Instituto Tecnológico de Acapulco

Prácticas de laboratorio

Ingeniería Bioquímica
Materia
Microbiología General
Profesor
M.C. Miguel Ángel Díaz Alday
Diseño experimental
“Desinfectantes y Antibiogramas”
Alumno
Téllez Reza Guadalupe
Número de control
15320628

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Prácticas de laboratorio

Índice
Introducción.......................................................................................................................................3
Marco teórico.....................................................................................................................................4
Desinfectantes................................................................................................................................4
Antibiograma..................................................................................................................................9
Objetivo............................................................................................................................................13
Planteamiento del problema............................................................................................................13
Hipótesis..........................................................................................................................................13
Material, equipo, reactivo y muestra...............................................................................................14
Procedimiento..................................................................................................................................15
Referencias Bibliográficas.................................................................................................................16

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Introducción
Desde mediados del siglo pasado, se han utilizado sustancias químicas aplicadas en la piel,
con el fin de evitar las infecciones. Semmelweis (1847), introdujo la práctica del lavado de
las manos con compuestos clorinados. Lister, años después, amplió el uso de soluciones
fenólicas tanto en las manos como en la piel de los pacientes y en la ropa del instrumental
usado. Estos conceptos basados inicialmente en la observación y posteriormente en los
conceptos microbiológicos, lograron un impacto importante en la prevención de
infecciones intrahospitalarias.
A pesar del amplio uso en la actualidad de los antimicrobianos, no se ha eliminado la
práctica del uso de los antisépticos; al contrario se han perfeccionado las fórmulas de
aquellas sustancias químicas como el Yodo y otras más recientes como la Clorhexidina.
Los antisépticos y desinfectantes están destinados a:

 Prevenir las infecciones intra hospitalarias (IIH).

 Disminuir el impacto económico de las IIH por el uso de productos de alto costo.
 Prevenir efectos adversos.
La eliminación de microorganismos desde una superficie animada o inanimada puede ser
por:

 Arrastre mecánico:
La eliminación de los microorganismos junto con grasas naturales, suciedad y células
descamativas, por medio del uso de agua, jabón y fricción.

 Sustancias químicas:
 Por medio del uso de antisépticos y desinfectantes.
 Esterilización:
 Por medios físicos o químicos.
[ CITATION Uni18 \l 2058 ]

Los desinfectantes son sustancias que se emplean para destruir los microorganismos o
inhibir su desarrollo, y que ejercen su acción sobre una superficie inerte u objeto
inanimado. Los antisépticos son sustancias que se aplican sobre tejidos con vida, con el
objeto de matar o impedir el desarrollo de los microorganismos. Otra diferencia entre
antisépticos y desinfectantes es que los primeros son menos potentes.
[ CITATION Els18 \l 2058 ]

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Marco teórico
Desinfectantes
Son agentes (sobre todo químicos)
antimicrobianos capaces de matar los
microorganismos patógenos (infecciosos) de un
material. Pueden (y en muchos casos suelen)
presentar efectos tóxicos sobre tejidos vivos, por
lo que se suelen emplear sólo sobre materiales
inertes, suelen emplearse sobre objetos
inanimados.
[ CITATION Enr98 \l 2058 ]

Un desinfectante no esteriliza necesariamente un objeto, ya que en este pueden

permanecer esporas y algunos microorganismos viables. Con este sistema, la población
microbiana se reduce a niveles seguros según las normas de salud pública. De esta
manera, los objetos inanimados se limpian y resultan parcialmente desinfectados; por
ejemplo, los productos de saneamiento se emplean en restaurantes para limpiar utensilios
de alimentación, como el cloro por mencionar alguno. Se puede emplear un sufijo que
defina el efecto del agente antimicrobiano. Cuando la gente destruye organismos, se dice
que tiene un efecto “-cida”, que en latín quiere decir “destruir”. Un desinfectante o
antiséptico puede ser particularmente eficaz contra un grupo específico, en cuyo caso se
denominaría de la siguiente manera:

 Bactericida
 Fungicida
 Algicida
 Virucida
[ CITATION Pre1 \l 2058 ]

Factores que afectan la potencia de un desinfectante

 Concentración del agente y tiempo de actuación
La concentración para obtener un determinado efecto, así como el rango de
concentraciones en que se puede demostrar un determinado efecto, dependen de:

 tipo químico del desinfectante,

 tipo de microorganismos a eliminar,
 método de ensayo del efecto.

