HERRAMIENTA DE CLASIFICACIÓN APLICADA A IMÁGENES DE CÉLULAS DE

PURKINJE

Rubén Medina
Francisco Durán
rmedina@ula.ve
fduran@ula.ve
Grupo de Investigación de Ingeniería Biomédica (GIBULA), Universidad de Los Andes. Mérida-
Venezuela
Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”. Universidad de Los Andes.
Mérida-Venezuela
Miguel Vera
Alirio Balza
veramig@gmail.com
alibal@ula.ve
Grupo de Investigación de Ingeniería Biomédica (GIBULA), Universidad de Los Andes. Mérida-
Venezuela
Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”. Universidad de Los Andes.
Mérida-Venezuela.

Resumen. En este trabajo se propone cuantificar espinas dendríticas en imágenes obtenidas por
microscopía de luz, de células de Purkinje (CP) de la corteza cerebelosa de ratón. El conteo de
espinas en CP es un problema de gran interés para el Centro de Microscopia Electrónica
“Ernesto Palacios Prü”, por la diversidad de enfermedades que pueden afectar tanto la
estructura como la funcionalidad del cerebelo. El número de espinas y el crecimiento dendrítico
son variables dinámicas, que expresan la plasticidad del sistema nervioso y van modificándose
durante el proceso de desarrollo y maduración de los vertebrados. De allí la importancia de
conocer los patrones normales propios de cada una de las etapas de desarrollo, para poder
determinar cualquier alteración que en la práctica se traduce en manifestaciones clínicas y
patológicas. En los estudios que se realizan en el referido centro es importante disponer de la
información relativa al número de espinas dendríticas en CP ya que dicha información permite
expresar las condiciones funcionales del cerebelo y, por tanto, del individuo.
El objetivo de esta investigación fue crear una herramienta de clasificación para cuantificar
las espinas dendríticas en CP, basada en máquinas de soporte vectorial de mínimos cuadrados.
Las imágenes fueron pre-procesadas con el algoritmo de deconvolución de Lucy-Richardson y
realce logarítmico. Los resultados obtenidos sugieren que la técnica estudiada podría ser una
importante herramienta de clasificación para este tipo de imágenes al lograr detectar mayor
cantidad de espinas de manera automática que las obtenidas por el método manual identificadas
por un experto.

Palabras claves: Células de Purkinje, Máquinas de Vector Soporte de Mínimos Cuadrados,

Deconvolución.

1. Introducción

Las Células de Purkinje (CP) constan de un árbol dendrítico que posee ramificaciones en las
cuales se ubican unas estructuras denominadas espinas [1],[2]. Las espinas dendríticas son
importantes puesto que su aspecto morfológico, su número y su distribución espacial representan
la expresión anatómica del funcionamiento del cerebelo. En el Centro de Microscopia Electrónica
“Ernesto Palacios Pru”, se sigue un procedimiento manual para el conteo de espinas dendríticas
de CP. El conteo de espinas dendríticas permite estudiar los efectos de sustancias nocivas en los
individuos, midiendo el grado en que se afecta la estructura del árbol dendrítico. Las imágenes
obtenidas por microscopía de luz, en las que están presentes las CP, son obtenidas a diferentes
planos focales. Esto origina una borrosidad debido al proceso de degradación causado por
aberraciones ópticas que son factibles de ser eliminadas al utilizar técnicas de restauración y
realce [3],[4], lo cual permite visualizar las espinas presentes en las CP. A continuación se
presentan algunos estudios donde se utilizaron herramientas de clasificación.
Vera y colaboradores [5], desarrollaron una técnica para la detección automática del corazón
en imágenes de Tomografía Multi-corte. La técnica consta de dos etapas. En la primera se detectó
un conjunto de marcadores anatómicos sobre el borde del corazón empleando una máquina de
soporte vectorial de mínimos cuadrados (LSSVM). Durante el proceso de detección de los
marcadores se obtuvo un 95,84% de sensibilidad. Los marcadores detectados fueron ubicados
según sus coordenadas sobre la imagen. Durante la segunda etapa, se generó una superficie 3-D
para representar el corazón.
Huang y colaboradores [6], presentaron un método para la clasificación del carcinoma
prostático en imágenes patológicas según el sistema de clasificación de Gleason, el cual se usa
en la clasificación histológica de los tejidos finos de próstata. Los autores proponen dos métodos
de extracción de características basadas en la dimensión fractal para analizar las variaciones de la
intensidad y la complejidad de la textura en las regiones de interés. Cada imagen se puede
clasificar utilizando técnicas bayesianas, redes neuronales y máquinas soporte vectorial. Los
resultados experimentales, sobre 205 imágenes patológicas de la próstata, demuestran que se
obtuvo el 94,6%, 94,2%, y 94,6% en Tasas Correctas de Clasificación, respectivamente.
Por otra parte, en el presente trabajo, las LSSVM, permitieron clasificar y cuantificar el
número de espinas dendríticas.

