Universidad del Bío-Bío - Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a la Biología 1 | Microscopio

óptico SESIÓN 1 “El microscopio óptico” I.‐ Introducción: El microscopio es un instrumento óptico
mecánico destinado a examinar objetos muy pequeños, ampliando considerablemente su
imagen. Existen microscopios simples o lupas constituidos por una sola lente convergente y
microscopios compuestos (o simplemente microscopio) formados por tres sistemas de lentes
convergentes: condensador, objetivo y ocular. 1611 Kepler sugirió la manera de construir un
microscopio compuesto 1655 Hooke utilizó un microscopio compuesto para describir unas
pequeñas celdillas en los cortes de corcho a las que denominó "células". 1674 Leeuwenhoek
informó sobre su descubrimiento de protozoos. Nueve años más tarde observó por primera vez
bacterias. 1833 Brown publicó sus observaciones microscópicas de las orquídeas, y describió
claramente el núcleo celular. 1838 Schleiden y Schwann propusieron la teoría celular, afirmando
que la célula nucleada es la unidad estructural y funcional de las plantas y los animales. 1857
Kolliker describió las mitocondrias de las células musculares. 1876 Abbé analizó los efectos de la
difracción en la formación de la imagen en el microscopio y mostró la manera de optimizar el
diseño de los microscopios. 1879 Flemming describió con gran claridad el comportamiento de los
cromosomas durante la mitosis de las células animales 1881 Retzius describió muchos tejidos
animales con una precisión que aún no ha sido superada por ningún especialista en microscopía
óptica. En las dos décadas siguientes, tanto él como Cajal y otros histólogos, diseñaron métodos
de tinción y establecieron las bases de la anatomía microscópica. 1882 Koch utilizó colorantes de
anilina para teñir microorganismos e identificó las bacterias que causan la tuberculosis y el cólera.
En las dos décadas siguientes, otros bacteriólogos, como Klebs y Pasteur, identificaron los agentes
causantes de otras muchas enfermedades examinando al microscopio preparaciones teñidas.
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óptico 1886 Zeiss hizo una serie de lentes, siguiendo las leyes de Abbé, que permitieron a los
especialistas en microscopía la resolución de estructuras situadas en los límites teóricos de la luz
visible. 1898 Golgi observó por primera vez el aparato llamado "de Golgi", impregnando células
con nitrato de plata. 1924 Lacassagne y sus colaboradores desarrollaron la primera técnica
autorradiográfica para localizar el polonio radiactivo en las muestras biológicas. 1930 Lebedeff
diseñó y construyó el primer microscopio de contraste interferencial. En 1932, Zernicke inventó el
microscopio de contraste de fases. Estos dos adelantos permitieron observar por primera vez
células vivas no teñidas en detalle. 1941 Coons utilizó anticuerpos acoplados a colorantes
fluorescentes para detectar antígenos celulares. 1952 Nomarski ideó y patentó el sistema de
contraste interferencial para el microscopio óptico., que aún lleva su nombre. 1981 Allen e Inoué
perfeccionaron la microscopía óptica de contraste video‐ amplificada. Tabla 1: Reseña histórica de
la microscopia óptica (MO) II.‐ Componentes del microscopio de Campo Claro u Óptico Corriente:
Existen dos factores importantes en microscopía y son: MAGNIFICACION y RESOLUCION.
MAGNIFICACION (o aumento) se define como las veces que un objeto se agranda en relación a su
tamaño real. RESOLUCION es una medida de la distancia mínima que existe entre dos puntos
para ser distinguidos como dos puntos separados. Por ejemplo, lo que pareciera ser una estrella
cuando se mira al cielo puede ser en realidad dos estrellas con ayuda de un telescopio. Por lo
tanto, el telescopio tiene mayor capacidad de resolución. Sin embargo, así como el ojo humano es
limitado, el poder de resolución de un microscopio o telescopio también es limitado. Los
microscopios pueden diseñarse para magnificar objetos tanto como sea posible, pero la luz del
microscopio nunca podrá Universidad del Bío-Bío - Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a
la Biología 3 | Microscopio óptico resolver detalles más finos que 0.2 μm, el tamaño de una
pequeña bacteria o de una mitocondria. Esta resolución no se puede mejorar, está limitada por la
LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ VISIBLE usada para iluminar el espécimen. Los microscopios de luz
sólo pueden magnificar objetos efectivamente hasta 1500 veces, más magnificación implicaría que
el objeto se viera borroso. Lo que se ha ido mejorando en microscopía de luz es el CONTRASTE de
aquellos objetos que puedan ser resueltos por el microscopio en uso. La mayoría de las
estructuras subcelulares, u organelos, son muy pequeños para ser resueltos con el microscopio de
luz. La biología celular avanzó rápidamente desde la década del 50 con la introducción del
microscopio electrónico. En vez de usar luz visible, el MICROSCOPIO ELECTRONICO enfoca un haz
de electrones a través del espécimen. Microscopios electrónicos modernos pueden alcanzar una
resolución de aproximadamente 0.2 nanómetros (nm), mil veces mejor que el microscopio de luz.
