.1. Preparación del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Se preparó una solución madre del cultivo de levadura (Sacharomyces cerevisiae),

compuesta de 3g de levadura y 200ml de agua.
La concentración en partes por millón (ppm) de esta solución es:

2. Preparación de las soluciones A

Se prepararon 6 diluciones a partir de la solución madre, las cuales tenían la
siguiente composición.

Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
ml de agua 0 1 3 5 7 9
ml de cultivo 10 9 7 5 3 1

Para hallar la concentración de las soluciones en ppm se utiliza la ecuación:

C1 V1 = C2 V2
C2 = C1 V1 / V2
Donde C2 es la concentración de la solución A en ppm.

Solución 1A
V1 = 10ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (10ml×15000ppm)/10ml = 15000ppm
Solución 2A
V1 = 9ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (9ml×15000ppm)/10ml = 13500ppm
Solución 3A
V1 = 7ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (7ml×15000ppm)/10ml = 10500ppm
Solución 4A
 V1 = 5ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (5ml×15000ppm)/10ml = 7500ppm
Solución 5A
V1 = 3ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (3ml×15000ppm)/10ml = 4500ppm
Solución 6A
V1 = 1ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml  C2 = (1ml×15000ppm)/10ml = 1500ppm

Los valores hallados matemáticamente para las concentraciones de cada solución

A se encuentran expresados en la tabla 2.
Tabla 1. Concentración de de las soluciones A (ppm)
Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Concentración en 15000 13500 10500 7500 4500 1500
ppm

5.3. Preparación de las soluciones B

Se prepararon 6 diluciones a partir de las soluciones A a las cuales deben ser de
la concentración expresada en la tabla 3.
Tabla 3. Composición de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentración en ppm 500 400 300 200 100 0
A partir de 1A 2A 3A 4A 5A 6A

Para hallar el volumen necesario de las soluciones A para llegar a la

concentración pedida se necesita la siguiente ecuación:

C1 V1 = C2 V2
V1 = C2 V2 / C1
Donde V1 es el volumen en ml de la solución A.
Solución 1B a partir de 1A
C2 = 500ppm V2 = 10ml
C1 = 15000ppm  V1 = (10ml×500ppm)/15000ppm  0.33ml
Solución 2B a partir de 2A
C2 = 400ppm V2 = 10ml
C1 = 13500ppm  V1 = (10ml×400ppm)/13500ppm  0.29ml
Solución 3B a partir de 3A
C2 = 300ppm V2 = 10ml
C1 = 10500ppm  V1 = (10ml×300ppm)/10500ppm  0.26ml
Solución 4B a partir de 4A
C2 = 200ppm V2 = 10ml
C1 = 7500ppm  V1 = (10ml×200ppm)/7500ppm  0.26ml
Solución 5B a partir de 5A
C2 = 100ppm V2 = 10ml
C1 = 4500ppm  V1 = (10ml×4500ppm)/4500ppm  0.22ml
Solución 6B a partir de 6A
C2 = 0ppm V2 = 10ml
C1 = 0ppm  V1 = 0ml

Los valores hallados matemáticamente para los mililitros de las soluciones A

necesarios para preparar las soluciones B se encuentran expresados en la tabla
4.
Tabla 4. Composición de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Volumen de A en ml 0.33 0.29 0.28 0.26 0.22 0
4. Medición del crecimiento microbiano por conteo directo en cámara de
Neubauer

Para la medición del crecimiento microbiano por conteo directo se tomaron las
soluciones B, depositando la muestra en una cámara de Neubauer y observando
en el microscopio con un objetivo de 40x.

La cámara de Neubauer posee una especie de rejilla, que en su cuadro central

(ver Anexo C) posee 25 cuadros, los que a su vez poseen 16 cuadritos, se deben
contar las células que se encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los de las
cuatro esquinas y el del centro).

El área del cuadro central marcado con un círculo es de 0.01 mm 2 y una

profundidad de 0.1mm. Entonces el área de cada uno de los 25 cuadros es de:

Ac= A / 25
Ac = 0.01 mm2 / 25 = 0.0004 mm2

El volumen de los cuadros que se cuentan es igual a la suma de sus áreas

multiplicado por su profundidad.

V = 5Ac  Prof.
V = 5 (0.0004 mm2)  0.1mm = 0.0002 mm3
Con este volumen y el número de células Ñ 5 cuadros, se puede hallar la
concentración de células en células/ml.

