultivo está agotado, y por tanto, la población de células no puede crecer, o bien
por la acumulación de algún producto de desecho (metabólito) que inhibe el
crecimiento. En esta fase, hay un equilibrio entre los organismos que crecen y los
que mueren, manteniéndose la población estable. Si la fase estacionaria continúa
en el tiempo se llega a la fase de muerte, en la que la población disminuye al
romperse el equilibrio de crecimiento y muerte.
Hay cuatro estados básicos por los que pasan las levaduras. Cuando recibimos un
cultivo de Levaduras de una fuente segura, las células de levadura se encuentran
generalmente en estado latente. Cuando las introducimos o inoculamos en un
medio estéril, las levaduras comienzan a “chequear” o verificar su entorno, y entran
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en un estado de “despertar”. Si encuentran el nuevo entorno favorable, entran en el
estado de respiración aeróbica. En éste estado las Levaduras requieren los
siguientes nutrientes: Oxígeno, Nitrógeno, Azúcares, Iones, Proteínas y Lípidos.
La elaboración de medios de cultivo para levadura requiere proporcionar los
elementos antes citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar
en forma de carbono orgánico para los heterótrofos y como CO2 para los autótrofos,
el N en forma de NH4, de NO3 ó de NO2 o en forma de aminoácidos a los que se
pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO 4, el S procede de
aminoácidos sulfurados o de SO4, etc. Además, en ciertos casos, es necesario
añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados
tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan
(Saccharomyces cerevisiae) la fórmula elemental más concreta es:

C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056

Esta composición puede variar ligeramente en función de las condiciones de cultivo

o de fase de crecimiento. El conocimiento de la fórmula elemental del
microorganismo que se cultiva facilita la formulación del medio de cultivo más
adecuado para el mismo

MATERIALES Y MÉTODOS:

MATERIALES:

Cepas: Sacharomyces .
Medio de cultivo YPD (Sherman et ál. 1985), cuya composición es la siguiente

Reactivos g/l
Extracto de levadura 10 g/l
Proteosa peptona 20 g/l
Glucosa 20g/l

Material de laboratorio: Probeta (1000 ml), pipeta (10 ml), piceta, balón (1000 ml),
papel aluminio, mechero Bunsen, hipoclorito de sodio 2.5%, alcohol, guantes de
látex, micropipetas, puntas, cámara de Neubauer, eppendorfs, propipeteador.
Equipo de laboratorio: Autoclave, cámara de siembra, shaker, espectrofotómetro,
microscopio, refrigerador.

ACTIVIDADES

Preparación de medio YPD: Preparar 1000 ml de medio YPD. Pesando 10 g de

Extracto de levadura, 20 g de Proteosa peptona y 20 g de Glucosa y enrasar hasta
1000 ml con agua destilada. Luego el medio se vierte a un balón de 1000 ml, se tapa

8
con papel aluminio y se autoclava a 120º C (1 atm de presión) durante 20 minutos.
Se guarda en el refrigerador a 4º C.

Inoculación de cepas de levaduras: Elegir una cepa de levadura, tomar 500 ul e

inocular en 10 ml de medio YPD contenido en un matraz. Dejar crecer por 24 horas
a 37º C con agitación constante (60 rpm). Transcurridas las 24 horas, se toma 1 ml
y se inocula en 24 ml de medio YPD a 37º C con agitación constante (90 rpm).

Determinación de la curva de crecimiento: Para determinar la curva de

crecimiento de cada una de las cepas, tomar muestras para realizar la medición
espectofotométrica y el recuento celular en cámara de Neubauer. Las muestras
fueron tomadas a tiempos: 0, 1, 2, 4, 7, 16, 24 horas.

Medición de la densidad óptica (D.O.): Se realiza el análisis del espectro de

absorción usando como blanco medio YPD y como muestra a la tomada a las 7
horas (correspondiente a un tiempo intermedio) determinar la longitud de onda
óptima para realizar la medición. Luego se midió la absorbancia de las muestras.
Determinación del número de células en cámara de Neubauer: Tomar
aproximadamente 10 ul de las muestras y depositar una gota pequeña en la
superficie pulida de la cámara de recuento cerca del extremo del cubre, evitando
que el fluido caiga en los surcos.
Colocar la cámara en la platina del microscopio y enfocar el enrejado con el objetivo
de menor aumento. Realizar el conteo en los cuadrados de 16 cuadritos. Se
contaron cuatro cuadrados (indicados con una “L”).
Normalmente se utiliza la cámara de Neubauer (los cuadrados grandes para el
recuento de leucocitos, y los pequeños para el de hematíes).

Una vez realizado el recuento, los resultados deben expresarse en número de

células por milímetro cúbico.

nº céls./mm3 de sangre = (A/V) x F

Donde:

9
 A = número de células contadas
V = volumen del cuadrado (en mm3)
F = factor de dilución

Determinación de las curvas de crecimiento: Para realizar las curvas de

crecimiento tomar los datos de densidad óptica y de recuento celular. Las gráficas
realizarlas en Excel con los siguientes criterios: Tiempo vs. Densidad óptica (en
escala normal y en escala logarítmica), Tiempo vs. Recuento celular (en escala
normal y en escala logarítmica) y Densidad óptica vs. Recuento celular.

CUESTIONARIO

¿Cuáles son los factores que influyen en el crecimiento de levaduras en un medio?

¿Y porqué estos factores influyen?

¿Por qué es necesario realizar la lectura de OD en el medio sin levaduras y con

levaduras con un tiempo de crecimiento de tiempo medio del crecimiento de
levaduras?

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¿De que sirve el conocimiento de elaboración de la curva de crecimiento en la
Ingeniería Genética?

BIBLIOGRÁFIA:

Bothwell AL, Yancopoulus G.D., Frederick W.A. Methods for Cloning and Analysis of
Eukaryotic Genes. 1990. Boston: Jones and Bartlett Publishers, 1990.

Becker J.M., Caldwell G.A., Zachgo G.A. Biotechnology. A Laboratory Course 2a

ed. 1996. Editorial Acribia S.A., Zaragoza (España).

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