Los biólogos usan el término ULTRAESTRUCTURA CELULAR para referirse a la anatomía celular
resuelta por un microscopio electrónico. Una foto obtenida con un microscopio de luz a veces se
llama FOTOMICROGRAFIA, y una foto que resulte del microscopio electrónico se llama
MICROGRAFIA ELECTRONICA DE TRANSMISION o de BARRIDO según sea el microscopio
electrónico que se use. Existen dos tipos de microscopio electrónico: el MICROSCOPIO
ELECTRONICO DE TRANSMISION (TEM) y el MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO (SEM). El
TEM dirige un haz de electrones a través de una sección muy delgada del espécimen, similar a lo
que sucede en un microscopio de luz. Sin embargo, en vez de usar lentes de vidrios, los cuales son
opacos a los electrones, el TEM usa electroimanes. Los electroimanes actúan como lentes que
enfocan y magnifican la imagen cambiando la dirección de los electrones cargados. La imagen
últimamente se enfoca en una pantalla para examinarla o en un film fotográfico para tener un
registro permanente. Para aumentar el contraste en la imagen, secciones muy delgadas del
espécimen se tiñen con átomos pesados de metales, los cuales se adhieren a ciertos lugares en las
células. Los biólogos celulares usan el TEM principalmente para estudiar la ultraestructura interna
de las células. El SEM es especialmente útil para el estudio detallado de la superficie del
espécimen. El haz de electrones cubre (o barre) la superficie de la muestra, la cual generalmente
está recubierta con una pequeña lámina de oro. El haz de electrones excita electrones sobre la
superficie de la muestra, y estos electrones secundarios se colectan y se enfocan en una pantalla,
formando una imagen de la topografía del espécimen. Un atributo importante del SEM es su gran
profundidad de penetración, la cual resulta en una imagen tridimensional. Universidad del Bío-Bío
- Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a la Biología 4 | Microscopio óptico El microscopio
electrónico revela muchos organelos, imposible de resolver con el microscopio de luz. Sin
embargo, el microscopio de luz ofrece muchas ventajas, especialmente para el estudio de células
vivas. Una desventaja del microscopio electrónico es que los métodos químicos y físicos usados
para preparar el espécimen no sólo mata células, sino que también introduce artefactos,
estructuras físicas que se ven en la micrografía que no existen en la célula viva. En este laboratorio
usaremos el microscopio compuesto. Las principales partes de un microscopio compuesto son:
Sistema Mecánico a. Pié: es la base de sustentación. b. Columna: región articulada del pié. c.
Platina: plataforma horizontal que sustenta al espécimen o preparación. d. Tubo: lleva en su
extremo superior la lente ocular y en el inferior el objetivo. e. Revólver o tambor: pieza giratoria
que lleva los objetivos. f. Tornillos de focalización: al rotarlos cambian el enfoque del microscopio,
lo cual lo logran variando la distancia entre el objetivo y la platina. Existen dos movimientos,
macrométrico (enfoque aproximado y grueso), micrométrico (enfoque de precisión). Sistema de
iluminación a. Fuente luminosa: puede ser natural o artificial. Si es natural se utiliza un espejo de
cara plana. Si es artificial puede o no haber espejo, si hay espejo se utiliza por el lado cóncavo. b.
Condensador: dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra los rayos luminosos en
el espécimen. Su mayor utilidad la presta cuando se encuentra a una distancia de ~2 cm del
espécimen. Ubique el mejor punto por ensayo y error. c. Diafragma: está ubicado en el
condensador y sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparación. Su diámetro se
puede variar por medio de una placa horizontal que se cierra o abre a voluntad del operador. d.
Anillo porta filtro: generalmente se utiliza un filtro de color verde pues así descansa más la vista.