2. Materiales y Métodos

2.1. Imágenes Sintéticas

Se diseña una imagen asignándole un nivel de gris de valor 128 al fondo de la imagen, y un
conjunto de caracteres con niveles de gris diferentes (A=150, C=190, G=90, I=50, K=10) que son
considerados Marcadores. Igualmente se incluye un conjunto de caracteres (J=30, H=70, F=110,
B=170, D=210) que son considerados No Marcadores, como se muestra en la Figura 1. A partir
de esta imagen se generaron 25 imágenes, agregándole ruido de tipo Gausiano con varianza
0,0001 e incrementándola para cada nueva imagen en 0,0001. De las imágenes sintéticas se
generaron dos grupos uno para entrenamiento y otro para validación de la LSSVM.

Figura 1. (a) Imagen sin ruido, la LSSVM seleccionó los Marcadores en el test de entrenamiento
(b) Imagen con ruido donde la LSSVM seleccionó los Marcadores, test de validación (imagen 8,
SNR=23,74 dB)

2.2. Imágenes de CP

La base de datos de CP está constituida por 25 imágenes con una resolución espacial de
256x256 píxeles y una profundidad de intensidad de 8 bits. La técnica utilizada para pre-procesar
las imágenes de CP fue la deconvolución [7] y realce logarítmico [8], la técnica fue
implementada para realzar las espinas en las ramas de la CP.

2.3. Máquinas de Soporte Vectorial de Mínimos Cuadrados

Con el propósito de realizar la detección automática de las espinas se construyó un

clasificador basado en máquinas de soporte vectorial de mínimos cuadrados (LSSVM) con kernel
Gausiano de base radial, utilizando un toolbox en MatLab [9]. Debido a la capacidad de
generalización que poseen las LSSVM el clasificador solo utilizó los niveles de gris de las
espinas dendríticas de CP. La base de datos de imágenes de CP fue dividida en dos grupos:
entrenamiento y validación.

2.3.1. Selección de Marcadores

Los Marcadores fueron seleccionados por un experto, mediante vecindades circulares de 10

pixeles de radio, contentivos de los niveles de gris de las estructuras que representan espinas
dendríticas ver Figura 2a. Posteriormente, los Marcadores fueron eliminados de las imágenes
(Figura 2b) de CP para poder extraer los No Marcadores.

2.3.2. Selección de No Marcadores

Los No Marcadores se buscan en forma aleatoria en aquellas regiones donde no existen

Marcadores (regiones no marcadas en negro en la Figura 2b), utilizando un conjunto de
vecindades circulares de radio 10 píxeles.
 Figura 2. Imagen de CP (a) selección de Marcadores por experto (b) selección de No
Marcadores

2.3.3. Entrenamiento de la LSSVM

Para el entrenamiento de las LSSVM, los Marcadores y los No Marcadores son representados
por vectores normalizados los cuales fueron configurados usando una relación de 1:15, es decir,
por cada Marcador se utilizan 15 No Marcadores. Seguidamente, se asignó a los vectores
Marcadores la etiqueta -1 y a los vectores No Marcadores la etiqueta +1.

2.3.4. Prueba de Desempeño

Consistió en determinar la capacidad de la LSVM para clasificar correctamente los elementos

en el test de validación. Esta capacidad fue cuantificada mediante los índices: sensibilidad y
especificidad para diferentes valores de señal a ruido. La formulación matemática de dichos
índices se presenta en [10]

3. Resultados

3.1. Imágenes Sintéticas

La Figura 3, muestra la curva ROC (Receiving Operating Characteristic) la cual indica que el
mejor par Sensibilidad-Especificidad tiene una probabilidad de 0,71 de poder diferenciar un
Marcador de un No Marcador.

Figura 3. Grafica de ROC, con área bajo la curva de 0,71

3.2. Imágenes de CP

Antes de aplicar las LSSVM a las imágenes de CP en el grupo de validación, se realizó un

conteo del número de espinas de forma independiente por tres expertos. Los resultados son
mostrados en la Tabla 1. Se aprecia que el conteo manual y automático de las espinas no
coinciden esto podría ser debido a que la máquina trabaja con niveles de gris y las espinas
dendrítica tienen niveles de gris parecidos a los no marcadores, permitiendo que la LSSVM los
clasifique erróneamente o bien podría ser que se trate de espinas dendríticas que no fueron
identificadas por el experto debido a que el conteo del experto es subjetivo y está sujeto a errores.
También se puede observar que el error promedio entre la detección por parte de los expertos y
la detección automática es de 15,30%.