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Existe una estrecha relación entre la concentración del agente y el tiempo necesario para
matar una determinada fracción de la población bacteriana, según la siguiente expresión:
Cn·D t = K,
Donde C es la concentración del agente, n es el coeficiente de dilución (una constante), y t
es el tiempo de actuación.
Esta ecuación nos dice qué relación existe entre la variación de la concentración del agente
y el tiempo para matar una fracción de la población microbiana.
Por ejemplo:
Los fenoles poseen un coeficiente de dilución n=5 ó 6; ello implica que aun pequeños
cambios en la concentración provocan cambios muy acentuados en el tiempo para lograr
un mismo efecto: así, si reducimos la concentración de fenol desde un valor dado a su
mitad, necesitamos emplear 64 veces más de tiempo para conseguir matar una misma
proporción de bacterias.
En cambio, los hipocloritos (constituyentes de las lejías) tienen coeficiente n=1, lo que se
refleja en que pequeños cambios en la concentración requieren pequeños cambios en el
tiempo de aplicación.
Finalmente, y refiriéndonos al tiempo, no todas las bacterias mueren al mismo tiempo, ni
siquiera cuando se aplica un exceso del agente (repásense los gráficos anteriores).

 pH
El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la
bacteria como al grado de ionización del agente. En
general, las formas ionizadas de los agentes disociables
pasan mejor a través de las membranas biológicas, y por
lo tanto son más efectivos.
los agentes aniónicos suelen ser más efectivos a
pH ácidos;
los agentes catiónicos muestran más eficacia a pH alcalinos.

 Temperatura
Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de
los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10 grados
supone duplicar la tasa de muerte. Pero con el fenol, la subida de 10
grados representa multiplicar por 5 o por 8 la eficacia.

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 Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la población
microbiana
 Según la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos
mejor que otras bacterias;
 Según la fase de cultivo;
 Dependiendo de la presencia de cápsulas o de esporas (suelen conferir más
resistencia);
 Número de microorganismos iniciales.
 Presencia de materiales extraños
La existencia de materia orgánica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta
negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los hipocloritos)
y de tipo desnaturalizante de proteínas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos
inactivos en cuanto a su poder desinfectante y/o esterilizante.
Los principales mecanismos por los que se pierde actividad son:

 adsorción (o sea, absorción superficial) del desinfectante a coloides de proteínas;

 formación de complejos inertes o poco activos;
 unión de grupos activos del desinfectante a proteínas extrañas.
Ejemplos:

 los agentes mercuriales se inhiben por sustancias que lleven grupos sulfhidrilo (-
SH).
 las sales cuaternarias de amonio se inhiben en presencia de jabones y lípidos.
Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este
factor, determinando previamente el gasto de materia orgánica inerte, o calculando la
potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgánica.

2.2 Determinación de la potencia de un desinfectante

La determinación de la actividad desinfectante de un determinado agente es necesaria
para conocer su posible eficacia. El método primario que se viene empleando desde hace
muchos años es comparar la potencia del compuesto a ensayar con la de un desinfectante-
tipo o estándar, que por motivos históricos es el fenol.