La longitud de onda modificada con el uso del filtro influye en la resolución del microscopio (ver
“resolución” más adelante). Sistema de amplificación a. Lentes oculares: son sistemas ópticos
ubicados en la parte superior del tubo, próximo al ojo del observador. Los oculares están formados
por dos lentes planas, convexas, simples o compuestas separadas por un diafragma interno. El
lente inferior se llama lente de campo, su propósito no es aumentar la imagen sino recoger la
mayor cantidad de rayos divergentes que vienen del objetivo. Este tiene su foco en el diafragma y
ahí la imagen es Universidad del Bío-Bío - Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a la Biología
5 | Microscopio óptico aumentada por la parte superior. Los oculares más usados tienen un
aumento de 6X, 8X, 10X, 16X, 20X. b. Lentes objetivos: sistemas de lentes acomodadas en el
revólver. En el objetivo está inscrita la magnificación y la apertura numérica. Figura 1: Esquema de
un microscopio óptico (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993) III.‐ Principios físicos implicados en
la función de aumento del objeto en el microscopio óptico. El ojo humano sólo puede resolver
estructuras de aproximadamente 0,1 mm (100 µm). La mayoría de las células son de dimensiones
muchísimo menores, y requieren de todo el poder resolutivo del microscopio óptico para poder
ser estudiadas. El término poder de resolución (PR) expresa la capacidad de un sistema óptico de
discriminar detalles muy finos, de distinguir o resolver dos puntos muy cercanos entre sí. El PR es
inversamente proporcional al límite de resolución (d), que es la menor distancia que debe existir
entre dos puntos para que puedan ser individualizados como unidades separadas. PR = 1 / d
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óptico Si consideramos dos objetos luminosos muy pequeños e igualmente brillantes, cada uno
nos proporciona una imagen, que no es puntual, sino un disco central brillante rodeado de uno o
varios anillos difusos de luz, llamados “discos de Airy”. Si acercamos estos dos puntos, llega un
momento en el cual se sobreponen. El punto exacto de sobreposición depende de varios
factores, entre ellos la agudeza visual del observador. Se ha propuesto que los discos de Airy se
resuelven como unidades separadas cuando la distancia entre los centros es superior al radio del
primer anillo oscuro de difracción. La difracción óptica se debe a la interferencia entre ondas que
han viajado por caminos levemente diferentes, a través de un sistema óptico. Existe una
fórmula, la ecuación de Abbé que expresa matemáticamente la magnitud del efecto de difracción
y establece el límite de resolución de cualquier sistema óptico. Dos puntos se resuelven, si los
centros de los discos de Airy están en una distancia igual o mayor que d. Donde: d = límite de
resolución 0,61 = constante, cuyo valor teórico depende de las condiciones del sistema, Influyendo
coherencia de la luz, criterio de visibilidad y naturaleza del objeto. Delta = longitud de onda. AN =
abertura numérica. n = índice de refracción del medio. sen alfa = semi ángulo de abertura. La
abertura numérica es función del ángulo del cono de luz que emerge del objeto, y que es captado
por la lente objetiva. La AN se define matemáticamente como la resultante de la multiplicación
del seno de la mitad del ángulo de abertura de la lente (alfa) por el índice de refracción del medio
a través del cual pasa la luz (n). AN = n x sen  d = 0,61 x   Universidad del Bío-Bío -
Facultad de Ciencias - Curso de Introducción a la Biología 7 | Microscopio óptico Como el seno de
alfa no puede ser mayor que 1, y el aire tiene un n = 1, se utilizan objetivos de inmersión que
emplean medios de mayor índice de refracción (n =1,5), con el objeto de aumentar la abertura
numérica. La figura 2 se ha dividido en dos mitades. La mitad derecha de muestra que en lentes
de AN baja, los índices de refracción del portaobjetos, cubreobjetos y del aire provocan un desvío
de la luz incidente. Al colocar un medio de mayor índice de refracción, como el aceite de
inmersión, entre el cubreobjeto y la lente frontal, se neutraliza el efecto de la refracción de luz,
obteniéndose una imagen de mayor nitidez. Figura 2: Ángulos de abertura del portaobjeto y de la
lente (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993) Universidad del Bío-Bío - Facultad de Ciencias - Curso
de Introducción a la Biología 8 | Microscopio óptico El límite de resolución es directamente
proporcional a la longitud de onda, e inversamente proporcional a la abertura numérica de la lente
objetiva. Si se desea aumentar el poder de resolución y obtener mayor información, existen dos
cambios: aumentar la apertura numérica o disminuir la longitud de onda. En relación a la primera
posibilidad existen limitaciones, incluso mejorando el diseño de las lentes. Por esta razón el
esfuerzo de los investigadores de principios del siglo XX, se centró en la segunda alternativa. Si
calculamos, aplicando la fórmula de Abbé, vemos que utilizando como fuente luminosa la longitud
de onda de 20,52 um (520 nm) y una AN de 1,5, se alcanza un limita de resolución de 0,2 um (200
nm). Es decir, el microscopio óptico está limitado a resolver sólo partículas mayores que la mitad
de la longitud de onda de la luz visible. Sin embargo, es necesario recordar que ninguna lente es
capaz de formar un punto imagen perfecto de una fuente puntual, debido a las llamadas
“aberraciones de las lentes”. Las principales aberraciones producidas son: aberración esférica,
cromática, astigmatismo, coma, distorsión, curvatura de campo. 1.‐ Aberración esférica: este