Tabla 1.Imágenes de CP, para la validación de la LSVM

Imagen Experto Experto Experto Promedio
Automático Error
Nº 1 2 3 expertos
1 20,00 25,00 35,00 26,67 20,00 6,67
2 27,00 30,00 44,00 33,67 22,00 11,67
3 30,00 39,00 83,00 50,67 26,00 24,67
4 43,00 50,00 93,00 62,00 27,00 35,00
5 39,00 30,00 117,00 62,00 70,00 8,00
6 34,00 35,00 133,00 67,33 65,00 2,33
7 39,00 57,00 102,00 66,00 70,00 4,00
8 43,00 50,00 121,00 71,33 98,00 26,67
9 31,00 35,00 116,00 60,67 70,00 9,33
10 51,00 45,00 124,00 73,33 98,00 24,67
Promedio 15,30
Desv Est 11,38
Min 2,33
Max 35,00

La Tabla 2 presenta los resultados de la prueba de desempeño en imágenes de CP del grupo de

validación. La columna VP indica el número de espinas dendríticas marcadas por el experto que
fueron detectadas por la máquina. La columna FN indica el número de espinas dendríticas
marcadas por el experto que no fueron detectadas por la máquina. Un análisis de esta
información permite afirmar que la LSSVM tiene una probabilidad correspondiente a 0.79 de
detectar espinas dendríticas a medida que se utilizan nuevas imágenes.

Tabla 2. Resultados de la prueba de desempeño en imágenes de CP del grupo de validación

Imagen Nº VP FN Sensibilidad
10 10 0,50
2 16 11 0,59
3 24 6 0,80
4 25 18 0,58
5 27 12 0,69
6 23 11 0,68
7 31 8 0,79
8 35 8 0,81
9 27 4 0,87
10 41 10 0,80
Promedio 79%
4. Conclusiones

Los resultados obtenidos sugieren que la técnica estudiada podría ser una importante
herramienta de clasificación para este tipo de imágenes adquiridas por microscopia. La LSSVM
pudo detectar mayor cantidad de espinas que las identificadas por el experto que realizó el conteo
manualmente. Según los expertos la mayor cantidad de espinas dendríticas detectadas en el
conteo automático por la LSSVM podrían ser efectivamente espinas dendríticas de la CP.
Se tiene previsto aplicar técnicas de minería de datos para extraer atributos de las imágenes y
así poder minimizar los tiempos de cómputo en las técnicas de clasificación.
Se propone aplicar otras técnicas de clasificación como redes neuronales, clasificadores
bayesianos, que permitan comparar los resultados obtenidos.

5. Referencias

[1]. Palacios E., Mendoza R., Colasante C., Morphological changes in neuromuscular junctions
during exercise. J Neurosci Res. 9(4):371-80.1983.
[2]. Palay S., Chan V., Cerebellar Cortex. Springer-Verlag. Berlin.Heidelberg. New York. 1994.
[3]. Duran F., Medina R., Vera M., Mendoza R., Peña Z., Dávila D., Balza J., Mora N.
Preprocesamiento de células de Purkinje utilizando el algoritmo de deconvolución de
Lucy-Richarson. LX convención anual de AsoVAC. Ciudad Bolívar. 2010.
[4]. Durán F., Medina R., Mendoza L., Mendoza R., Peña Z., Davila D., Utilización de filtros de
mediana y transformada wavelet en el análisis digital de imágenes neuronales. Memorias del
X Congreso Internacional de Métodos Numéricos en Ingeniería y Ciencias Aplicadas
(CIMENICS 2010), Mérida, Venezuela, Marzo. pp PS25-PS29. 2010.
[5]. Vera M., Medina R., Bravo A., Detección del corazón utilizando máquinas de soporte
vectorial de mínimos cuadrados. Memorias del X Congreso Internacional de Métodos
Numéricos en Ingeniería y Ciencias Aplicadas (CIMENICS 2010), Mérida, Venezuela,
Marzo, 2010.
[6]. Huang W., Lee C., Automatic Classification for Pathological Prostate Images Based on
Fractal Analysis. Medical Imaging, IEEE Transactions on In Medical Imaging, 28(7). 1037-
1050. 2009.
[7]. Poindexter B., Wounds J., Immunofluorescence Deconvolution Microscopy and Image
Reconstruction of Human Defensins in Normal and Burned Skin. 2005; 4: e7. Published
online 2005 April 25. PMCID: PMC1501114.
[8]. González, R. C., Woods R. E., Eddins S. L. Digital Image Processing Using MATLAB
(DIPUM) . Gatesmark Publishing. pp 827, 2009.
[9]. Suykens A.K., Gestel T.V., Brabanter J., Moor B., J., Vandewalle, Least Squares Support
Vector Machines, World Scientific, Singapore, 2002.
[10]. Lee W. Probabilistic analysis of global performances of diagnostic tests: interpreting the
Lorenz Curve-based summary measures. Stat Med, 18: 455-71. 1999.