 Coeficiente fenol o coeficiente fenólico

Consiste en la siguiente relación:

 máxima dilución del desinfectante que mata a un microorganismo en 10 min, pero

no en 5'

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 máxima dilución del fenol que mata a ese microorganismo en 10 min, pero no en 5
min.
En los EEUU, la Administración Federal de Alimentos y Medicamentos (F.D.A.= Food and
Drug Administration) emplea un test oficial para desinfectantes en condiciones
normalizadas, usando una serie de cepas bacterianas concretas, cuya susceptibilidad al
fenol se conoce exactamente:

 una cepa concreta de Salmonella typhimurium

 una cepa de Staphylococcus aureus
 una cepa de Pseudomonas aeruginosa
El método consiste, en esencia, en lo siguiente:
1. un cultivo de una de estas cepas se diluye 10 veces (1/10) en sucesivas diluciones
del desinfectante problema, y se dejan a 20 minutos;
2. de cada una de las diluciones se siembran alícuotas, a los 5 y a los 10 minutos, en
placas de Petri provista con un medio de cultivo adecuado;
3. se determina el coeficiente fenol según la fórmula que hemos expuesto;
4. una vez determinado, se recomienda usar concentraciones 5 veces superiores a las
indicadas por el coeficiente fenol.

 Limitaciones de este método:

El coeficiente fenol sólo es indicativo cuantitativamente en desinfectantes químicamente
similares al fenol, y que tengan coeficientes de dilución (n) parecidos.
Aun cuando conozcamos el coeficiente fenol de un compuesto, su valor indicativo se limita
a las diluciones que se hayan empleado en la determinación.
Hay que atender a las condiciones de valoración, ya que como dijimos antes, la presencia
de materia orgánica supone una merma del poder real de desinfección.
Para solucionar algunos de estos inconvenientes se han puesto a punto otros métodos de
valoración:

 Prueba de la concentración equivalente

Consiste en determinar la concentración del desinfectante a ensayar que ejerce el mismo
efecto sobre la bacteria de referencia que otra concentración de un desinfectante-tipo
(estándar).

 Determinación de la toxicidad del desinfectante

Como se comentó anteriormente, no todos los agentes esterilizantes son aptos como
desinfectantes de tejidos, ya que pueden presentar efectos tóxicos. Por ello, siempre que

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se intenta introducir el uso de un nuevo compuesto desinfectante, hay que evaluar su
potencial tóxico, mediante el llamado índice de toxicidad, que es el cociente entre el poder
desinfectante y el poder tóxico

Tipos de desinfectantes

Se suelen clasificar de acuerdo con su mecanismo de acción:

A) Agentes que dañan la membrana

1) Detergentes

 catiónicos
 aniónicos
 no iónicos
2) Compuestos fenólicos

 fenol
 cresoles
 difenilos halogenados
 alquilésteres del para-hidroxibenzoico
 aceites esenciales de plantas
3) Alcoholes
I. etanol
II. b) isopropanol
B) Agentes desnaturalizadores de proteínas
 Acidos y bases fuertes
 Acidos orgánicos no disociables
C) Agentes modificadores de grupos funcionales

1) Metales pesados

 mercuriales
 compuestos de plata
 compuestos de cobre
2) Agentes oxidantes

 halógenos
 agua oxigenada
 permanganato potásico

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 ácido peracético

3) Colorantes

 derivados de la anilina
 derivados de la acridina (flavinas)
4) Agentes alquilantes

 Formaldehido
 Glutaraldehido
 Óxido de etileno
 ß-propionil-lactona
[ CITATION Enr98 \l 2058 ]