defecto se debe a la incapacidad de la lente de concentrar todos los rayos que la atraviesan en un
foco común. Los rayos incidentes más próximos al eje, luego de refractarse, se cortan en un punto
más distante que los rayos periféricos, produciéndose una imagen poco nítida. 2.‐ Aberración
cromática: surge porque los ayos que componen la luz blanca se refractan diferencialmente, de
acuerdo a la longitud de onda. Así, los de menor longitud se refractan más que los de mayor
longitud de onda, dando puntos focales diferentes. 3.‐ Astigmatismo: este defecto se debe a la
imposibilidad práctica de construir lentes perfectamente simétricas. Todas las lentes tienen una
distancia focal en una dirección que es levemente diferente a la distancia focal en otra dirección,
produciendo diferentes focos. 4.‐ Coma: es una aberración que ocurre en imágenes de objetos
localizados lateralmente al eje óptico del lente, produciendo un alargamiento de la imagen. Así, la
imagen de un punto toma el aspecto de una coma. 5.‐ Distorsión: es una aberración que modifica
la forma de las imágenes, ya que las imágenes formadas por los rayos periféricos están en un
plano diferente que las formadas por los rayos axiales. Universidad del Bío-Bío - Facultad de
Ciencias - Curso de Introducción a la Biología 9 | Microscopio óptico 6.‐ Curvatura de campo: se
produce en imágenes de mayor aumento, las cuales tienden a ser curvas, lo que perjudica su
calidad e impide que todo el campo se observe en foco simultáneamente. IV.‐ Formación de la
imagen en el microscopio óptico La lente objetiva forma una imagen real, invertida y aumentada
del objeto. Esta imagen intermedia actúa como objeto para el lente ocular, y se encuentra situada
de manera tal, que la imagen formada por el objetivo cae en la distancia focal (la distancia focal es
la distancia que existe entre el foco principal de la lente y su centro geométrico). De esta forma,
el ocular proporciona una imagen final que es virtual (dada por la proyección de los rayos), de
mayor tamaño e invertida con respecto al objeto. Figura 3: Formación de la imagen en el
microscopio óptico (tomado de Spotorno y Hoecker, 1993). OBJETIVOS a) Distinguir las partes del
microscopio. b) Familiarizarse con el uso del microscopio. Actividades del Alumno: En esta
actividad usted tendrá ocasión de utilizar el microscopio óptico facilitado por el profesor para
observar tres preparados. Usted deberá observar con los aumentos lupa (4x), menor (10x) y mayor
(40x) un preparado que contiene una letra recortada al igual que la segunda preparación de hilos
entrecruzados de colores. Además, para tener la oportunidad de aprender a ocupar el lente
inmersión (100x), usted observará un frotis de bacilos. Universidad del Bío-Bío - Facultad de
Ciencias - Curso de Introducción a la Biología 10 | Microscopio óptico 1.‐ Observación de:
Letra Material : cuadrado de papel de periódico Método : corte directo Tinción : sin
tinción Forma : .................................................. Observaciones: ..…......................................
.......................................................................... ..........................................................................
.......................................................................... ‐ Enfoque la preparación con aumento menor y
ubique una zona en donde se encuentre una letra. ‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe el
preparado ‐ Haga el esquema correspondiente en el círculo adjunto de lo observado en aumento
mediano Pregunta: 1.‐ Si la muestra se mueve con el carro hacia adelante, hacia donde se mueve
la imagen?¿y si se mueve de izquierda a derecha?. Señale las propiedades de la imagen a la que
corresponde este fenómeno
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
........................................................................................................................................... Universidad
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2.‐ Observación de: hilos entrecruzados de colores Material : hilo de cocer con color Método :
pegado directo Tinción : textil Forma : .................................................. Observaciones:
..…...................................... ..........................................................................
.......................................................................... ..........................................................................
‐ Enfoque la preparación con aumento menor y ubique una zona en donde los hilos estén
sobrepuestos. ‐ Pase a aumento mediano, mayor y observe que es lo que va pasando con la
imagen que se forma, en cuanto si puede ver texturas, tamaños, otros hilos, etc. ‐ Haga el
esquema correspondiente en el círculo adjunto de lo observado en aumento mediano Pregunta:
1.‐ Qué poderes del microscopio aumentan y cuáles disminuyen?. Señale además el ejemplo de lo
observado.
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
..................................................................................................................................................
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Microscopio óptico Bibliografía: - López, M. L. (1993) “Métodos de estudio en Biología Celular” .
En “Elementos de Biología Celular y Genética” Spotorno, A. y Hoecker, G. (Eds.) Departamento
de Biología Celular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. - Alberts, B.; Bray, D.;
Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K and Watson, J. “Molecular Biology of the Cell” Garland Publishing,
Inc. New York & London. 139‐149 pp