El número de células contadas en el experimento para cada una de las soluciones

B se expresa en la tabla 5.
Tabla 5. Número de células contadas en el experimento para las solucion B

Nomencl.
Cuadro 1B 2B 3B 4B 5B 6B
1 2 2 0 0 1 0
2 3 3 0 0 0 0
3 2 1 3 1 1 0
4 0 1 2 2 0 1
5 3 5 1 2 2 0
Total 10 10 6 5 4 1

Para hallar la concentración de células se divide el total de células de cada

solución B entre el volumen de los 5 cuadros.

[Células] = # células / 0.0002 ml.

 [1B] = 10 cel / 0.0002ml = 50000 cel/ml

 [2B] = 10 cel / 0.0002ml = 50000 cel/ml

 [3B] = 6 cel / 0.0002ml = 30000 cel/ml

 [4B] = 5 cel / 0.0002ml = 25000 cel/ml

 [5B] = 4 cel / 0.0002ml = 20000 cel/ml

 [6B] = 1 cel / 0.0002ml = 5000 cel/ml

Las concentraciones de las soluciones B obtenidas se encuentran en las siguiente

tabla.

Tabla 6. Concentraciones de las soluciones B en cel/ml

Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentración cel/ml 50000 50000 30000 25000 20000 5000
5.5. Medición del crecimiento microbiano por densidad óptica

Se realizó una lectura de absorbancia a 540 nm en el espectrofotómetro y arrojó

los siguientes resultados:

Tabla 7. Concentraciones de las soluciones B en absorbancia

Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B (Blanco)
Concentración (A) 0.253 0.238 0.138 0.108 0.099 0

5.6. Medición del crecimiento microbiano por peso seco celular

Se tomó el peso de los tubos de ensayo vacíos, se centrifugó un volumen

determinado de las soluciones A. Luego se separó el sobrenadante y se evaporó a
90ºC para eliminar el agua restante, los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tabla 8. Datos para las soluciones A en la determinación del peso seco

celular
Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Volumen de A 9,50 9,58 9,60 9,64 9,72 —
Peso de tubos (vacíos) 12,49 12,49 12,75 12,57 12,66 12,43
Peso de seco celular 0.07 0.07 0.05 0,0 0,02 0,01

Para hallar la concentración en g de células por mililitro se divide el peso seco

celular obtenido y se divide por los mililitros iniciales de la solución antes de
extraer el líquido.

[Células] = Peso seco celular / ml de Sln.

 [1A] = 0.5g / 9.33ml = 0.054g/ml

 [2A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
 [3A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
 [4A] = 0.2g/ 9.33 ml = 0.021g/ml
 [5A] = 0.1g / 9.33ml = 0.010g/ml
Las concentraciones de las soluciones A obtenidas se encuentran en las siguiente
tabla.

6. ANALISIS DE RESULTADOS

6.1. Preparación del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Cultivo de levadura comercial (Sacharomyces cerevisiae) diluido en agua en una
concentración de 15000 ppm de color amarillento (ver Anexo C).

6.2. Preparación de las soluciones A

Se realizaron a partir de la solución madre de levadura de diferentes
concentraciones para un posterior estudio en la determinación del peso seco
celular, a medida que disminuía la concentración en ppm se tornaba más
transparente.

6.3. Preparación de las soluciones B

Las soluciones B fueron diluciones de las soluciones A en agua, estas soluciones
brindan la oportunidad de estudiar las células en el microscopio por la facilidad de
conteo y por tener una menor densidad óptica. Por esto fueron utilizadas para
realizar el procedimiento de recuento directo y de densidad óptica.

6.4. Medición del crecimiento microbiano por conteo directo en cámara de

Neubauer
Para este método se utilizaron las soluciones B, ya que, por ser diluciones, tenían
una menor concentración, por lo tanto un menor número de células y así poder
contarse más fácilmente.

Se utilizó la cámara de Neubauer la cual nos proporcionaba una información

exacta sobre la cantidad de células que se encontraban en un volumen conocido.
Luego de montar la cámara, y ubicarse en el cuadro central se observaron células
de color amarillo brillante en forma esférica. Solo se contaron las células que se
podían diferenciar ya que algunas se encontraban muy juntas y no se podía
determinar el numero exacto de células.

6.5. Medición del crecimiento microbiano por densidad óptica

Para la medición de la densidad óptica se utilizó el espectrofotómetro arrojando
resultados que permitieron afirmar que la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración en ppm de las células en solución.

6.6. Medición del crecimiento microbiano por peso seco celular

En la medición del peso seco celular se observó que a medida que la solución
tenía una menor concentración, menor era el peso, lo que da a entender que el
peso seco celular de una solución de células es directamente a su concentración.