Antibiograma
El antibiograma es la prueba microbiológica que
se realiza para determinar la susceptibilidad
(sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un
grupo de antibióticos. Las técnicas de
antibiograma son las utilizadas en el laboratorio
de microbiología para estudiar la actividad de los
antimicrobianos frente a los microorganismos
responsables de las infecciones.
En el manejo clínico de la enfermedad infecciosa es indispensable la identificación del
agente causal con el objeto de hacer un control terapéutico, en lo posible, específico.
Tratándose de entidades de origen bacteriano, este concepto es aún más estricto, toda vez
que el médico cuenta con gran cantidad de agentes antimicrobianos de los cuales debe
seleccionar aquéllos que además de su fácil administración, buena penetración y baja
toxicidad sean realmente activos contra el microorganismo causal.
Estas consideraciones implican que el médico, además del buen conocimiento y comando
de los aspectos clínicos, conozca en profundidad los antimicrobianos y su farmacología,
ordene el aislamiento e identificación del agente etiológico y su sensibilidad frente a
dichos antimicrobianos cuando ello sea necesario; esto permitirá establecer un manejo
más confiable evitando su uso indiscriminado y la posibilidad de seleccionar cepas
bacterianas resistentes, peligro cada vez más creciente como lo destacan investigadores de
la genética bacteriana en reciente declaración mundial. Para que los estudios de
sensibilidad de los microorganismos a los antibióticos tengan aplicación y validez clínica, es
necesario que los procedimientos de laboratorio que la investigan sean confiables. La

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experiencia mundial en el campo demuestra que es necesario una normalización de su
metodología. El presente trabajo, tiene por objeto dar las directrices para la correcta
realización e interpretación del antibiograma de disco que constituye el sistema más
comúnmente utilizado para microorganismos de crecimiento rápido. El seguimiento
estricto de estas directrices asegura al laboratorio la realización correcta del antibiograma
y al médico un resultado confiable para el manejo de su paciente.
La prueba de sensibilidad utilizando el procedimiento del disco es una modificación de la
técnica descrita por Bauer, Kirby, Sherris y Turk; es la técnica que se recomienda para los
laboratorios clínicos. La prueba es rápida, práctica y reproducible. Los procedimientos de
diluciones en agar o diluciones en caldo para determinar la concentración inhibitoria
mínima (CIM) de los antimicrobianos son también procedimientos satisfactorios.
[ CITATION MIG94 \l 2058 ]

¿Por qué realizar un antibiograma?

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana
que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto,
la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones
terapéuticas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un centro
de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la antibioterapia
empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse
ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención en los
hospitales.
Hay pues un doble interés: Terapéutico y epidemiológico.
¿Cuándo realizar un antibiograma?
Siempre que una toma bacteriológica de finalidad diagnóstica haya permitido el
aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infección.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboración entre el bacteriólogo y el clínico.
En efecto, en ciertas circunstancias, el microbiólogo no podrá determinar con certeza que
el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clínicos que le aporta el
médico. Por ejemplo, una bacteria no patógena puede ser responsable de la infección de
un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del organismo. La presencia de
signos clínicos puede ser también determinante para la realización de un antibiograma
(por ejemplo: la infección urinaria con un número reducido de gérmenes).

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Sensibilidad bacteriana a los antibióticos

La determinación de la Concentración Inhibidora
Mínima (CIM) es la base de la medida de la
sensibìlidad de una bacteria a un determinado
antibiótico. La CIM se define como la menor
concentración de una gama de diluciones de
antibiótico que provoca una inhibición de cualquier
crecimiento bacteriano visible. Es el valor
fundamental de referencia que permite establecer
una escala de actividad del antibiótico frente a
diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de
manera semicuantitativa, las CIM (métodos manuales y métodos automatizados o
semiautomatizados). Estos diferentes métodos de rutina permiten categorizar una cierta
cepa bacteriana en función de su sensibilidad frente al antibiótico probado. Esta cepa se
denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibiótìco.
Para un determinado antibiótico, una cepa bacteriana es, según la NCCLS:
Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un
tratamiento a la dosis habitual.
Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
Intermedia, cuando el éxito terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
terapéutico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posología).
Ciertas moléculas son representativas de un grupo de antibióticos. Los resultados (S, I, R)
obtenidos con estas moléculas pueden ser ampliados a los antibióticos del grupo, que en
ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya
y las restantes cefalosporinas de 1ª generación que no es necesario probar, ya que el
resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina).
Este hecho permite ensayar un número reducido de antibióticos, sin limitar por ello las
posibilidades terapéuticas.

