CUARTA PARTE

ENUMERACION BACTERIANA: EL NUMERO MAS

PROBABLE

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia efeciente de

estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación
cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación
de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por
lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un
atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado
de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones
seriadas y el uso de una tabla probabililística.

Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se puede
determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en
una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una
recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii)
determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e
igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo,
entre otros.

En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad
total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la
capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.
 EL NUMERO MAS PROBABLE 2

Materiales & Equipos:

• Muestras ambientales (lodos activados, ríos, charcas, suelo, etc.)

• Placas Petri con medio de crecimiento (R2A, LB, TSA u otro)
• Tubos de dilución con 9 ml de 0.85% NaCl
• Micropipetas de 20 µl
• Puntas para micropipeta
• Incubadora a 25°C
• Vortex

METODOLOGIA

1. Muestras: Colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10 g) de varios

lugares u obtenga muestras de agua (10 ml) de lagos, ríos o charcas.
2. Extracción de microorganismos viables: Para muestras de suelo, las células podrán
ser removidas y homgenizadas añadiendo 1 g de muestra a un tubo de ensayo que
contenga 9 ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.
3. Diluciones en serie: El extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo
1 ml a un tubo con 9 ml de 0.85% NaCl. Cada transferencia corresponde a una
dilución de 1 en 10. Repita en serie el procedimiento de dilución hasta alcanzar la
dilución 10-7. Para muestras líquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar
las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.
4. Placas Petri: Utilizando un marcador, divida la placa petri en cinco zonas de igual
tamaño. Use una placa por cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución
a ser inculado:

10-3

10-4

10-7

10-5
10-6
 EL NUMERO MAS PROBABLE 3

5. Inoculación: Transfiera 5 µl de la dilución apropiada al área correspondiente. Repita

esta operación cinco veces por cada dilución:

10-3 10-3

10-4 10-4

10-7 10-7

10-5 10-5
10-6 10-6

6. Permita que el incóculo seque sobre el medio de crecimiento. Selle la placa con un
tirillade parafina. Invierta la placa e incube a 25°C por 7 días.
7. Evaluación de crecimiento: Para cada dilución en asendencia evalue el crecimiento o
no crecimiento sobre cada réplica incoculada. Reporte los resultados como se indican
en el ejemplo a continuación:

10-3

10-4

10-7

10-5
10-6

Diluciones 10-3 - 10-4 - 10-5 - 10-6 - 10-7 :: 5 - 5 - 3 - 2 - 0

Datos & Análisis:

Utilizando los valores ofrecidos en la tabla 1, determine la población estimada para su

muestra (ej., 5-5-3-2-0: 1,383). De su patrón de respuestas no estar en la tabla, promedie
el valor estimado del patrón superior e inferior presente en la tabla 1 (ej., 5-4-1-1-0 no
está en la tabla, entonces promedie 5-4-1-0-0 (169) y 5-4-2-0-0 (216) como el resultado
más apropiado: 5-4-1-1-0 = (169+216)/2 = 193). Este valor obtenido es el NMP sin ajustar.
Para calcular la densidad poblacional de la muestra, entonces tendrá que multiplicar el
NMP sin ajustar por el factor de correción de volumen (ver nota Tabla 1) por el recíproco
del factor de dilución menor inoculado en la placa (ej., 5-5-3-2-0: 1,383 X 200 X 1000 =
2.78 x 108 células/g de suelo).
 EL NUMERO MAS PROBABLE 4

Tabla 1. El número más probable para series de diluciones en réplicas

de cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994)*.
Núm. Respuestas Núm. Respuestas
Pos. por Nivel de Población estimada Pos. por Nivel de Poblaciónestimada
Dilución Dilución
1-2-3-4-5-6 1-2-3-4-5-6
1-0-0-0-0-0 1.9 5-5-4-2-0-0 2159
1-1-0-0-0-0 4.0 5-5-4-3-0-0 2716
2-0-0-0-0-0 4.4 5-5-5-0-0-0 2305
2-1-0-0-0-0 6.8 5-5-5-0-1-0 3126
3-0-0-0-0-0 7.7 5-5-5-1-0-0 3282
3-1-0-0-0-0 10 5-5-5-1-1-0 4532
3-2-0-0-0-0 13 5-5-5-2-0-0 4922
4-0-0-0-0-0 12 5-5-5-2-1-0 6918
4-1-0-0-0-0 16 5-5-5-3-0-0 7797
4-2-0-0-0-0 21 5-5-5-3-1-0 10702
4-3-0-0-0-0 27 5-5-5-3-2-0 13826
5-0-0-0-0-0 23 5-5-5-4-0-0 12753
5-0-1-0-0-0 31 5-5-5-4-1-0 16902
5-1-0-0-0-0 33 5-5-5-4-2-0 21589
5-1-1-0-0-0 45 5-5-5-4-3-0 27150
5-2-0-0-0-0 49 5-5-5-5-0-0 23054
5-2-1-0-0-0 69 5-5-5-5-0-1 31225
5-3-0-0-0-0 78 5-5-5-5-1-0 32720
5-3-1-0-0-0 107 5-5-5-5-1-1 45261
5-3-2-0-0-0 138 5-5-5-5-2-0 49224
5-4-0-0-0-0 127 5-5-5-5-2-1 69148
5-4-1-0-0-0 169 5-5-5-5-3-0 78127
5-4-2-0-0-0 216 5-5-5-5-3-1 107022
5-4-3-0-0-0 270 5-5-5-5-3-2 138269
5-5-0-0-0-0 230 5-5-5-5-4-0 127528
5-5-0-1-0-0 312 5-5-5-5-4-1 169028
5-5-1-0-0-0 327 5-5-5-5-4-2 215899
5-5-1-1-0-0 453 5-5-5-5-4-3 271557
5-5-2-0-0-0 488 5-5-5-5-4-4 334051
5-5-2-1-0-0 692 5-5-5-5-5-0 230546
5-5-3-0-0-0 780 5-5-5-5-5-1 328192
5-5-3-1-0-0 1070 5-5-5-5-5-2 492238
5-5-3-2-0-0 1383 5-5-5-5-5-3 781272
5-5-4-0-0-0 1275 5-5-5-5-5-4 1312535
5-5-4-1-0-0 1690
* Esta es la densidad poblacional estimada asumiendo 1 ml de inóculo. Este valor debe ser ajustado
por el factor de dilución y el volumen de inóculo (por ejemplo, si usted inoculó en cada placa un
volumen de 10 µl, entonces el valor de la tabla debe ser correjido multiplicándolo por 100 [10 X 100 =
1,000 µl ó 1 ml]).
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Observaciones:

PREGUNTAS...

1. ¿Qué tiempo de incubación de sería el más apropiado?

2. ¿Cuáles son algunas desventajas del método de NMP?

3. ¿Qué otras aplicaciones tiene este método?

4. Si luego de preparar diluciones en serie de 10-2 hasta 10-6 de una muestra de una
laguna usted obtuvo un patrón de respuestas positivas 5-5-4-3-1, ¿Cuál es la
densidad poblacional en la laguna?

5. ¿Qué tendría usted que hacer si luego de incubar los resultados son 5-5-5-5-5-5?