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Interpretación de un Antibiograma
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan débilmente in vitro, cuando se inscriben en
el DNA bacteriano. Su expresión en el organismo, en donde las condiciones en cuanto a
medios son diferentes, expondría al riesgo de fracaso terapéutico. Para evitar esto, el
antibiograma debe ser interpretado de manera global a fin de descubrir, a través de la
comparación de las respuestas para cada antibiótico, un mecanismo de resistencia incluso
débilmente expresado. Así, gracias a la interpretación, una cepa que aparece como
falsamente sensible será categorizada como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella
pneumoniae productora de BLSE puede aparecer sensible in vitro a las cefalosporìnas de
3" generación. El resultado de Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya
que la utilización de estos antibióticos correría el riesgo de provocar un fracaso
terapéutico).

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Objetivo
General

 Determinar la sensibilidad bacteriana ante discos de antibióticos mediante la

técnica de antibiograma.
Específicos

 Detectar el mecanismo o el gen de resistencia en minutos u horas.

 Determinar la probabilidad de que un agente antimicrobiano o antifúngico
determinado sea capaz de contrarrestar el crecimiento bacteriano o fúngico que
ocasiona la infección.

Planteamiento del problema

Después de obtenerse un resultado positivo a un cultivo de bacterias o de hongos; si se
tiene una infección y se han aislado en un cultivo uno o varios tipos de bacterias u hongos,
a partir de una muestra obtenida del lugar en el que sospecha que se ubica la infección;
cuando una infección no responde al tratamiento.

Hipótesis
Se crea un medio de cultivo apropiado para el crecimiento de microorganismos, Gram – y Gram +,
donde, en algunas áreas de siembra por estriado, el desarrollo de cultivo se ve inhibido debido a la
presencia de algunos antibióticos y desinfectantes y el halo de rechazo.

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Material, equipo, reactivo y muestra
Material Equipo Reactivo Muestra
2 Tubos de ensaye Balanza Analítica Agar Antibiótico 3 Cepa gram
13x100 positiva
Mechero de bunsen Autoclave 3 Cepa gram
negativa
Asa bacteriológica Incubadora
Gradilla
Guantes
Cubreboca
Red de cabello
Probeta 200 mL
Pipeta 10 mL
Agua destilada
Matras Erlenmeyer
250 mL
Algodón
Papel aluminio
Papel estraza
Lapiz graso
Cloro
Mertiolato
Yodo
Hipoclorito
Pinol
Benzal

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Procedimiento

1. Barrer el hisopo estéril con el cultivo bacteriano, tanto

Gram positivo como gram negativo respectivamente.

2. Pasar el hisopo sobre la superficie del agar antibiótco en

tres direcciones, rotando la placa en un ángulo de 60°. Repetir
paso con las 4 placas.

3. Volver a colocar la tapa de la caja de Petri y dejar que la

suspensión inoculada se seque durante 5 minutos por lo
menos, pero no más de 30 minutos.

4. Aplicar los discos de antibióticos sobre la superficie

inoculada y presionar suavemente hacia abajo con una pinza
estéril, flameada y enfriada. Los discos se aplican de manera
que no haya una distancia menor de 15 mm entre ellos para
evitar zonas de inhibición por superposición.

5. Incubar las placas por 24 horas a 37°C. Concluido el

periodo de incubación, medir el diámetro de la zona
de inhibición hasta el milímetro completo más
próximo desde la superficie interior de la placa.5.
Incubar las placas por 24 horas a 37°C.

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[ CITATION Jor12 \l 2058 ]

Referencias Bibliográficas
[ CITATION Uni18 \l 2058 ]

[ CITATION Els18 \l 2058 ]

[ CITATION Enr98 \l 2058 ]

[ CITATION Pre1 \l 2058 ]

[ CITATION MIG94 \l 2058 ]

[ CITATION Dan \l 2058 ]

[ CITATION Jor12 \l 2058 ]

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